Name: manipulation of gene function in mexican cavefish
Uploaded: 2019-04-22T13:00:00
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著者は Sunishka Thakur のジェノタイピングおよび図 2にoca2変異体の魚をイメージングで彼女の援助をありがちましょう。この作品は、国立科学財団 (NSF) 賞を受賞 1656574 A.C.K.、j. k.、A.C.K.、NSF 賞 1754321、A.C.K. と E.R.D. に国立衛生研究所 (NIH) 賞 R21NS105071 に支えられ

1. Morpholino オリゴ設計
注: A. メキシコのシーケンス、Ensembl ゲノム ブラウザー (https://www.ensembl.org) からだけでなく、ナショナル センターの生物工学情報 (NCBI) 遺伝子と NCBI SRA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) を通じて利用できます。両方の表面、洞窟住居のフォームで使用できる morpholino を設計するとき、morpholinos のターゲットとしてこれらの遺伝領域を避けることができる?...

ここでは、我々 は morpholinos、編集、CRISPR/Cas9 遺伝子および遺伝子導入方法論を用いた遺伝子機能を操作するための方法論を提供しました。遺伝子技術の富とゼブラフィッシュのこれらのシステムの最適化されます可能性が高い容易52 A. メキシコにこれらのツールの転送できます。最近の知見は、 A. メキシコでこれらのアプローチを使用しているが、彼らはこ?...

