Name: manipulation of gene function in mexican cavefish
Uploaded: 2019-04-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish at JoVE.com

Авторы благодарят Sunishka Тхакур за ее помощь в генотипирования и визуализации oca2 мутант рыб, изображенный на рисунке 2. Эта работа была поддержана Национальный фонд науки (NSF) награду 1656574 A.C.K., премии 1754321 NSF J.K. и A.C.K. и национальных институтов здравоохранения (НИЗ) премии R21NS105071 A.C.K. и E.R.D.

1. Морфолино oligo дизайн
Примечание: Последовательности для A. гракл доступны через Национальный центр биотехнологической информации (NCBI) ген и SRA NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov), а также из Ensembl генома браузер (https://www.ensembl.org). При проектировании Морфолино для использования в обеих фо?...

Здесь мы предоставили методологию для манипулирования функции гена, используя морфолиновая, ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена редактирования и трансгенез методологии. Богатство генетических технологий и оптимизации этих систем в данио рерио, скорее всего, позволит для передачи этих средств в A. г?...

С тех пор Происхождение видовДарвина1ученые получили глубокое понимание как черты эволюционно формируются в ответ на определенные природоохранные и экологические давление, благодаря пещера организмов2. Мексиканский tetra, A. гракл, состоит из глазами предков «поверхности» популяций, которые населяют рек Мексики и Южной Техас и по крайней мере 29 географически изолированные популяции производных пещера морф, населяющих Abra Сьерра-дель- и другие районы северо-восточной Мексике3. Было выявлено несколько черт, связанных пещера в A. гракл, включая потребление кислорода изменены, депигментация, потерю глаза и изменили кормления и нагула поведение4,5,6, 7,8,9. A. гракл представляет мощную модель для изучения механизмов конвергентной эволюции благодаря четко определенной эволюционной истории, подробная характеристика состояния окружающей среды и присутствие независимо эволюционировали пещера населением в10,11. Многие из пещеры производные признаки, которые присутствуют в cavefish, включая потерю глаз, потеря сна, увеличилось, питание, потеря школьного обучения, снижение агрессии и уменьшить стресс ответы, развивались несколько раз через независимого происхождения, зачастую с использованием различные генетические пути между пещеры8,12,13,14,15. Это повторяется, эволюция является мощным аспектом A. гракл системы и может обеспечить проницательность в более общий вопрос о как генетических систем может возмущенных для создания аналогичных фенотипов.
В то время как в многих видов рыб (в том числе A. гракл) был ограниченным применения генетических технологий механистический расследования функции гена, последние достижения в zebrafish обеспечивают основу для разработки генетических технологий в рыбе 16,17,18,19,20. Многочисленные инструменты широко используются в zebrafish манипулировать экспрессии генов, и осуществление этих процедур давно были стандартизированы. К примеру инъекции oligos Морфолино (MOs) на стадии одноклеточных выборочно блокирует РНК и предотвращает перевод для краткое временного окна во время разработки21,22. Кроме того, ген редактирования подходы, такие, как кластерный регулярно interspaced короткие палиндром повторяется (ТРИФОСФАТЫ) / ТРИФОСФАТЫ, связанные белком 9 (Cas9) и транскрипции активатор как эффекторных нуклеиназы (TALEN), позволяют для генерации определенных исключений или, в некоторых случаях, вставки через рекомбинации в геномах19,,2023,24. Трансгенез используется для манипулирования стабильной ген выражение или функцию определенным образом тип ячейки. Система Tol2 эффективно используется для создания трансгенных животных, coinjecting Транспозаза мРНК с Tol2 плазмида ДНК, содержащие трансген25,26. Система Tol2 использует Tol2 Транспозаза оризии для создания стабильной микрофлорой вставки трансгенных construct17. Создание Tol2 мутация включает в себя coinjecting плазмиды, содержащий трансген, обрамленная Tol2 интеграции сайтов и мРНК Tol2 Транспозаза17. Эта система используется для создания массива трансгенных линий в данио рерио и его использование недавно расширена еще формирующейся модели систем, включая цихлид, Пецилиевые рыбы, колюшка и, более недавно, мексиканской cavefish27, 28,29,30.
В то время как cavefish это увлекательный биологическая система для разъяснения механизмов черта эволюции, его потенциал как Эволюционная модель не были использованы полностью. Это частично объясняется невозможностью манипулировать генетических и сотовой функция непосредственно31. Кандидат генов, регулирование сложных черты были определены с использованием количественных признаков локусов (QTL) исследования, но проверка этих генов кандидат был трудным32,33,34. Недавно переходных нокдаун, используя морфолиновая, Джин, редактирование с помощью систем ТРИФОСФАТЫ и TALEN и использование Tol2-опосредованной трансгенез были использованы для изучения генетической основы, лежащие в основе ряда признаков35,36,37 ,38. Осуществление и стандартизации этих методов позволит для манипуляции, которые допрашивают молекулярных и нейронных основы биологических черт, в том числе манипуляции функции гена, маркировки определенных клеточных популяций, и выражение функциональных репортеров. Успешное осуществление этих генетических инструменты для манипулирования генов или сотовой функция была продемонстрирована в формирующейся модели систем, в то время как в A. граклпо-прежнему отсутствуют подробные протоколы.
