Name: manipulation of gene function in mexican cavefish
Uploaded: 2019-04-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish at JoVE.com

Författarna vill tacka Sunishka Thakur för hennes hjälp i genotypning och imaging oca2 mutant fisk avbildas i figur 2. Detta arbete stöddes av National Science Foundation (NSF) award 1656574 till A.C.K., NSF award 1754321 till J.K. och A.C.K., och National Institutes of Health (NIH) award R21NS105071 A.C.K. och E.R.D.

1. Morpholino oligo design
Obs: Sekvenser för A. mexicanus finns tillgängliga genom nationella Center of Biotechnology Information (NCBI) genen och NCBI SRA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov), samt från häckning genomet webbläsaren (https://www.ensembl.org). När du utformar en morpholino för användning i båda yta - och grotta-bostad bildar, är det viktigt att identifiera någon genetisk variation mellan morphs i detta skede, så dessa genetiska regioner kan undvikas som mål för ...

Här, gav vi en metodik för att manipulera geners funktion med morpholinos, CRISPR/Cas9 gen redigering och genmodifiering metodik. Rikedomen av genteknik och optimering av dessa system i Zebrafiskar sannolikt möjliggör överföring av dessa verktyg till A. mexicanus med lätthet52. Nya rön har använt dessa metoder i A. mexicanus, men de förblir underutnyttjade i utredningen av olika morfologiska, utvecklingsmässiga och beteendemässiga egenskaper i detta system<sup class="...

