Name: manipulation of gene function in mexican cavefish
Uploaded: 2019-04-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish at JoVE.com

Gli autori ringraziano Sunishka Thakur per la sua assistenza in genotipizzazione e imaging il pesce mutante oca2 rappresentato nella Figura 2. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation (NSF) award 1656574 a A.C.K, NSF award 1754321 J.K. e A.C.K e premio National Institutes of Health (NIH) R21NS105071 a A.C.K ed E.R.D.

1. Morpholino oligo design
Nota: Sequenze per a. mexicanus sono disponibili attraverso National Center di Biotechnology Information (NCBI) Gene e NCBI SRA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov), nonché dal browser genoma Ensembl (https://www.ensembl.org). Quando si progetta un morpholino per l'uso in entrambe le forme caverna-dimora e di superficie, è fondamentale per identificare qualsiasi variazione genetica tra il morphing in questa fase, quindi queste regioni genetiche possono essere evit...

Qui, abbiamo fornito una metodologia per la manipolazione di funzione del gene usando morpholinos, CRISPR/Cas9 gene editing e metodologia di transgenesi. La ricchezza della tecnologia genetica e l'ottimizzazione di questi sistemi in zebrafish consentirà probabilmente per il trasferimento di questi strumenti a. mexicanus con facilità52. Recenti scoperte hanno utilizzato questi approcci in a. mexicanus, ma rimangono sottoutilizzate nell'indagine su diversi tratti morfologici, del...