A. гракл обеспечивают критический взгляд в механизмы эволюции в ответ на меняющиеся условия и возможность для определения новых генов, регулирующих различные черты. Ряд факторов предполагают, что A. гракл является чрезвычайно шансов справиться с возникающими модель для применения установленных геномной инструментов, имеющихся в настоящее время в установленные генетические моделей, включая возможность легко поддерживать рыбы в лабораториях, большой размер выводка, прозрачности, последовательности генома и определенных поведенческих анализов39. Здесь мы описываем методологии для использования морфолиновая, трансгенез и Джин редактирования в поверхность и пещера популяциях A. гракл. Более широкое применение этих инструментов в A. гракл позволит механистический расследование молекулярных процессов, лежащих в основе эволюции развития, физиологические и поведенческие различия между cavefish и поверхности рыбы.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1025px;" width="1025">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fish breeding &#38; egg supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fine mesh fish net</td>
			<td style="width:196px;">Penn Plax</td>
			<td style="width:191px;">BN4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fish tank heater</td>
			<td style="width:196px;">Aqueon</td>
			<td style="width:191px;">100106108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Egg traps</td>
			<td style="width:196px;">Custom made</td>
			<td style="width:191px;">NA</td>
			<td>Design and create plastic grate to place at bottom of tank to protect eggs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass pipettes</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette bulbs</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">03-448-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Egg molds</td>
			<td style="width:196px;">Adaptive Science Tools</td>
			<td style="width:191px;">TU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Morpholino supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Control Morpholino</td>
			<td style="width:196px;">Gene Tools, LLC</td>
			<td style="width:191px;">Standard control olio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Custom Morpholino</td>
			<td style="width:196px;">Gene Tools, LLC</td>
			<td style="width:191px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenol Red</td>
			<td style="width:196px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">P0290-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CRISPR supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cas9 Plasmid</td>
			<td style="width:196px;">AddGene</td>
			<td style="width:191px;">46757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GoTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:196px;">Promega</td>
			<td style="width:191px;">M3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KOD Hot Start Taq</td>
			<td style="width:196px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:191px;">71-842-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Primers</td>
			<td style="width:196px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:191px;">Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T7 Megascript Kit</td>
			<td style="width:196px;">Ambion/Thermofisher</td>
			<td style="width:191px;">AM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">miRNeasy Kit</td>
			<td style="width:196px;">Qiagen</td>
			<td style="width:191px;">217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mMessage mMachine T3 kit</td>
			<td style="width:196px;">Ambion/Thermofisher</td>
			<td style="width:191px;">AM1348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MinElute Kit</td>
			<td style="width:196px;">Qiagen</td>
			<td style="width:191px;">28204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tol2 transgenesis supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pCS-zT2TP plasmid</td>
			<td style="width:196px;">Kawakami et al., 2004</td>
			<td style="width:191px;">Request from senior author</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CutSmart Buffer</td>
			<td style="width:196px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:191px;">B7204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NotI-HF Restriction Enzyme</td>
			<td style="width:196px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:191px;">R3189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PCR purification Kit</td>
			<td style="width:196px;">Qiagen</td>
			<td style="width:191px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SP6 mMessenger Kit</td>
			<td style="width:196px;">Ambion/Thermofisher</td>
			<td style="width:191px;">AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microinjection supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass Capillary Tubes</td>
			<td style="width:196px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:191px;">BF100-58-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette puller</td>
			<td style="width:196px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:191px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Picoinjector</td>
			<td style="width:196px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:191px;">PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:196px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:191px;">M3301R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micromanipulator Stand</td>
			<td style="width:196px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:191px;">M10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micmanipulator Base</td>
			<td style="width:196px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:191px;">Steel Plate Base, 10 lbs</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manipulation of gene function in mexican cavefish