ダーウィンの種の起源1、以来科学者は洞窟生物2のおかげで、定義された環境および生態学的な圧力への応答では、形質が進化の過程で形づけられるに深い洞察力を得ています。メキシコのテトラ、 A. メキシコメキシコと南テキサス中の河川に生息する目の祖先 '表面' 集団シエラ ・ デル ・ アブラに生息する派生洞窟モーフの少なくとも 29 の地理的に隔離された集団の構成と北東メキシコ3の他の領域。A. メキシコ、変更された酸素消費量、色素脱失、目の損失餌と採餌行動4,5,6、変更などで識別された洞窟関連形質の数 7,8,9。独立して明確に定義された進化の歴史、生態学的環境の詳細な評価との存在により収斂進化のメカニズムを調査するための強力なモデル進化洞窟A. メキシコプレゼント人口10,11。血脈、目の損失などがある、睡眠の損失、餌、スクーリングの損失の増加、侵略を減少とストレス反応を減少、独立した起源は、しばしば活用を通じて複数回を進化している洞窟の派生形質の多く様々 な遺伝的経路間8,12,13,14,15の洞窟します。これには、 A. メキシコシステムの強力な側面は、どのように遺伝的システムのより一般的な質問への洞察力は似たような表現型を生成するため、提供して進化が繰り返されます。
ゼブラフィッシュにおける最近の進歩が魚の遺伝的技術開発の基礎を提供する遺伝子の機能解明のための遺伝子の技術のアプリケーションは、多くの魚種 ( A. メキシコを含む) に限定されている、しながら16、17、18、19,20。数多くのツールは遺伝子発現を操作するゼブラフィッシュで広く使用されて、これらの手順の実装を標準化されている長い間。たとえば、単細胞段階で morpholino oligos (MOs) の噴射は選択的に RNA をブロックし、開発21,22中簡単な時間窓の変換を防ぐことができます。さらに、遺伝子編集アプローチなど定期的にクラスター化された空間短い回文繰り返し (CRISPR) CRISPR 関連タンパク質 9 (Cas9) と転写活性化因子のようなエフェクター ヌクレアーゼ (TALEN) に定義された削除の生成を可能にします。または、いくつかのケースでは、ゲノム19,20,23,24の再結合を挿入します。遺伝子は、細胞型固有の方法で安定した遺伝子発現または関数の操作に使用されます。メダカ Tol2システムを効果的に coinjecting トランスポサーゼによるトランスジェニック動物を生成する使用 transgene25,26を含んでいるメダカ Tol2 DNA プラスミッドと mRNA。メダカ Tol2システムは、安定した生殖細胞系遺伝子組換え construct17 の挿入を生成するめだかのメダカ Tol2転移を利用しています。メダカ Tol2遺伝子組み換えを生成するには、メダカ Tol2転移17メダカ Tol2統合サイトと mRNA が並ぶ遺伝子を含むプラスミドを coinjecting が含まれます。ゼブラフィッシュにおけるトランスジェニックは行の配列を生成するこのシステムを使用されているし、その使用は最近追加する創発モデル システム、シクリッド、メダカ、トゲウオなどに拡大し、もっと最近のメキシコ毒27、 28,29,30です。
血脈は形質の進化のメカニズム解明のための魅惑的な生物学的システムが、進化モデルとしてその完全な能力が完全に利用されてないです。これは部分的に遺伝子を操作することができないのためにされており、携帯機能直接31。複雑な形質を制御する候補遺伝子群は量的形質遺伝子座 (QTL) の研究を使用して識別されているが、これらの候補者の遺伝子の検証は困難な32、33,34。最近では、morpholinos、遺伝子 CRISPR と TALEN システムとメダカ Tol2の使用を使用して編集を使用して一時的なノックダウン-仲介された遺伝子の遺伝的基盤の特徴35、36、37の数を調査する使用されています。、38。定義された細胞集団の標識遺伝子機能の操作を含む、生物学的特性の分子・神経基盤の調査操作の実装とこれらの技術の標準化可能になると機能的な記者の式です。遺伝子や細胞の機能を操作するこれらの遺伝的ツールの実装を成功させる、創発モデル システムで実証されているに対し、詳細なプロトコルはまだA. メキシコに欠けています。
A. メキシコ環境の変化への応答の進化のメカニズムに重要な洞察力を提供する、多様な特徴を制御する新規遺伝子群を特定する機会を提示します。A. メキシコ研究室、ひな大型の魚を簡単に維持する能力を含む、確立された遺伝的モデルで現在利用可能な確立されたゲノム ツールの適用の非常に扱いやすいモデルである要因の数が提案します。透明性、配列されたゲノムと定義された行動アッセイ39。ここでは、morpholinos、遺伝子導入、遺伝子編集a. メキシコの表面と洞窟の集団での使用のための方法論について述べる。血脈と表層魚群の発達、生理学、行動の違いの進化の基礎となる分子プロセスに制御機構解明のためA. メキシコでこれらのツールの広範なアプリケーションになります。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1025px;" width="1025">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fish breeding &#38; egg supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fine mesh fish net</td>
			<td style="width:196px;">Penn Plax</td>
			<td style="width:191px;">BN4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fish tank heater</td>
			<td style="width:196px;">Aqueon</td>
			<td style="width:191px;">100106108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Egg traps</td>
			<td style="width:196px;">Custom made</td>
			<td style="width:191px;">NA</td>
			<td>Design and create plastic grate to place at bottom of tank to protect eggs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass pipettes</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette bulbs</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">03-448-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Egg molds</td>
			<td style="width:196px;">Adaptive Science Tools</td>
			<td style="width:191px;">TU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Morpholino supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Control Morpholino</td>
			<td style="width:196px;">Gene Tools, LLC</td>
			<td style="width:191px;">Standard control olio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Custom Morpholino</td>
			<td style="width:196px;">Gene Tools, LLC</td>
			<td style="width:191px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenol Red</td>
			<td style="width:196px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">P0290-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CRISPR supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cas9 Plasmid</td>
			<td style="width:196px;">AddGene</td>
			<td style="width:191px;">46757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GoTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:196px;">Promega</td>
			<td style="width:191px;">M3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KOD Hot Start Taq</td>
			<td style="width:196px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:191px;">71-842-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Primers</td>
			<td style="width:196px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:191px;">Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T7 Megascript Kit</td>
			<td style="width:196px;">Ambion/Thermofisher</td>
			<td style="width:191px;">AM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">miRNeasy Kit</td>
			<td style="width:196px;">Qiagen</td>
			<td style="width:191px;">217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mMessage mMachine T3 kit</td>
			<td style="width:196px;">Ambion/Thermofisher</td>
			<td style="width:191px;">AM1348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MinElute Kit</td>
			<td style="width:196px;">Qiagen</td>
			<td style="width:191px;">28204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tol2 transgenesis supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pCS-zT2TP plasmid</td>
			<td style="width:196px;">Kawakami et al., 2004</td>
			<td style="width:191px;">Request from senior author</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CutSmart Buffer</td>
			<td style="width:196px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:191px;">B7204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NotI-HF Restriction Enzyme</td>
			<td style="width:196px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:191px;">R3189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PCR purification Kit</td>
			<td style="width:196px;">Qiagen</td>
			<td style="width:191px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SP6 mMessenger Kit</td>
			<td style="width:196px;">Ambion/Thermofisher</td>
			<td style="width:191px;">AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microinjection supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass Capillary Tubes</td>
			<td style="width:196px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:191px;">BF100-58-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette puller</td>
			<td style="width:196px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:191px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Picoinjector</td>
			<td style="width:196px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:191px;">PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:196px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:191px;">M3301R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micromanipulator Stand</td>
			<td style="width:196px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:191px;">M10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micmanipulator Base</td>
			<td style="width:196px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:191px;">Steel Plate Base, 10 lbs</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manipulation of gene function in mexican cavefish

