Name: manipulation of gene function in mexican cavefish
Uploaded: 2019-04-22T13:00:00
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Os autores agradecer Sunishka Thakur pela sua assistência na genotipagem e imagem os peixes mutantes oca2 , representados na Figura 2. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation (NSF) prêmio 1656574 para A.C.K., prêmio NSF 1754321 a J.K. e A.C.K. e prêmio do National Institutes of Health (NIH) R21NS105071 para A.C.K. e E.R.D.

1. Morpholinos oligo projeto
Nota: As sequências para a. mexicanus estão disponíveis através do centro nacional de Biotechnology Information (NCBI) Gene e NCBI SRA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov), bem como a partir do navegador de genoma de Ensembl (https://www.ensembl.org). Ao projetar um Morpholinos para uso em ambas as formas da superfície - e caverna-moradia, é crítico para identificar qualquer variação genética entre o morfos nesta fase, para que estas regiões genéticas ...

Aqui, nós fornecemos uma metodologia para manipular a função dos genes usando morpholinos, gene CRISPR/Cas9 edição e metodologia de transgênese. A riqueza da tecnologia genética e a otimização desses sistemas no zebrafish provavelmente permitirá a transferência dessas ferramentas para a. mexicanus com facilidade52. Descobertas recentes têm usado essas abordagens na . mexicanus, mas eles permanecem subutilizados na investigação de diversas características morfológi...