Da allora di Origine delle speciedi Darwin1, gli scienziati hanno acquisito profonde intuizioni come tratti sono modellati evolutivamente in risposta a pressioni ambientali ed ecologiche definite, grazie alla grotta organismi2. Il tetra messicano, a. mexicanus, consiste di eyed popolazioni 'superficie' ancestrale che popolano fiumi tutto il Messico e il Texas del sud e di almeno 29 popolazioni geograficamente isolate di morph grotta derivata che abitano la Sierra del Abra e altre zone del Messico nord-orientale3. Un numero di tratti di grotta-collegati è stato identificato in a. mexicanus, compreso consumo di ossigeno alterata, depigmentazione, perdita degli occhi e alterata alimentazione e foraggiamento comportamento4,5,6, 7,8,9. A. mexicanus presenta un potente modello per studiare i meccanismi di evoluzione convergente a causa di una ben definita storia evolutiva, una dettagliata caratterizzazione dell'ambiente ecologico e la presenza di indipendentemente evoluto grotta popolazioni10,11. Molti dei tratti grotta-derivati che sono presenti nella caverna, compresa la perdita dell'occhio, perdita di sonno, alimentazione, perdita di scolarizzazione è aumentato, ridotto di aggressione e ridotto le risposte allo stress, più volte si sono evoluti attraverso origini indipendenti, spesso utilizzando diverse vie genetiche tra grotte8,12,13,14,15. Questo ripetuto evolution è un aspetto potente del sistema a. mexicanus e può fornire spaccato la questione più generale dei sistemi genetici come può essere perturbato per generare fenotipi simili.
Mentre l'applicazione della tecnologia genetica per l'indagine meccanicistica della funzione del gene è stato limitato in molte specie di pesci (tra cui a. mexicanus), gli avanzamenti recenti in zebrafish forniscono una base per lo sviluppo della tecnologia genetica nei pesci 16,17,18,19,20. Numerosi strumenti sono ampiamente utilizzati in zebrafish per manipolare l'espressione genica e l'attuazione di queste procedure a lungo sono stati standardizzati. Ad esempio, l'iniezione di morpholino oligos (MOs) a livello di singola cellula selettivamente blocca RNA e impedisce la traduzione per una breve finestra temporale durante sviluppo21,22. Inoltre, modifica del gene approcci, come cluster regolarmente intervallate brevi ripetizioni palindromi (CRISPR) / CRISPR-collegato della proteina 9 (Cas9) e nucleasi di trascrizione attivatore-come effettore (TALEN), consentire per la generazione delle omissioni definite o, in alcuni casi, gli inserimenti attraverso una ricombinazione in genomi19,20,23,24. Transgenesi sono utilizzata per modificare l'espressione genica stabile o funzione in un modo specifico di cellula-tipo. Il sistema Tol2 viene utilizzato efficacemente per generare animali transgenici di pre transposase mRNA con un plasmide DNA Tol2 contenente un transgene25,26. Il sistema Tol2 utilizza la transposase Tol2 di medaka per generare gli inserimenti di germline stabile di transgenici construct17. Generazione di Tol2 transgenetica coinvolge pre un plasmide contenente un transgene affiancato da siti di integrazione Tol2 e mRNA per Tol2 transposase17. Questo sistema è stato utilizzato per generare una matrice di linee transgeniche in zebrafish e il suo utilizzo ha recentemente ampliato ai sistemi modello emergente addizionali, tra cui ciclidi, killifish, spinarello e, più recentemente, la caverna messicano27, 28,29,30.
Mentre la caverna è un affascinante sistema biologico per meccanismi di comprensione dell'evoluzione del tratto, sua piena capacità come un modello evolutivo non è stata pienamente sfruttata. Ciò è parzialmente dovuto un'incapacità di manipolazione genetica e cellulare direttamente funzionare31. Geni candidati tratti complessi di regolazione sono stati identificati usando quantitative trait loci (QTL) gli studi, ma la convalida di questi geni candidati è stato difficile32,33,34. Recentemente, transitoria atterramento utilizzando morpholinos, gene editing utilizzando sistemi CRISPR e TALEN e l'uso di Tol2-transgenesi mediate sono stati usati per studiare le basi genetiche alla base di un numero di tratti35,36,37 ,38. L'implementazione e la standardizzazione di queste tecniche vi permetterà per le manipolazioni che interrogano le basi molecolari e neurali di tratti biologici, tra cui la manipolazione della funzione genica, l'etichettatura delle popolazioni di cellule definito, e l'espressione dei reporter funzionale. Considerando che l'efficace attuazione di questi strumenti genetici per manipolare gene o funzione cellulare è stata dimostrata in sistemi modello emergente, protocolli dettagliati sono ancora carenti in a. mexicanus.
A. mexicanus forniscono approfondimenti critici i meccanismi dell'evoluzione in risposta ai cambiamenti ambientali e presentare l'opportunità di identificare nuovi geni che regolano diversi tratti. Una serie di fattori suggeriscono che a. mexicanus è un modello estremamente trattabile per l'applicazione degli strumenti genomici stabiliti attualmente disponibile in modelli genetici consolidati, tra cui la possibilità di mantenere facilmente il pesce nei laboratori di grandi dimensioni di covata, trasparenza, un genoma sequenziato e analisi comportamentali definiti39. Qui, descriviamo una metodologia per l'uso di morpholinos, transgenesi e gene editing in superficie e Grotta di popolazioni di a. mexicanus. La più ampia applicazione di questi strumenti in a. mexicanus consentirà un'indagine meccanicistica di processi molecolari che sono alla base dell'evoluzione delle differenze inerenti allo sviluppo, fisiologiche e comportamentali tra caverna e pesci di superficie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1025px;" width="1025">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fish breeding &#38; egg supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fine mesh fish net</td>
			<td style="width:196px;">Penn Plax</td>
			<td style="width:191px;">BN4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fish tank heater</td>
			<td style="width:196px;">Aqueon</td>
			<td style="width:191px;">100106108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Egg traps</td>
			<td style="width:196px;">Custom made</td>
			<td style="width:191px;">NA</td>
			<td>Design and create plastic grate to place at bottom of tank to protect eggs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass pipettes</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette bulbs</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">03-448-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Egg molds</td>
			<td style="width:196px;">Adaptive Science Tools</td>
			<td style="width:191px;">TU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Morpholino supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Control Morpholino</td>
			<td style="width:196px;">Gene Tools, LLC</td>
			<td style="width:191px;">Standard control olio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Custom Morpholino</td>
			<td style="width:196px;">Gene Tools, LLC</td>
			<td style="width:191px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenol Red</td>
			<td style="width:196px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">P0290-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CRISPR supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cas9 Plasmid</td>
			<td style="width:196px;">AddGene</td>
			<td style="width:191px;">46757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GoTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:196px;">Promega</td>
			<td style="width:191px;">M3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KOD Hot Start Taq</td>
			<td style="width:196px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:191px;">71-842-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Primers</td>
			<td style="width:196px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:191px;">Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T7 Megascript Kit</td>
			<td style="width:196px;">Ambion/Thermofisher</td>
			<td style="width:191px;">AM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">miRNeasy Kit</td>
			<td style="width:196px;">Qiagen</td>
			<td style="width:191px;">217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mMessage mMachine T3 kit</td>
			<td style="width:196px;">Ambion/Thermofisher</td>
			<td style="width:191px;">AM1348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MinElute Kit</td>
			<td style="width:196px;">Qiagen</td>
			<td style="width:191px;">28204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tol2 transgenesis supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pCS-zT2TP plasmid</td>
			<td style="width:196px;">Kawakami et al., 2004</td>
			<td style="width:191px;">Request from senior author</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CutSmart Buffer</td>
			<td style="width:196px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:191px;">B7204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NotI-HF Restriction Enzyme</td>
			<td style="width:196px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:191px;">R3189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PCR purification Kit</td>
			<td style="width:196px;">Qiagen</td>
			<td style="width:191px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SP6 mMessenger Kit</td>
			<td style="width:196px;">Ambion/Thermofisher</td>
			<td style="width:191px;">AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microinjection supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass Capillary Tubes</td>
			<td style="width:196px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:191px;">BF100-58-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette puller</td>
			<td style="width:196px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:191px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Picoinjector</td>
			<td style="width:196px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:191px;">PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:196px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:191px;">M3301R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micromanipulator Stand</td>
			<td style="width:196px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:191px;">M10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micmanipulator Base</td>
			<td style="width:196px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:191px;">Steel Plate Base, 10 lbs</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manipulation of gene function in mexican cavefish