Пещерных животных обеспечивают убедительные системы для изучения эволюции механизмов и генетических основ лежащих в основе изменений в многочисленных сложных черты, включая глаз дегенерации, альбинизм, потеря сна, hyperphagia и сенсорной обработки. Виды cavefish от всего мира отображения конвергентной эволюции морфологических и поведенческих признаков из-за общих экологических проблем между различными пещерных систем. Были изучены различные пещеры видов в лабораторных условиях. Мексиканский tetra, гракл Астианакт, с нормальным зрением и слепых форм, предоставила уникальные идеи в молекулярных и биологических процессов, лежащих в основе эволюции сложных черты и хорошо готовы как формирующейся модели системы. В то время как в A. гракл был выявлен кандидат генов, регулирующих эволюцию различных биологических процессов, возможность проверки роли для отдельных генов был ограниченным. Приложение трансгенез и Джин редактирования технология имеет потенциал для преодоления этого значительные препятствия и изучить механизмы, лежащие в основе эволюции сложных черты. Здесь мы описываем различные методологии для манипулирования экспрессии генов в A. гракл. Подходы включают использование морфолиновая, Tol2 трансгенез, и Джин редактирования системы, часто используемые в данио рерио и другие рыбы модели, чтобы манипулировать функции гена в A. гракл. Эти протоколы включают подробные описания процедур приурочен разведения, коллекции оплодотворенные яйца, инъекции и отбора генетически модифицированных животных. Для исследования генетических и нейронных механизмов, лежащих в основе эволюции различных признаков в A. граклпозволит эти методологические подходы.

Несколько популяций местонахождения троглофильных A. гракл показывают сокращение сна и повышенная бодрствования/активность по отношению к их поверхности жилище сородичами14. Hypocretin/orexin (HCRT) является весьма сохранены нейропептида, который действует для увеличения бодр...

Watch this Scientific Journal Video about Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish at JoVE.com

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Мы описываем подходы для манипулирования генов в системе Эволюционная модель Астианакт гракл. Описываются три различных методов: Tol2-опосредованной трансгенез, целенаправленные манипуляции генома используя ТРИФОСФАТЫ/Cas9 и сногсшибательно выражения с использованием морфолиновая. Эти инструменты должны облегчить прямое расследование генов, лежащие в основе различия между формами поверхности и пещера жилище.