Desde a Origem das espéciesde Darwin1, cientistas ganharam profundos insights sobre como traços são dados forma evolutivamente em resposta a pressões ecológicas e ambientais definidas, graças a caverna organismos2. O tetra mexicano, a. mexicanus, consiste em olhos populações 'superfície' ancestrais que habitam rios em todo o México e sul do Texas e pelo menos 29 populações geograficamente isoladas da caverna derivada morfos que habitam a Sierra del Abra e outras áreas do México nordeste3. Foram identificados vários traços associada a caverna em a. mexicanus, incluindo o consumo de oxigênio alterados, despigmentação, perda de olhos e alterada a alimentação e forrageamento comportamento4,5,6, 7,8,9. A. mexicanus apresenta um poderoso modelo para investigar mecanismos de evolução convergente, devido a uma história evolutiva bem definida, uma caracterização detalhada do ambiente ecológico e a presença de forma independente evoluiu caverna populações de10,11. Muitos dos traços que estão presentes no cavefish, incluindo perda de olhos, dormir perda, aumentaram a alimentação, perda de escolaridade, reduziram a agressão e reduziram respostas de estresse, evoluíram várias vezes através de origens independentes, muitas vezes utilizando derivados de caverna diferentes vias genéticas entre cavernas8,12,13,14,15. Esta evolução é um aspecto poderoso do sistema da . mexicanus e pode fornecer insights sobre a questão mais geral de sistemas como a genéticas podem ser perturbado para gerar fenótipos similares repetida.
Enquanto a aplicação da tecnologia genética para a investigação mecanicista da função dos genes tem sido limitada em muitas espécies de peixes (incluindo a. mexicanus), avanços recentes no zebrafish fornecem uma base para o desenvolvimento de tecnologia genética em peixes 16,17,18,19,20. Inúmeras ferramentas são amplamente utilizadas no zebrafish para manipular a expressão gênica, e a implementação desses procedimentos há muito tempo tem sido padronizado. Por exemplo, a injeção de Morpholinos oligos (MOs) na fase de célula única seletivamente bloqueia RNA e impede que a tradução para uma janela temporal breve durante desenvolvimento21,22. Além disso, gene-edição abordagens, tais como agrupados regularmente intercaladas curtas palíndromos repetições (CRISPR) / CRISPR-associados proteína 9 (Cas9) e nuclease efetoras como ativador de transcrição (TALEN), que permite a geração de exclusões definidas ou, em alguns casos, inserções através de uma recombinação em genomas19,20,23,24. Transgênese é usada para manipular a expressão de gene estável ou função de uma maneira específica do tipo de célula. O sistema Tol2 é utilizado com eficácia para gerar animais transgénicos por coinjecting transposase mRNA com um plasmídeo de DNA Tol2 contendo um transgene25,26. O sistema Tol2 utiliza o transposase Tol2 de medaka para gerar inserções germline estável de construct17 transgénicos. Gerar Tol2 transgênicos envolve coinjecting um plasmídeo contendo um transgene ladeado por sites de integração Tol2 e mRNA para Tol2 transposase17. Este sistema tem sido usado para gerar uma matriz de linhas transgénicas no zebrafish e seu uso se expandiu recentemente para sistemas modelo emergente adicionais, incluindo ciclideos, killies, o pauzinho e, mais recentemente, o mexicano cavefish27, 28,29,30.
Enquanto o cavefish é um fascinante sistema biológico para elucidar os mecanismos da evolução do traço, sua capacidade plena como um modelo evolucionista não tem sido totalmente aproveitada. Isto tem sido parcialmente devido a uma incapacidade de manipular genética e celular funcionar diretamente31. Genes candidatos regulação complexos traços foram identificados usando estudos de loci (QTL) característica quantitativa, mas a validação destes genes candidatos tem sido difícil32,33,34. Recentemente, nocaute transiente usando morpholinos, gene edição usando sistemas CRISPR e TALEN e o uso do Tol2-transgênese mediada têm sido usados para investigar a base genética subjacente a um número de traços,35,36,37 ,38. A implementação e padronização destas técnicas permitirá manipulações que interrogar os fundamentos moleculares e neurais de traços biológicos, incluindo a manipulação da função do gene, a rotulagem de populações de células definidos, e a expressão de repórteres funcionais. Considerando que o sucesso da implementação destas ferramentas genéticas para manipular o gene ou função celular tem sido demonstrada em sistemas modelo emergente, protocolos detalhados ainda são carentes da . mexicanus.
A. mexicanus fornecem a introspecção crítica dos mecanismos da evolução em resposta a um ambiente em mudança e a oportunidade de identificar novos genes regulando diversos traços do presente. Um número de fatores sugere que a. mexicanus é um modelo extremamente tractable para aplicar ferramentas genómicas estabelecidas atualmente disponíveis em modelos genéticos estabelecidos, incluindo a capacidade de facilmente manter peixes nos laboratórios, tamanho grande ninhado, transparência, um genoma sequenciado e ensaios comportamentais definidos39. Aqui, descrevemos uma metodologia para o uso de morpholinos, transgênese e gene edição na superfície e caverna populações da . mexicanus. A aplicação mais ampla dessas ferramentas na . mexicanus permitirá uma investigação mecanicista sobre os processos moleculares subjacentes a evolução das diferenças de desenvolvimento, fisiológicas e comportamentais entre cavefish e peixes de superfície.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1025px;" width="1025">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fish breeding &#38; egg supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fine mesh fish net</td>
			<td style="width:196px;">Penn Plax</td>
			<td style="width:191px;">BN4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fish tank heater</td>
			<td style="width:196px;">Aqueon</td>
			<td style="width:191px;">100106108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Egg traps</td>
			<td style="width:196px;">Custom made</td>
			<td style="width:191px;">NA</td>
			<td>Design and create plastic grate to place at bottom of tank to protect eggs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass pipettes</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette bulbs</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">03-448-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Egg molds</td>
			<td style="width:196px;">Adaptive Science Tools</td>
			<td style="width:191px;">TU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Morpholino supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Control Morpholino</td>
			<td style="width:196px;">Gene Tools, LLC</td>
			<td style="width:191px;">Standard control olio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Custom Morpholino</td>
			<td style="width:196px;">Gene Tools, LLC</td>
			<td style="width:191px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenol Red</td>
			<td style="width:196px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">P0290-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CRISPR supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cas9 Plasmid</td>
			<td style="width:196px;">AddGene</td>
			<td style="width:191px;">46757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GoTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:196px;">Promega</td>
			<td style="width:191px;">M3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KOD Hot Start Taq</td>
			<td style="width:196px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:191px;">71-842-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Primers</td>
			<td style="width:196px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:191px;">Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T7 Megascript Kit</td>
			<td style="width:196px;">Ambion/Thermofisher</td>
			<td style="width:191px;">AM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">miRNeasy Kit</td>
			<td style="width:196px;">Qiagen</td>
			<td style="width:191px;">217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mMessage mMachine T3 kit</td>
			<td style="width:196px;">Ambion/Thermofisher</td>
			<td style="width:191px;">AM1348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MinElute Kit</td>
			<td style="width:196px;">Qiagen</td>
			<td style="width:191px;">28204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tol2 transgenesis supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pCS-zT2TP plasmid</td>
			<td style="width:196px;">Kawakami et al., 2004</td>
			<td style="width:191px;">Request from senior author</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CutSmart Buffer</td>
			<td style="width:196px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:191px;">B7204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NotI-HF Restriction Enzyme</td>
			<td style="width:196px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:191px;">R3189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PCR purification Kit</td>
			<td style="width:196px;">Qiagen</td>
			<td style="width:191px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SP6 mMessenger Kit</td>
			<td style="width:196px;">Ambion/Thermofisher</td>
			<td style="width:191px;">AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microinjection supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass Capillary Tubes</td>
			<td style="width:196px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:191px;">BF100-58-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette puller</td>
			<td style="width:196px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:191px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Picoinjector</td>
			<td style="width:196px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:191px;">PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:196px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:191px;">M3301R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micromanipulator Stand</td>
			<td style="width:196px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:191px;">M10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micmanipulator Base</td>
			<td style="width:196px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:191px;">Steel Plate Base, 10 lbs</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manipulation of gene function in mexican cavefish