Grotta di animali forniscono un sistema convincente per indagare i meccanismi evolutivi e le basi genetiche alla base di cambiamenti in numerosi tratti complessi, tra cui la degenerazione degli occhi, albinismo, perdita di sonno, iperfagia ed elaborazione sensoriale. Specie di caverna da tutto il mondo visualizzare un'evoluzione convergente dei tratti morfologici e comportamentali a causa di pressioni ambientali condivisi tra sistemi differenti della caverna. Grotta diverse specie sono state studiate nell'impostazione del laboratorio. Il tetra messicano, Astyanax mexicanus, con forme di ipovedenti e non vedenti, ha fornito le comprensioni uniche nei processi biologici e molecolari che sono alla base dell'evoluzione dei tratti complessi ed è ben studiato come sistema modello emergenti. Mentre in a. mexicanus, sono stati identificati geni che regolano l'evoluzione di diversi processi biologici, la possibilità di convalidare un ruolo per singoli geni è stata limitata. L'applicazione della transgenesi e modifica del gene tecnologia ha il potenziale per superare questo ostacolo significativo e per studiare i meccanismi alla base dell'evoluzione dei tratti complessi. Qui, descriviamo una metodologia diversa per la manipolazione di espressione genica in a. mexicanus. Approcci includono l'uso di morpholinos, Tol2 transgenesi, e modelli di sistemi gene-editing, comunemente utilizzati in zebrafish e altri pesci di funzione del gene in a. mexicanusdi manipolare. Questi protocolli includono le descrizioni dettagliate delle procedure di allevamento temporizzata, la raccolta di uova fecondate, iniezioni e la selezione di animali geneticamente modificati. Questi approcci metodologici permetterà per l'indagine dei meccanismi genetici e neurali che l'evoluzione dei diversi tratti in a. mexicanus.

Popolazioni più della caverna-dimora a. mexicanus mostrano ridotta sonno e veglia/attività aumentata rispetto al loro conspecifici di superficie-abitazione14. Ipocretina/orexina (HCRT) è un neuropeptide altamente conservato, che agisce per aumentare lo stato di Veglia, e aberrazioni nella via HCRT causano narcolessia in esseri umani ed altri mammiferi47,48. Precedentemente abbiamo dimostrato quella grotta a. mexicanus ...

Watch this Scientific Journal Video about Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish at JoVE.com

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Descriviamo gli approcci per la manipolazione dei geni nel sistema modello evolutivo Astyanax mexicanus. Sono descritti tre diverse tecniche: transgenesi Tol2-mediata, mirata manipolazione del genoma utilizzando CRISPR/Cas9 e atterramento di espressione utilizzando morpholinos. Questi strumenti dovrebbero facilitare l'indagine diretta di geni alla base della variazione tra forme di superficie e caverne.