洞窟動物は進化のメカニズムと遺伝的基盤で目の変性、白子症、睡眠不足、過食、感覚処理など、多数の複雑な特性の変化を調査するため説得力のあるシステムを提供します。世界中から毒の種は洞窟システム間共有の環境圧力のための形態および行動の特性の収斂進化を表示します。多様な種は、実験室の設定で研究されている.晴眼者と視覚障害者のフォームで、メキシコのテトラアステュアナクス メキシコ、複雑な形質の進化の基礎となる生物学的および分子プロセスのユニークな洞察を提供している、新興のモデル システムとしてふさわしい。多様な生物学的過程の進化を制御する候補遺伝子群は、A. メキシコで発見されている、しながら、個々 の遺伝子の役割を検証する機能が制限されています。遺伝子と遺伝子編集技術のアプリケーションには、この大きな障害を克服するために、複雑な形質の進化のメカニズムを調査する可能性があります。ここでは、 A. メキシコにおける遺伝子発現を操作するための別の手法について述べる。メダカ Tol2遺伝子、morpholinos の使用を組み込むし、遺伝子編集システム、頻繁に使用されるゼブラフィッシュと他の魚をモデルに、 A. メキシコで遺伝子の機能を操作します。これらのプロトコルには、タイミングの繁殖手順の詳細な説明、受精卵、注射、および遺伝子改変動物の選択のコレクションが含まれます。A. メキシコの多様な形質の進化の遺伝学的および神経メカニズムの調査のためこれらの方法論的アプローチになります。

洞窟住居a. メキシコの複数の集団は、減少睡眠とその海面にすむ個体14を基準にして覚醒/活動の増加を示しています。オレキシン/ヒポクレチン (HCRT) は覚醒を増加する行為は、非常に節約された神経ペプチドと人間および他哺乳類47,48HCRT 経路の異常引き起こすナルコレプシー。我々 は以前、洞窟を示しているA. メキシ?...

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Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

進化系アステュアナクス メキシコで遺伝子を操作するためのアプローチについて述べる。3 つの方法を示します: メダカ Tol2 を介した遺伝子導入、CRISPR/Cas9、および morpholinos を使用して、式のノックダウンを使用してゲノムの対象となる操作。これらのツールは、表面と洞窟の住居形態の間変化を根底にある遺伝子の直接の調査を促進するべき。