Caverna de animais fornecem um sistema convincente para investigar os mecanismos evolucionários e bases genéticas subjacentes alterações em numerosos traços complexos, incluindo a degeneração do olho, albinismo, perda do sono, hiperfagia e processamento sensorial. Espécie de cavefish de todo o mundo exibe uma evolução convergente de características morfológicas e comportamentais devido a pressões ambientais compartilhadas entre sistemas diferentes de caverna. Caverna de diversas espécies foram estudadas na configuração de laboratório. O tetra mexicano, Astyanax mexicanus, com formas de videntes e cegas, forneceu insights exclusivas em processos biológicos e moleculares subjacentes a evolução dos traços complexos e é bem preparado como um sistema modelo emergente. Enquanto genes candidatos regulamenta a evolução de diversos processos biológicos foram identificados na. mexicanus, a capacidade de validar um papel para genes individuais tem sido limitada. A aplicação de transgênese e gene-edição tecnologia tem o potencial para superar este obstáculo significativo e investigar os mecanismos subjacentes a evolução dos traços complexos. Aqui, descrevemos uma metodologia diferente para manipular a expressão gênica na . mexicanus. Abordagens incluem o uso de morpholinos, Tol2 transgênese, e sistemas de edição de gene, comumente usados em zebrafish e outros peixes de modelos, para manipular a função do gene na . mexicanus. Estes protocolos incluem descrições detalhadas dos procedimentos de reprodução programada, a coleção de ovos fertilizados, injeções e a seleção de animais geneticamente modificados. Permitirão que estas abordagens metodológicas para a investigação dos mecanismos genéticos e neurais subjacentes a evolução dos diversos traços na . mexicanus.

Várias populações da caverna-moradia a. mexicanus mostram redução de sono e vigília/atividade aumentada em relação à sua superfície-moradia coespecíficos14. Hipocretina/Hipocretina (HCRT) é um neuropeptídeo altamente conservado, que atua para aumentar a vigília, e aberrações na via HCRT causam narcolepsia em humanos e outros mamíferos47,48. Nós demonstramos anteriormente naquela caverna a. mexicanus aume...

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Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Descrevemos abordagens para a manipulação de genes no sistema modelo evolucionista Astyanax mexicanus. São descritas três técnicas diferentes: transgênese mediada por Tol2, alvo de manipulação do genoma usando CRISPR/Cas9 e nocaute de expressão usando morpholinos. Essas ferramentas devem facilitar a investigação direta de genes subjacentes a variação entre as formas de superfície - e caverna-moradia.