Manipolazione di funzione del Gene in caverna messicano

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Gli animali delle caverne forniscono un sistema convincente per indagare diversi tratti morfologici, dello sviluppo e comportamentali. Ma uno dei fattori limitanti nella creazione di questo sistema modello è la mancanza di strumenti genetici che ci permetterebbero di manipolare la funzione genica. Qui dimostriamo tre diversi approcci per manipolare la funzione genica nel pesce delle caverne messicano, Astyanax mexicanus.Questi strumenti consentiranno lo studio dei geni alla base delle variazioni naturali tra pesci di superficie e pesci delle caverne e del modo in cui si relazionano con i fenotipi. Bethany Stahl, un postdoc di talento nel mio laboratorio dimostrerà questa procedura. Prima di iniziare la procedura, riempire una piastra di Petri da 100 millilitri con un caldo 3%agarosio sciolto nell'acqua del sistema di pesce e posizionare con cura uno stampo a iniezione di uova nell'agarosio con un angolo di 45 gradi, prima di abbassare lentamente lo stampo nell'agarosio per evitare di intrappolare l'aria sotto lo stampo.Quando l'agarosio si è solidificato, rimuovere con cura lo stampo, quindi conservare la piastra a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana. Quindi estrarre gli aghi dai capillari di vetro borosilicato e un estrattore di aghi per elettrodi secondo le linee guida del produttore. Il giorno dell'iniezione, utilizzare una pipetta di vetro per trasferire le uova a singola cella nella piastra di iniezione, riempiendo fino a cinque file della piastra di iniezione con da 30 a 40 uova per fila.Mantenere le uova idratate con una piccola quantità di acqua del sistema ittico. Scongelare Morpholino sul ghiaccio e preparare la soluzione di iniezione in modo che 400 picogrammi di Morpholino vengono iniettati per uovo utilizzando una lunga punta di pipetta Microloader o aggiungendo un bolo da due a quattro microliter alla fine. Una volta caricati tutti gli aghi, utilizzare le pinie per tagliare la lunghezza in eccesso dalle punte dell'ago di iniezione e montare il primo ago in un micromanipolatore collegato a un microiniettore picoliter.Quindi, posizionare la piastra di iniezione al microscopio di sezionamento e utilizzare il micromanipolatore per penetrare ogni uovo con l'ago prima di iniettare un nanolitro di soluzione di iniezione di Morpholino direttamente nel tuorlo. Per l'iniezione CRISPR, mescolare 25 picogrammi di RNA guida con 300 picogrammi di RNA messaggero proteina 9 associata alla CRISPR e iniettare due nanolitri della soluzione di RNA risultante in ogni embrione come dimostrato. Per l'iniezione di plasmide affiancata Tol2 transposasi e Tol2, combinare 25 nanogrammi per microlitro di RNA messaggero Tol2 con 25 nanogrammi per microlitro di costrutto plasmide Tol2 e rosso fenolo in acqua priva di RNasi.Quindi iniettare un nanolitro di soluzione in ogni embrione come appena dimostrato. Per osservare gli animali iniettati da Morpholino a quattro giorni dopo l'iniezione, a seconda del gene di interesse, visualizzare le larve di pesce al microscopio stereo per osservare il fenotipo degli animali iniettati o la registrazione video per misurare il comportamento. Per migliorare le indelie CRISPR, trasferire embrioni iniettati da CRISPR in tubi PCR ed estrarre il DNA secondo protocolli standard di estrazione del DNA per la reazione a catena della polimerasi o l'analisi PCR.Per valutare la mutagenesi, eseguire cinque microlitri del prodotto PCR su un gel di agarosio del 3% a 70 volt per tre ore. Il DNA di tipo selvaggio e non mutagenizzato si tradurrà in una banda distinta, mentre il DNA mutante si tradurrà in una banda striata. Grotta Un messicano iniettato con un controllo Morpholino mostra un'attività locomotoria significativamente maggiore e un sonno ridotto per un periodo di 24 ore, rispetto ai pesci di superficie iniettati con un Morpholino strapazzato.L'iniezione dell'ipocretina orexina Morpholino ha poco effetto sul sonno nei pesci di superficie rispetto ai pesci iniettati dal controllo. Al contrario, il knockdown di ipocretina orexina tramite iniezione di Morpholino ha un effetto significativo sul sonno nei pesci che abitano le caverne, fornendo un legame diretto tra l'espressione dell'ipocretina e la perdita del sonno. La mutagenesi mediata dal CRPSR del gene dell'albinismo OCA2 nei pesci di superficie si traduce in alcuni individui omozigoti per l'allele positivo OCA2 di tipo selvatico, ed è associata alla pigmentazione del porto, mentre gli individui che hanno due copie dell'allele negativo OCA2 mutato crispr sono albini, fornendo un legame diretto tra il gene mutante OCA2 e l'albinismo nei pesci delle caverne.Selezionare F0 positivo per il transgene trasmesso Tol2 per eseguire il back cross al tipo jolly per generare linee F1 stabili. Ciò consente l'imaging di calcio vivo per scoprire le differenze nell'attività neuronale, mediare i cambiamenti comportamentali nell'ambiente delle caverne, gettare le basi per l'espressione di molti transgeni aggiuntivi per caratterizzare e manipolare la funzione genica in A mexicanus. Le cose più importanti da ricordare sono caricare saldamente le uova sul piatto, tagliare correttamente l'ago e ottimizzare la microiniezione.Dopo un knockdown genetico di successo, l'integrazione transgena o l'editing genico mediato da CRISPR, questi pesci possono essere utilizzati per analisi di attività dello sviluppo, comportamentali e cerebrali.