Манипуляции функции гена в мексиканской Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Пещерные животные обеспечивают непреодолимую систему для исследования различных морфологических, развития и поведенческих признаков. Но одним из ограничивающих факторов в создании этой модельной системы является отсутствие генетических инструментов, которые позволили бы нам манипулировать функцией генов. Здесь мы демонстрируем три различных подхода к манипулированию функцией генов у мексиканской пещерной рыбы Astyanax mexicanus.Эти инструменты позволят изузнать гены, лежащие в основе естественных вариаций между поверхностными рыбами и пещерными рыбами, и то, как они соотносятся с фенотипами. Бетани Шталь, талантливая постдок в моей лаборатории, продемонстрирует эту процедуру. Перед началом процедуры, заполнить 100 миллилитров Петри блюдо с теплой 3%agarose растворяется в воде рыбной системы и тщательно поместите форму инъекции яйца в агарозу под углом 45 градусов, прежде чем медленно опуская плесень в агарозу, чтобы избежать захвата воздуха под плесенью.Когда агароза затвердеет, тщательно удалите форму, затем храните тарелку при четырех градусах по Цельсию в течение одной недели. Затем вытяните иглы из борозиликатных стеклянных капилляров и электрода иглы шкив в соответствии с руководящими принципами производителя. В день инъекции используйте стеклянную пипету для переноса одноклеточных яиц в инъекционной пластине, заполняя до пяти рядов инъекционной пластины 30-40 яйцами в ряд.Держите яйца гидратированных с небольшим количеством воды системы рыбы. Оттепель Morpholino на льду и подготовить инъекционный раствор так, что 400 пикограмм Morpholino вводится на яйцо с помощью длинного Microloader пипетки отзыв или добавить два-четыре микролитер болюс до конца. Когда все иглы были загружены, используйте типсы, чтобы обрезать избыток длины от иглы советы инъекции и смонтировать первую иглу в микроманипулятор подключен к пиколитер микроинъектора.Затем поместите инъекционной тарелки под рассечение микроскопа и использовать микроманипулятор, чтобы проникнуть каждое яйцо с иглой, прежде чем вводить один нанолитер Morpholino инъекционный раствор непосредственно в желток. Для инъекций CRISPR смешайте 25 пикограмм направляющих РНК с 300 пикограммами РНК-мессенджера CRISPR-ассоциированного белка 9 и ввилит в каждый эмбрион два нанолитров полученного раствора РНК, как это было продемонстрировано. Для транспозазы Tol2 и фланговой плазмидной инъекции Tol2 объедините 25 нанограммов на микролитер РНК посыльного Tol2 с 25 нанограммами на микролитер плазмидной конструкции Tol2 и феноловый красный в воде без RNase.Затем ввими один нанолитер раствора в каждый эмбрион, как только что продемонстрировано. Для проверки Morpholino-инъекционных животных в течение четырех дней после инъекции, в зависимости от гена интереса, визуализировать личинки рыб под стерео микроскопом для наблюдения фенотипа инъекционных животных или видеозаписи для измерения поведения. Для проверки инделей CRISPR перенесите в ПЦР эмбрионы, введенные CRISPR, и извлекайте ДНК в соответствии со стандартными протоколами извлечения ДНК для полимеразной цепной реакции или анализа ПЦР.Для оценки мутагенеза запустите пять микролитров продукта ПЦР на 3%агарозном геле при 70 вольтах в течение трех часов. Дикий тип, не мутагенизированные ДНК приведет к отдельной полосе, в то время как мутант ДНК приведет к smeary полосы. Пещера Mexicanus вводили с контролем Morpholino экспонатов значительно больше локомотивной активности и снижение сна в течение 24-часового периода, по сравнению с поверхностными рыбами вводили с омлетом Morpholino.Инъекция гипокретина orexin Morpholino имеет мало влияния на сон в поверхностных рыб по сравнению с контролем вводили рыбы. В отличие от этого, гипокретин orexin нокдаун через инъекцию Morpholino оказывает значительное влияние на сон в пещерных рыб, обеспечивая прямую связь между гипокретин orexin выражение и потеря сна. CRPSR-опосредованное mutagenesis гена альбинизма OCA2 в поверхностных рыбах приводит к в некоторых индивидуалах homozygous для одичал-типа OCA2 положительный аллель, и связано с укрывать пигментацию, тогда как индивидуалы которые имеют 2 экземпляра CRISPR-мутировавшего OCA2 отрицательный аллель альбинос, обеспечивая прямую связь между мутантным геном OCA2 и альбинизмом в пещере рыб.Выберите положительный F0 для Tol2 передаваемого трансгена обратно крест к дикому типу для создания стабильных линий F1. Это позволяет живую визуализацию кальция для выявления различий в активности нейронов, посредничества поведенческих изменений в пещерной среде, закладывая основу для выражения многих дополнительных трансгенов для характеристики и манипулирования функцией генов в A mexicanus. Наиболее важные вещи, чтобы помнить, чтобы загрузить яйца плотно на тарелку, чтобы обрезать иглу должным образом, и оптимизировать микроинъекции.После успешного генетического нокдауна, трансгенной интеграции или редактирования генов при посредничестве CRISPR эти рыбы могут быть использованы для анализа развития, поведения и активности мозга.