Manipulação de função do Gene em Cavefish mexicano

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Os animais das cavernas fornecem um sistema convincente para investigar diversos traços morfológicos, de desenvolvimento e comportamentais. Mas um dos fatores limitantes no estabelecimento desse sistema modelo é a falta de ferramentas genéticas que nos permitam manipular a função genética. Aqui demonstramos três abordagens diferentes para manipular a função genética no peixe-caverna mexicano, Astyanax mexicanus.Essas ferramentas permitirão a investigação dos genes subjacentes às variações naturais entre peixes superficiais e peixes-caverna e como eles se relacionam com fenótipos. Bethany Stahl, uma talentosa pós-doutora no meu laboratório, demonstrará esse procedimento. Antes de iniciar o procedimento, encha uma placa de Petri de 100 mililitros com 3% de agarose quente dissolvido na água do sistema de peixes e coloque cuidadosamente um molde de injeção de ovo na agarose em um ângulo de 45 graus, antes de baixar lentamente o molde para a ágarose para evitar prender o ar sob o molde.Quando a agarose tiver solidificado, remova cuidadosamente o molde e armazene a placa a quatro graus Celsius por até uma semana. Em seguida, puxe agulhas de capilares de vidro borossilicato e um puxador de agulha de eletrodo de acordo com as diretrizes do fabricante. No dia da injeção, use uma pipeta de vidro para transferir ovos de célula única para a placa de injeção, preenchendo até cinco fileiras da placa de injeção com 30 a 40 ovos por linha.Mantenha os ovos hidratados com uma pequena quantidade de água do sistema de peixes. Descongele Morpholino no gelo e prepare a solução de injeção para que 400 picogramas de Morpholino seja injetado por ovo usando uma longa ponta de pipeta Microloader ou adicionando um bolus de dois a quatro microliter ao final. Quando todas as agulhas tiverem sido carregadas, use fórceps para cortar o comprimento excessivo das pontas da agulha de injeção e montar a primeira agulha em um micromanipulador conectado a um microinjetor picoliter.Em seguida, coloque o prato de injeção sob um microscópio dissecando e use o micromanipulador para penetrar cada ovo com a agulha antes de injetar um nanoliter de solução de injeção de Morpholino diretamente na gema. Para injeção CRISPR, misture 25 picogramas de RNA guia com 300 picogramas de RNA mensageiro de proteína CRISPR 9 e injete dois nanoliters da solução de RNA resultante em cada embrião, conforme demonstrado. Para tol2 transposase e tol2 injeção plasmida flanqueada, combine 25 nanogramas por microliter de Tol2 mensageiro RNA com 25 nanogramas por microliter de tol2 construção plasmid e vermelho fenol em água livre de RNase.Em seguida, injete um nanoliter de solução em cada embrião como apenas demonstrado. Para rastrear os animais injetados por Morpholino a quatro dias após a injeção, dependendo do gene de interesse, visualize as larvas de peixe sob um microscópio estéreo para observar o fenótipo dos animais injetados ou registro de vídeo para medir o comportamento. Para testar os indels crispr, transfira embriões injetados por CRISPR em tubos PCR e extraia o DNA de acordo com protocolos padrão de extração de DNA para reação em cadeia de polimerase ou análise de PCR.Para avaliar a mutagênese, execute cinco microliters do produto PCR em um gel de 3%agarose a 70 volts por três horas. O DNA não mutagenizado do tipo selvagem resultará em uma banda distinta, enquanto o DNA mutante resultará em uma banda manchada. Caverna Um mexicano injetado com um controle Morpholino exibe significativamente mais atividade locomotor e reduziu o sono durante um período de 24 horas, em comparação com peixes superficiais injetados com um Morpholino mexido.A injeção da orexina de hipocretina Morpholino tem pouco efeito no sono em peixes superficiais em comparação com peixes injetados no controle. Em contraste, a derrubada da orexina hipocretina através da injeção de Morpholino tem um efeito significativo no sono em peixes que habitam cavernas, fornecendo uma ligação direta entre a expressão de orexina hipocretina e a perda de sono. Mutagênese mediada por CRPSR do gene albinismo OCA2 em peixes superficiais resulta em alguns indivíduos homozigos para o alelo positivo OCA2 tipo selvagem, e está associado à pigmentação de abrigar, enquanto indivíduos que têm duas cópias do alelo negativo OCA2 mutado por CRISPR são albinos, fornecendo uma ligação direta entre o gene mutante OCA2 e o albinismo em peixes de caverna.Selecione o F0 positivo para o Transgene transmitido tol2 para voltar para o tipo selvagem para gerar linhas estáveis de F1. Isso permite imagens de cálcio ao vivo para descobrir diferenças na atividade neuronal, mediando mudanças comportamentais no ambiente das cavernas, lançando as bases para a expressão de muitos transgenes adicionais para caracterizar e manipular a função genética em Um mexicano. As coisas mais importantes a se lembrar são carregar os ovos firmemente sobre a placa, aparar a agulha corretamente e otimizar a microinjeção.Após um knockdown genético bem sucedido, integração transgênica ou edição de genes mediada pelo CRISPR, esses peixes podem ser usados para análises de desenvolvimento, comportamento e atividade cerebral.