メキシコの血脈遺伝子機能の操作

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

洞窟動物は、多様な形態、発達、行動特性を調査するための説得力のあるシステムを提供します。しかし、このモデルシステムを確立する際の制限要因の1つは、遺伝子機能を操作できる遺伝的ツールの欠如です。ここでは、メキシコの洞窟魚、アスティアナックス・メキシカンスの遺伝子機能を操作するための3つの異なるアプローチを示します。これらのツールは、表面魚と洞窟魚の間の自然なバリエーションの根底にある遺伝子の調査と、それらが型素型とどのように関連しているかを調査することを可能にします。私の研究室の才能あるポスドクであるベサニー・スタールは、この手順をデモンストレーションします。手順を開始する前に、魚のシステムの水に溶解した暖かい3%アガロースで100ミリリットルのペトリ皿を充填し、慎重に45度の角度でアガロースに卵射出型を入れ、金型の下の空気をトラップしないようにアガロースにゆっくりと下げます。アガロースが固まったら、慎重にカビを取り出し、最大1週間、摂氏4度でプレートを保管してください。その後、ボロケイ酸ガラスの毛細血管とメーカーのガイドラインに従って電極針の引き手から針を引っ張ります。注射日には、ガラスピペットを使用して単一細胞の卵を注入プレートに移し、1行あたり30〜40個の卵で最大5列の注入プレートを充填します。少量の魚のシステム水で卵を水分補給してください。氷の上にモルフォリーノを解凍し、長いマイクロローダーピペットチップを使用するか、最後に2〜4マイクロリットルボーラスを追加することによって、卵あたり400ピコグラムのモルフォリノが注入されるように注入液を調製します。すべての針がロードされたら、鉗子を使用して注射針の先端から余分な長さをトリミングし、最初の針をピコリットルマイクロインジェクターに接続されたマイクロマニピュレーターに取り付けます。次に、注射皿を解剖顕微鏡の下に置き、マイクロマニピュレーターを使用して各卵を針で浸透させ、モルフォリーノ注射液のナノリットルを直接黄身に注入します。CRISPR注射の場合、25ピコグラムのガイドRNAとCRISPR関連タンパク質9メッセンジャーRNAの300ピコグラムを混合し、得られたRNA溶液の2ナノリットルを各胚に注入します。Tol2トランスポザーゼとTol2横ばいプラスミド注射の場合、Tol2メッセンジャーRNAのマイクロリットル当たり25ナノグラムを、RNaseフリーウォーターのトル2プラスミドコンストラクトのマイクロリットル当たり25ナノグラムとフェノールレッドを組み合わせます。その後、ちょうど実証したように、各胚に1ナノリットルの溶液を注入します。モルフォリーノ注入動物を注射後4日でスクリーニングするには、目的の遺伝子に応じて、魚の幼虫をステレオ顕微鏡で可視化し、注射された動物の表現型を観察するか、またはビデオ記録に挙動を測定する。CRISPRインデルをスクリーニングするには、CRISPR注入胚をPCRチューブに移し、ポリメラーゼ連鎖反応またはPCR分析のための標準的なDNA抽出プロトコルに従ってDNAを抽出します。突然変異を評価するには、3%アガロースゲルで3%のアガロースゲルでPCR産物の5マイクロリットルを3時間実行します。野生型の非変異体化DNAは異なるバンドをもたらし、変異体DNAはスミアバンドをもたらす。洞窟 コントロールモルフォリーノを注入したメキシカンは、スクランブルモルフォリーノを注入した表面魚と比較して、24時間にわたって有意により多くの運動活動と睡眠の減少を示す。ヒポクレチンオレキシンモルフォリーノの注射は、対照注入魚と比較して表面魚の睡眠にほとんど影響を与えません.対照的に, モルフォリーノ注射によるヒポクレチンオレキシンノックダウンは、洞窟に住む魚の睡眠に大きな影響を与えます, ヒポクレチンオレキシン発現と睡眠喪失との間の直接的なリンクを提供.表面魚中のアルビニズム遺伝子OCA2のCRPSR媒介性変異誘発は、野生型OCA2陽性対立遺伝子の一部の個体にホモ接合をもたらし、また、CRISPR変異OCA2陰性対立遺伝子の2つのコピーを有する個人はアルビノであり、変異OCA2遺伝子とアルビンの間に直接的なリンクを提供する。安定したF1ラインを生成するために、トランスジーンを戻して野生のタイプに戻ってトランスジーンに送信するF0の正を選択します。これにより、生きたカルシウムイメージングが可能になり、神経活動の違いを明らかにし、洞窟環境の行動変化を媒介し、メキシカンスの遺伝子機能を特徴付け、操作するための多くの追加のトランスジーンの発現の基礎を築く。覚えておくべき最も重要なことは、卵をプレートにしっかりと積み込み、針を適切にトリミングし、マイクロインジェクションを最適化することです。遺伝的ノックダウン、トランスジーン統合、またはCRISPR媒介遺伝子編集に成功した後、これらの魚は発達、行動、および脳活動分析に使用することができます。