manipulation-of-gene-function-in-mexican-cavefish

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Genetics

Evolution

Evolutionary History

SCIENTISTS IN ACTION

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the replacement of the entire gene with a selectable marker via homologous recombination. During homologous recombination, exchange of DNA takes place between sequences with high similarity. Therefore, linear genomic sequences flanking a target gene can be used to specifically direct a selectable marker to the desired integration site. Blunt ends of the deletion construct activate the cell&#39;s DNA repair systems and thereby promote integration of the construct either via homologous recombination or by non-homologous-end-joining. In organisms with efficient homologous recombination, the rate of successful gene deletion can reach more than 50% making this strategy a valuable gene disruption system. The smut fungus Ustilago maydis is a eukaryotic model microorganism showing such efficient homologous recombination. Out of its about 6,900 genes, many have been functionally characterized with the help of deletion mutants, and repeated failure of gene replacement attempts points at essential function of the gene. Subsequent characterization of the gene function by tagging with fluorescent markers or mutations of predicted domains also relies on DNA exchange via homologous recombination. Here, we present the U. maydis strain generation strategy in detail using the simplest example, the gene deletion.

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

We describe a robust gene replacement strategy to genetically manipulate the smut fungus Ustilago maydis. This protocol explains how to generate deletion mutants to investigate infection phenotypes. It can be extended to modify genes in any desired way, e.g., by adding a sequence encoding a fluorescent protein tag.

La manipolazione genetica del patogeno per le piante<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Per studiare Fungal Biology and Plant Microbo Interazioni

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Ricerca

Genetica

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

Misura parallela di circadiano Clock espressione genica e la secrezione dell&#39;ormone in colture cellulari primarie umane

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

Allevamento e RNA a doppio filamento mediata silenziamento genico nel Hide Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

Una metodologia Standard per esaminare in loco mutagenicità in funzione della mutazione di punto riparazione catalizzata da CRISPR/Cas9 e SsODN in cellule umane

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in which the gene of interest has been disrupted. A gene-disruption DNA construct containing a suitable antibiotic resistance marker gene is useful for the generation of gene-disrupted strains in bacteria. However, conventional construction methods, which require gene cloning steps, involve complex and time-consuming protocols. Here, a relatively facile, rapid, and cost-effective method for targeted gene disruption in Streptococcus mutans is described. The method utilizes a 2-step fusion polymerase chain reaction (PCR) to generate the disruption construct and electroporation for genetic transformation. This method does not require an enzymatic reaction, other than PCR, and additionally offers greater flexibility in terms of the design of the disruption construct. Employment of electroporation facilitates the preparation of competent cells and improves the transformation efficiency. The present method may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

We describe a facile, rapid, and relatively inexpensive method for the generation of gene-disrupted Streptococcus mutans strains; this technique may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Generazione di un Gene-interrotto lo streptococco mutans Strain senza clonaggio genico