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SCIENTISTS IN ACTION

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the replacement of the entire gene with a selectable marker via homologous recombination. During homologous recombination, exchange of DNA takes place between sequences with high similarity. Therefore, linear genomic sequences flanking a target gene can be used to specifically direct a selectable marker to the desired integration site. Blunt ends of the deletion construct activate the cell&#39;s DNA repair systems and thereby promote integration of the construct either via homologous recombination or by non-homologous-end-joining. In organisms with efficient homologous recombination, the rate of successful gene deletion can reach more than 50% making this strategy a valuable gene disruption system. The smut fungus Ustilago maydis is a eukaryotic model microorganism showing such efficient homologous recombination. Out of its about 6,900 genes, many have been functionally characterized with the help of deletion mutants, and repeated failure of gene replacement attempts points at essential function of the gene. Subsequent characterization of the gene function by tagging with fluorescent markers or mutations of predicted domains also relies on DNA exchange via homologous recombination. Here, we present the U. maydis strain generation strategy in detail using the simplest example, the gene deletion.

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

We describe a robust gene replacement strategy to genetically manipulate the smut fungus Ustilago maydis. This protocol explains how to generate deletion mutants to investigate infection phenotypes. It can be extended to modify genes in any desired way, e.g., by adding a sequence encoding a fluorescent protein tag.

Manipulação genética do patógeno de planta<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Estudar Biologia fúngicos e vegetais Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Genética

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

Medição paralela da expressão do gene relógio circadiano e hormonal secreção em culturas de células primárias humanas

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

Criação e Double-stranded mediada por RNA silenciamento de genes na Esconder Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

Uma metodologia padrão para examinar a mutagenicidade no local como uma função de ponto de mutação reparação catalisada por CRISPR/Cas9 e SsODN em células humanas

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in which the gene of interest has been disrupted. A gene-disruption DNA construct containing a suitable antibiotic resistance marker gene is useful for the generation of gene-disrupted strains in bacteria. However, conventional construction methods, which require gene cloning steps, involve complex and time-consuming protocols. Here, a relatively facile, rapid, and cost-effective method for targeted gene disruption in Streptococcus mutans is described. The method utilizes a 2-step fusion polymerase chain reaction (PCR) to generate the disruption construct and electroporation for genetic transformation. This method does not require an enzymatic reaction, other than PCR, and additionally offers greater flexibility in terms of the design of the disruption construct. Employment of electroporation facilitates the preparation of competent cells and improves the transformation efficiency. The present method may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

We describe a facile, rapid, and relatively inexpensive method for the generation of gene-disrupted Streptococcus mutans strains; this technique may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Geração de um Gene-interrompeu Streptococcus mutans estirpe sem Gene clonagem

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has been associated with both the progression of cancer and the development of drug resistance. Until now, it has not been feasible to easily manipulate the ploidy of a multicellular animal without generating mostly sterile progeny. Presented here is a simple and rapid protocol for generating tetraploid Caenorhabditis elegans animals from any diploid strain. This method allows the user to create a bias in chromosome segregation during meiosis, ultimately increasing ploidy in C. elegans. This strategy relies on the transient reduction of expression of the rec-8 gene to generate diploid gametes. A rec-8 mutant produces diploid gametes that can potentially produce tetraploids upon fertilization. This tractable scheme has been used to generate tetraploid strains carrying mutations and chromosome rearrangements to gain insight into chromosomal dynamics and interactions during pairing and synapsis in meiosis. This method is efficient for generating stable tetraploid strains without genetic markers, can be applied to any diploid strain, and can be used to derive triploid C. elegans. This straightforward method is useful for investigating other fundamental biological questions relevant to genome instability, gene dosage, biological scaling, extracellular signaling, adaptation to stress, development of resistance to drugs, and mechanisms of speciation.