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SCIENTISTS IN ACTION

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the replacement of the entire gene with a selectable marker via homologous recombination. During homologous recombination, exchange of DNA takes place between sequences with high similarity. Therefore, linear genomic sequences flanking a target gene can be used to specifically direct a selectable marker to the desired integration site. Blunt ends of the deletion construct activate the cell&#39;s DNA repair systems and thereby promote integration of the construct either via homologous recombination or by non-homologous-end-joining. In organisms with efficient homologous recombination, the rate of successful gene deletion can reach more than 50% making this strategy a valuable gene disruption system. The smut fungus Ustilago maydis is a eukaryotic model microorganism showing such efficient homologous recombination. Out of its about 6,900 genes, many have been functionally characterized with the help of deletion mutants, and repeated failure of gene replacement attempts points at essential function of the gene. Subsequent characterization of the gene function by tagging with fluorescent markers or mutations of predicted domains also relies on DNA exchange via homologous recombination. Here, we present the U. maydis strain generation strategy in detail using the simplest example, the gene deletion.

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

We describe a robust gene replacement strategy to genetically manipulate the smut fungus Ustilago maydis. This protocol explains how to generate deletion mutants to investigate infection phenotypes. It can be extended to modify genes in any desired way, e.g., by adding a sequence encoding a fluorescent protein tag.

植物病原体の遺伝子操作<em&gt;ウスチラゴmaydis</em&gt;真菌生物と植物微生物相互作用を研究します

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

遺伝学

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

ヒト初代細胞培養物における概日時計遺伝子発現やホルモン分泌のパラレル測定

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

隠すビートルにノックダウン飼育し、二本鎖RNA媒介遺伝子、<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

点突然変異修復 CRISPR/Cas9 とひと細胞での SsODN によって触媒の機能として敷地内変異原性を調べるための標準方法論

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in which the gene of interest has been disrupted. A gene-disruption DNA construct containing a suitable antibiotic resistance marker gene is useful for the generation of gene-disrupted strains in bacteria. However, conventional construction methods, which require gene cloning steps, involve complex and time-consuming protocols. Here, a relatively facile, rapid, and cost-effective method for targeted gene disruption in Streptococcus mutans is described. The method utilizes a 2-step fusion polymerase chain reaction (PCR) to generate the disruption construct and electroporation for genetic transformation. This method does not require an enzymatic reaction, other than PCR, and additionally offers greater flexibility in terms of the design of the disruption construct. Employment of electroporation facilitates the preparation of competent cells and improves the transformation efficiency. The present method may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

We describe a facile, rapid, and relatively inexpensive method for the generation of gene-disrupted Streptococcus mutans strains; this technique may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

遺伝子破壊ミュータンス連鎖球菌緊張せず遺伝子クローニングの生成

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has been associated with both the progression of cancer and the development of drug resistance. Until now, it has not been feasible to easily manipulate the ploidy of a multicellular animal without generating mostly sterile progeny. Presented here is a simple and rapid protocol for generating tetraploid Caenorhabditis elegans animals from any diploid strain. This method allows the user to create a bias in chromosome segregation during meiosis, ultimately increasing ploidy in C. elegans. This strategy relies on the transient reduction of expression of the rec-8 gene to generate diploid gametes. A rec-8 mutant produces diploid gametes that can potentially produce tetraploids upon fertilization. This tractable scheme has been used to generate tetraploid strains carrying mutations and chromosome rearrangements to gain insight into chromosomal dynamics and interactions during pairing and synapsis in meiosis. This method is efficient for generating stable tetraploid strains without genetic markers, can be applied to any diploid strain, and can be used to derive triploid C. elegans. This straightforward method is useful for investigating other fundamental biological questions relevant to genome instability, gene dosage, biological scaling, extracellular signaling, adaptation to stress, development of resistance to drugs, and mechanisms of speciation.