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has been associated with both the progression of cancer and the development of drug resistance. Until now, it has not been feasible to easily manipulate the ploidy of a multicellular animal without generating mostly sterile progeny. Presented here is a simple and rapid protocol for generating tetraploid Caenorhabditis elegans animals from any diploid strain. This method allows the user to create a bias in chromosome segregation during meiosis, ultimately increasing ploidy in C. elegans. This strategy relies on the transient reduction of expression of the rec-8 gene to generate diploid gametes. A rec-8 mutant produces diploid gametes that can potentially produce tetraploids upon fertilization. This tractable scheme has been used to generate tetraploid strains carrying mutations and chromosome rearrangements to gain insight into chromosomal dynamics and interactions during pairing and synapsis in meiosis. This method is efficient for generating stable tetraploid strains without genetic markers, can be applied to any diploid strain, and can be used to derive triploid C. elegans. This straightforward method is useful for investigating other fundamental biological questions relevant to genome instability, gene dosage, biological scaling, extracellular signaling, adaptation to stress, development of resistance to drugs, and mechanisms of speciation.

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

This method allows for the generation of tetraploid and triploid Caenorhabditis nematodes from any diploid strain. Polyploid strains generated by this method have been used to study chromosome interactions in meiotic prophase, and this method is useful for examining important basic questions in cell, developmental, evolutionary, and cancer biology.

Manipolazione di Ploidy in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

Usando i Oocytes del Mouse per valutare la funzione del Gene umano durante la meiosi I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and organs. The O9-1 cell line is derived from the endogenous mouse embryonic NCCs and maintains its multipotency. However, under specific culture conditions, O9-1 cells can differentiate into different cell types and be utilized in a wide range of research applications. Recently, with the combination of mouse studies and O9-1 cell studies, we have shown that the Hippo signaling pathway effectors Yap and Taz play important roles in neural crest-derived craniofacial development. Although the culturing process for O9-1 cells is more complicated than that used for other cell lines, the O9-1 cell line is a powerful model for investigating NCCs in vitro. Here, we present a protocol for culturing the O9-1 cell line to maintain its stemness, as well as protocols for differentiating O9-1 cells into different cell types, such as smooth muscle cells and osteoblasts. In addition, protocols are described for performing gene loss-of-function studies in O9-1 cells by using CRISPR-Cas9 deletion and small interfering RNA-mediated knockdown.

O9-1 is a multipotent mouse neural crest cell line. Here we describe detailed step-by-step protocols for culturing O9-1 cells, differentiating O9-1 cells into specific cell types, and genetically manipulating O9-1 cells by using siRNA-mediated knockdown or CRISPR-Cas9 genome editing.

La coltura e la manipolazione di cellule della cresta neurale O9-1

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and ...

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult forms has revealed the genetic basis of some of these differences. Less is known about how the populations differ at post-larval stages (at the onset of feeding). Such studies may provide insight into how cavefish survive through adulthood in their natural environment. Methods for comparing post-larval development in the laboratory require standardized aquaculture and feeding regimes. Here we describe how to raise fish on a diet of nutrient-rich rotifers in non-recirculating water for up to two-weeks post fertilization. We demonstrate how to collect post-larval fish from this nursery system and perform whole-mount immunostaining. Immunostaining is an attractive alternative to transgene expression analysis for investigating development and gene function in A. mexicanus. The nursery method can also be used as a standard protocol for establishing density-matched populations for growth into adults.

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

In this protocol, we demonstrate how to breed Astyanax mexicanus adults, raise the larvae, and perform whole-mount immunohistochemistry on post-larval fish to compare the phenotypes of surface and cave morphotypes.

Alzando la Tetra messicano Astyanax mexicanus per analisi di Post-larval fenotipi e Immunohistochemistry intero-monta

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for reversible and tunable expression control of an endogenous gene of interest in living model systems. The REMOTE-control system employs enhanced lac repression and tet activation systems to achieve down- or upregulation of a target gene within a single biological system. Tight repression can be achieved from repressor binding sites flexibly located far downstream of a transcription start site by inhibiting transcription elongation. Robust upregulation can be attained by enhancing the transcription of an endogenous gene by targeting tet transcriptional activators to the cognate promoter. This reversible and tunable expression control can be applied and withdrawn repeatedly in organisms. The potency and versatility of the system, as demonstrated for endogenous Dnmt1 here, will allow more precise in vivo functional analyses by enabling investigation of gene function at various expression levels and by testing the reversibility of a phenotype.

This protocol outlines the steps needed to generate a model system in which the transcription of an endogenous gene of interest can be conditionally controlled in live animals or cells using enhanced lac repressor and/or tet activator systems.

Applicazione in vivo del sistema di controllo remoto per la manipolazione dell'espressione genica endogena

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...