Sedan Darwins Origin of Species1, har forskare fått djupa insikter om hur egenskaper är formade evolutionärt svar på definierade miljömässiga och ekologiska tryck, tack vare cave organismer2. Den mexikanska tetra, A. mexicanus, består av eyed fäderneärvda 'yta' populationer som bebor floder i hela Mexiko och södra Texas och minst 29 geografiskt isolerade populationer av härledda cave morphs bebor den Sierra del Abra och andra områden i nordöstra Mexiko3. Ett antal grottan-associerade egenskaper har identifierats i A. mexicanus, inklusive förändrad syreförbrukning, pigmentborttagning, förlust av ögon och förändrad utfodring och födosök beteende4,5,6, 7,8,9. A. mexicanus presenterar en kraftfull modell för att undersöka mekanismer av konvergent evolution på grund av en väldefinierad evolutionära historia, en detaljerad karakterisering av ekologiska miljön och förekomsten av självständigt utvecklats cave populationer10,11. Många av de cave-härledda egenskaper som finns i släktet, inklusive ögat förlust, sova förlust, ökade utfodring, förlust av skolgång, minskad aggressivitet, och minska stressreaktioner, har utvecklats flera gånger genom oberoende ursprung, ofta utnyttja olika genetiska vägar mellan grottorna8,12,13,14,15. Detta upprepas evolution är en kraftfull aspekt av A. mexicanus systemet och kan ge insikt i den mer allmänna frågan om hur genetiska system kan vara orolig för att generera liknande fenotyper.
Medan tillämpningen av genteknik för mekanistiska utredning av geners funktion har begränsats i många fiskarter (inklusive A. mexicanus), ger senaste framstegen inom Zebrafiskar en grund för genetiska teknikutveckling i fisk 16,17,18,19,20. Många verktyg används allmänt i Zebrafiskar för att manipulera genuttryck och genomförandet av dessa förfaranden har länge standardiserats. Till exempel injektion av morpholino oligos (MOs) i singel-cellstadie selektivt blockerar RNA och förhindrar översättning för en kort tidsmässiga fönster under utveckling21,22. Dessutom genredigering metoder, såsom klustrade regelbundet mellanliggande kort palindromic repetitioner (CRISPR) / CRISPR-associerade protein 9 (Cas9) och transkription aktivator-liknande effektor nuclease (TALEN), möjliggör generering av definierade borttagningar eller, i vissa fall, infogningar genom en rekombination i genomen19,20,23,24. Genmodifiering används för att manipulera stabil genuttryck eller funktion i en cell-typ specifika sätt. Tol2 systemet används effektivt att generera transgena djur genom coinjecting transposase mRNA med en Tol2 DNA plasmid som innehåller en transgenens25,26. Tol2 systemet utnyttjar den Tol2 transposase av medaka att generera stabila könsceller införanden av transgena construct17. Generera Tol2 transgenics innebär coinjecting en plasmid som innehåller en transgenens flankerad av Tol2 integration platser och mRNA för Tol2 transposase17. Detta system har använts för att generera en array av transgena linjerna i Zebrafiskar och dess användning har nyligen expanderat till ytterligare framväxande modellsystem, inklusive ciklider, killifish, Småspigg, och, mer nyligen, den mexikanska släktet27, 28,29,30.
Medan släktet är ett fascinerande biologiska system för klarlägga mekanismer av drag evolution, har dess fulla kapacitet som en evolutionär modell inte varit fullt utnyttjas. Detta har delvis berott på en oförmåga att manipulera genetiska och cellulär funktion direkt31. Kandidatgener reglera komplexa egenskaper har identifierats med hjälp av kvantitativa loci (QTL) studier, men validering av dessa kandidatgener har varit svårt32,33,34. Nyligen, övergående knockdown använder morpholinos, gen redigering med CRISPR och TALEN, och användning av Tol2-medierad genmodifiering har använts för att undersöka den genetiska grunden bakom ett antal drag35,36,37 ,38. Genomförande och standardisering av dessa tekniker möjliggör manipulationer som förhöra den molekylära och neurala underbyggnaden av biologiska egenskaper, inklusive manipulering av geners funktion, märkning av definierade cellpopulationer, och uttrycket av funktionella reportrar. Medan ett framgångsrikt genomförande av dessa genetiska verktyg för att manipulera genen eller cellulär funktion har påvisats i framväxande modellsystem, saknas fortfarande detaljerade protokoll i A. mexicanus.
A. mexicanus ger kritisk insikt om mekanismerna för evolution i svar på en föränderlig miljö och närvarande möjlighet att identifiera nya gener som reglerar olika egenskaper. Ett antal faktorer tyder på att A. mexicanus är en extremt lätthanterlig modell för att tillämpa etablerade genomisk verktyg som för närvarande finns i etablerade genetiska modeller, inklusive möjligheten att enkelt underhålla fisk i laboratorier, stor barnaskara storlek, öppenhet, ett sekvenserat genomet och definierade beteendemässiga analyser39. Här, beskriver vi en metod för användning av morpholinos, genmodifiering och gen redigering i ytan och grottan populationer av A. mexicanus. En bredare tillämpning av dessa verktyg i A. mexicanus möjliggör en mekanistisk utredning de molekylära processer som ligger bakom utvecklingen av utvecklingsmässiga, fysiologiska och beteendemässiga skillnader mellan släktet och ytan fisk.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1025px;" width="1025">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fish breeding &#38; egg supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fine mesh fish net</td>
			<td style="width:196px;">Penn Plax</td>
			<td style="width:191px;">BN4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fish tank heater</td>
			<td style="width:196px;">Aqueon</td>
			<td style="width:191px;">100106108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Egg traps</td>
			<td style="width:196px;">Custom made</td>
			<td style="width:191px;">NA</td>
			<td>Design and create plastic grate to place at bottom of tank to protect eggs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass pipettes</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette bulbs</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">03-448-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Egg molds</td>
			<td style="width:196px;">Adaptive Science Tools</td>
			<td style="width:191px;">TU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Morpholino supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Control Morpholino</td>
			<td style="width:196px;">Gene Tools, LLC</td>
			<td style="width:191px;">Standard control olio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Custom Morpholino</td>
			<td style="width:196px;">Gene Tools, LLC</td>
			<td style="width:191px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenol Red</td>
			<td style="width:196px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">P0290-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CRISPR supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cas9 Plasmid</td>
			<td style="width:196px;">AddGene</td>
			<td style="width:191px;">46757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GoTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:196px;">Promega</td>
			<td style="width:191px;">M3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KOD Hot Start Taq</td>
			<td style="width:196px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:191px;">71-842-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Primers</td>
			<td style="width:196px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:191px;">Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T7 Megascript Kit</td>
			<td style="width:196px;">Ambion/Thermofisher</td>
			<td style="width:191px;">AM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">miRNeasy Kit</td>
			<td style="width:196px;">Qiagen</td>
			<td style="width:191px;">217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mMessage mMachine T3 kit</td>
			<td style="width:196px;">Ambion/Thermofisher</td>
			<td style="width:191px;">AM1348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MinElute Kit</td>
			<td style="width:196px;">Qiagen</td>
			<td style="width:191px;">28204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tol2 transgenesis supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pCS-zT2TP plasmid</td>
			<td style="width:196px;">Kawakami et al., 2004</td>
			<td style="width:191px;">Request from senior author</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CutSmart Buffer</td>
			<td style="width:196px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:191px;">B7204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NotI-HF Restriction Enzyme</td>
			<td style="width:196px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:191px;">R3189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PCR purification Kit</td>
			<td style="width:196px;">Qiagen</td>
			<td style="width:191px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SP6 mMessenger Kit</td>
			<td style="width:196px;">Ambion/Thermofisher</td>
			<td style="width:191px;">AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microinjection supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass Capillary Tubes</td>
			<td style="width:196px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:191px;">BF100-58-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette puller</td>
			<td style="width:196px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:191px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Picoinjector</td>
			<td style="width:196px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:191px;">PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:196px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:191px;">M3301R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micromanipulator Stand</td>
			<td style="width:196px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:191px;">M10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micmanipulator Base</td>
			<td style="width:196px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:191px;">Steel Plate Base, 10 lbs</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manipulation of gene function in mexican cavefish