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

This method allows for the generation of tetraploid and triploid Caenorhabditis nematodes from any diploid strain. Polyploid strains generated by this method have been used to study chromosome interactions in meiotic prophase, and this method is useful for examining important basic questions in cell, developmental, evolutionary, and cancer biology.

カエノラブディティス ・ エレガンスにおける倍数性の操作

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

マウス卵母細胞を減数分裂の間に人間の遺伝子の機能を評価するために使用私

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and organs. The O9-1 cell line is derived from the endogenous mouse embryonic NCCs and maintains its multipotency. However, under specific culture conditions, O9-1 cells can differentiate into different cell types and be utilized in a wide range of research applications. Recently, with the combination of mouse studies and O9-1 cell studies, we have shown that the Hippo signaling pathway effectors Yap and Taz play important roles in neural crest-derived craniofacial development. Although the culturing process for O9-1 cells is more complicated than that used for other cell lines, the O9-1 cell line is a powerful model for investigating NCCs in vitro. Here, we present a protocol for culturing the O9-1 cell line to maintain its stemness, as well as protocols for differentiating O9-1 cells into different cell types, such as smooth muscle cells and osteoblasts. In addition, protocols are described for performing gene loss-of-function studies in O9-1 cells by using CRISPR-Cas9 deletion and small interfering RNA-mediated knockdown.

O9-1 is a multipotent mouse neural crest cell line. Here we describe detailed step-by-step protocols for culturing O9-1 cells, differentiating O9-1 cells into specific cell types, and genetically manipulating O9-1 cells by using siRNA-mediated knockdown or CRISPR-Cas9 genome editing.

養殖と O9 1 神経堤細胞の操作

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and ...

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult forms has revealed the genetic basis of some of these differences. Less is known about how the populations differ at post-larval stages (at the onset of feeding). Such studies may provide insight into how cavefish survive through adulthood in their natural environment. Methods for comparing post-larval development in the laboratory require standardized aquaculture and feeding regimes. Here we describe how to raise fish on a diet of nutrient-rich rotifers in non-recirculating water for up to two-weeks post fertilization. We demonstrate how to collect post-larval fish from this nursery system and perform whole-mount immunostaining. Immunostaining is an attractive alternative to transgene expression analysis for investigating development and gene function in A. mexicanus. The nursery method can also be used as a standard protocol for establishing density-matched populations for growth into adults.

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

In this protocol, we demonstrate how to breed Astyanax mexicanus adults, raise the larvae, and perform whole-mount immunohistochemistry on post-larval fish to compare the phenotypes of surface and cave morphotypes.

Post-larval 表現型解析およびホール マウント免疫組織化学のためメキシコ テトラアステュアナクス メキシコの調達

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for reversible and tunable expression control of an endogenous gene of interest in living model systems. The REMOTE-control system employs enhanced lac repression and tet activation systems to achieve down- or upregulation of a target gene within a single biological system. Tight repression can be achieved from repressor binding sites flexibly located far downstream of a transcription start site by inhibiting transcription elongation. Robust upregulation can be attained by enhancing the transcription of an endogenous gene by targeting tet transcriptional activators to the cognate promoter. This reversible and tunable expression control can be applied and withdrawn repeatedly in organisms. The potency and versatility of the system, as demonstrated for endogenous Dnmt1 here, will allow more precise in vivo functional analyses by enabling investigation of gene function at various expression levels and by testing the reversibility of a phenotype.

This protocol outlines the steps needed to generate a model system in which the transcription of an endogenous gene of interest can be conditionally controlled in live animals or cells using enhanced lac repressor and/or tet activator systems.

体内の内因性遺伝子操作のリモート制御システムのアプリケーション

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...