manipulation-of-gene-function-in-mexican-cavefish

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Genetics

Evolution

Evolutionary History

SCIENTISTS IN ACTION

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the replacement of the entire gene with a selectable marker via homologous recombination. During homologous recombination, exchange of DNA takes place between sequences with high similarity. Therefore, linear genomic sequences flanking a target gene can be used to specifically direct a selectable marker to the desired integration site. Blunt ends of the deletion construct activate the cell&#39;s DNA repair systems and thereby promote integration of the construct either via homologous recombination or by non-homologous-end-joining. In organisms with efficient homologous recombination, the rate of successful gene deletion can reach more than 50% making this strategy a valuable gene disruption system. The smut fungus Ustilago maydis is a eukaryotic model microorganism showing such efficient homologous recombination. Out of its about 6,900 genes, many have been functionally characterized with the help of deletion mutants, and repeated failure of gene replacement attempts points at essential function of the gene. Subsequent characterization of the gene function by tagging with fluorescent markers or mutations of predicted domains also relies on DNA exchange via homologous recombination. Here, we present the U. maydis strain generation strategy in detail using the simplest example, the gene deletion.

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

We describe a robust gene replacement strategy to genetically manipulate the smut fungus Ustilago maydis. This protocol explains how to generate deletion mutants to investigate infection phenotypes. It can be extended to modify genes in any desired way, e.g., by adding a sequence encoding a fluorescent protein tag.

Генетическая Манипуляция растений Возбудитель<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; По изучению Грибковые биологии и растений микробных взаимодействий

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

Параллельное измерение циркадных часов экспрессии генов и гормональную секрецией человека первичных клеточных культур

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

Разведению и двухцепочечную РНК-опосредованный нокдаун гена в Скрыть Beetle,<em&gt; Кожеед пятнистый</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

Стандартная методология для изучения на месте мутагенность как функция Точечная мутация ремонта, катализируемые ТРИФОСФАТЫ/Cas9 и SsODN в клетках человека

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in which the gene of interest has been disrupted. A gene-disruption DNA construct containing a suitable antibiotic resistance marker gene is useful for the generation of gene-disrupted strains in bacteria. However, conventional construction methods, which require gene cloning steps, involve complex and time-consuming protocols. Here, a relatively facile, rapid, and cost-effective method for targeted gene disruption in Streptococcus mutans is described. The method utilizes a 2-step fusion polymerase chain reaction (PCR) to generate the disruption construct and electroporation for genetic transformation. This method does not require an enzymatic reaction, other than PCR, and additionally offers greater flexibility in terms of the design of the disruption construct. Employment of electroporation facilitates the preparation of competent cells and improves the transformation efficiency. The present method may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

We describe a facile, rapid, and relatively inexpensive method for the generation of gene-disrupted Streptococcus mutans strains; this technique may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Поколение ген нарушена Streptococcus mutans штамм без генов клонирования

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has been associated with both the progression of cancer and the development of drug resistance. Until now, it has not been feasible to easily manipulate the ploidy of a multicellular animal without generating mostly sterile progeny. Presented here is a simple and rapid protocol for generating tetraploid Caenorhabditis elegans animals from any diploid strain. This method allows the user to create a bias in chromosome segregation during meiosis, ultimately increasing ploidy in C. elegans. This strategy relies on the transient reduction of expression of the rec-8 gene to generate diploid gametes. A rec-8 mutant produces diploid gametes that can potentially produce tetraploids upon fertilization. This tractable scheme has been used to generate tetraploid strains carrying mutations and chromosome rearrangements to gain insight into chromosomal dynamics and interactions during pairing and synapsis in meiosis. This method is efficient for generating stable tetraploid strains without genetic markers, can be applied to any diploid strain, and can be used to derive triploid C. elegans. This straightforward method is useful for investigating other fundamental biological questions relevant to genome instability, gene dosage, biological scaling, extracellular signaling, adaptation to stress, development of resistance to drugs, and mechanisms of speciation.