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

This method allows for the generation of tetraploid and triploid Caenorhabditis nematodes from any diploid strain. Polyploid strains generated by this method have been used to study chromosome interactions in meiotic prophase, and this method is useful for examining important basic questions in cell, developmental, evolutionary, and cancer biology.

Manipulação de ploidia em Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

Usando oócitos de camundongo para avaliar a função de genes humanos durante a meiose I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and organs. The O9-1 cell line is derived from the endogenous mouse embryonic NCCs and maintains its multipotency. However, under specific culture conditions, O9-1 cells can differentiate into different cell types and be utilized in a wide range of research applications. Recently, with the combination of mouse studies and O9-1 cell studies, we have shown that the Hippo signaling pathway effectors Yap and Taz play important roles in neural crest-derived craniofacial development. Although the culturing process for O9-1 cells is more complicated than that used for other cell lines, the O9-1 cell line is a powerful model for investigating NCCs in vitro. Here, we present a protocol for culturing the O9-1 cell line to maintain its stemness, as well as protocols for differentiating O9-1 cells into different cell types, such as smooth muscle cells and osteoblasts. In addition, protocols are described for performing gene loss-of-function studies in O9-1 cells by using CRISPR-Cas9 deletion and small interfering RNA-mediated knockdown.

O9-1 is a multipotent mouse neural crest cell line. Here we describe detailed step-by-step protocols for culturing O9-1 cells, differentiating O9-1 cells into specific cell types, and genetically manipulating O9-1 cells by using siRNA-mediated knockdown or CRISPR-Cas9 genome editing.

Cultivo e manipulação das células da crista Neural de O9-1

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and ...

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult forms has revealed the genetic basis of some of these differences. Less is known about how the populations differ at post-larval stages (at the onset of feeding). Such studies may provide insight into how cavefish survive through adulthood in their natural environment. Methods for comparing post-larval development in the laboratory require standardized aquaculture and feeding regimes. Here we describe how to raise fish on a diet of nutrient-rich rotifers in non-recirculating water for up to two-weeks post fertilization. We demonstrate how to collect post-larval fish from this nursery system and perform whole-mount immunostaining. Immunostaining is an attractive alternative to transgene expression analysis for investigating development and gene function in A. mexicanus. The nursery method can also be used as a standard protocol for establishing density-matched populations for growth into adults.

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

In this protocol, we demonstrate how to breed Astyanax mexicanus adults, raise the larvae, and perform whole-mount immunohistochemistry on post-larval fish to compare the phenotypes of surface and cave morphotypes.

Levantando o Tetra mexicano Astyanax mexicanus para análise dos fenótipos Post-larval e imuno-histoquímica toda a montagem

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for reversible and tunable expression control of an endogenous gene of interest in living model systems. The REMOTE-control system employs enhanced lac repression and tet activation systems to achieve down- or upregulation of a target gene within a single biological system. Tight repression can be achieved from repressor binding sites flexibly located far downstream of a transcription start site by inhibiting transcription elongation. Robust upregulation can be attained by enhancing the transcription of an endogenous gene by targeting tet transcriptional activators to the cognate promoter. This reversible and tunable expression control can be applied and withdrawn repeatedly in organisms. The potency and versatility of the system, as demonstrated for endogenous Dnmt1 here, will allow more precise in vivo functional analyses by enabling investigation of gene function at various expression levels and by testing the reversibility of a phenotype.

This protocol outlines the steps needed to generate a model system in which the transcription of an endogenous gene of interest can be conditionally controlled in live animals or cells using enhanced lac repressor and/or tet activator systems.

Na aplicação do sistema de controle remoto para a manipulação da expressão do Gene endógeno de vivo

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...