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

This method allows for the generation of tetraploid and triploid Caenorhabditis nematodes from any diploid strain. Polyploid strains generated by this method have been used to study chromosome interactions in meiotic prophase, and this method is useful for examining important basic questions in cell, developmental, evolutionary, and cancer biology.

Манипуляция плоидности в Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

С помощью мыши яйцеклеток для оценки человеческого гена функции во время мейоза я

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and organs. The O9-1 cell line is derived from the endogenous mouse embryonic NCCs and maintains its multipotency. However, under specific culture conditions, O9-1 cells can differentiate into different cell types and be utilized in a wide range of research applications. Recently, with the combination of mouse studies and O9-1 cell studies, we have shown that the Hippo signaling pathway effectors Yap and Taz play important roles in neural crest-derived craniofacial development. Although the culturing process for O9-1 cells is more complicated than that used for other cell lines, the O9-1 cell line is a powerful model for investigating NCCs in vitro. Here, we present a protocol for culturing the O9-1 cell line to maintain its stemness, as well as protocols for differentiating O9-1 cells into different cell types, such as smooth muscle cells and osteoblasts. In addition, protocols are described for performing gene loss-of-function studies in O9-1 cells by using CRISPR-Cas9 deletion and small interfering RNA-mediated knockdown.

O9-1 is a multipotent mouse neural crest cell line. Here we describe detailed step-by-step protocols for culturing O9-1 cells, differentiating O9-1 cells into specific cell types, and genetically manipulating O9-1 cells by using siRNA-mediated knockdown or CRISPR-Cas9 genome editing.

Культивирование и манипуляции O9-1 Нейронные крест клеток

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and ...

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult forms has revealed the genetic basis of some of these differences. Less is known about how the populations differ at post-larval stages (at the onset of feeding). Such studies may provide insight into how cavefish survive through adulthood in their natural environment. Methods for comparing post-larval development in the laboratory require standardized aquaculture and feeding regimes. Here we describe how to raise fish on a diet of nutrient-rich rotifers in non-recirculating water for up to two-weeks post fertilization. We demonstrate how to collect post-larval fish from this nursery system and perform whole-mount immunostaining. Immunostaining is an attractive alternative to transgene expression analysis for investigating development and gene function in A. mexicanus. The nursery method can also be used as a standard protocol for establishing density-matched populations for growth into adults.

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

In this protocol, we demonstrate how to breed Astyanax mexicanus adults, raise the larvae, and perform whole-mount immunohistochemistry on post-larval fish to compare the phenotypes of surface and cave morphotypes.

Повышение мексиканской Tetra Астианакт гракл для анализа Post-larval фенотипов и целом гора иммуногистохимии

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for reversible and tunable expression control of an endogenous gene of interest in living model systems. The REMOTE-control system employs enhanced lac repression and tet activation systems to achieve down- or upregulation of a target gene within a single biological system. Tight repression can be achieved from repressor binding sites flexibly located far downstream of a transcription start site by inhibiting transcription elongation. Robust upregulation can be attained by enhancing the transcription of an endogenous gene by targeting tet transcriptional activators to the cognate promoter. This reversible and tunable expression control can be applied and withdrawn repeatedly in organisms. The potency and versatility of the system, as demonstrated for endogenous Dnmt1 here, will allow more precise in vivo functional analyses by enabling investigation of gene function at various expression levels and by testing the reversibility of a phenotype.

This protocol outlines the steps needed to generate a model system in which the transcription of an endogenous gene of interest can be conditionally controlled in live animals or cells using enhanced lac repressor and/or tet activator systems.

В естественных условиях применение системы дистанционного управления для манипуляции эндогенного экспрессии генов

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...