Cave djur ger ett tvingande system för att undersöka den evolutionära mekanismer och genetiska baser underliggande förändringar i många komplexa egenskaper, inklusive ögat degeneration, albinism, sömnbrist, hyperfagi och sensorisk bearbetning. Arter av släktet från hela världen visar en konvergent evolution av morfologiska och beteendemässiga egenskaper på grund av delade miljöbelastningar mellan olika grottsystem. Skiftande cave arter har studerats i en laboratoriemiljö. Den mexikanska tetra, Astyanax mexicanus, med synskadade och blinda former, har gett unika insikter i biologiska och molekylära processer som ligger bakom utvecklingen av komplexa egenskaper och är väl redo som en framväxande modellsystem. Även kandidatgener reglera utvecklingen av olika biologiska processer har identifierats i A. mexicanus, har möjligheten att validera en roll för enskilda gener begränsats. Tillämpningen av genmodifiering och genredigering tekniken har potential att övervinna denna påtagligt hämmas och att undersöka mekanismerna bakom utvecklingen av komplexa egenskaper. Här beskriver vi en annan metod för att manipulera genuttryck i A. mexicanus. Metoder inkluderar användning av morpholinos, Tol2 genmodifiering, och genredigering system, vanligen används i Zebrafiskar och andra fiskar modeller, för att manipulera geners funktion i A. mexicanus. Dessa protokoll innehåller detaljerade beskrivningar av tidsbestämda avel förfaranden, insamling av befruktade ägg, injektioner och valet av genetiskt modifierade djur. Dessa metoder kommer att möjliggöra utredningen av genetiska och neurala mekanismerna bakom utvecklingen av olika drag i A. mexicanus.

Flera populationer av grottboende A. mexicanus visar reducerad sömn och ökad vakenhet/aktivitet i förhållande till sin yta-bostad artfränder14. Hypokretin/orexin (HCRT) är en mycket neuropeptid, som agerar för att öka vakenhet, och avvikelser i HCRT väg orsaka narkolepsi hos människor och andra däggdjur47,48. Vi har tidigare visat att grottan A. mexicanus har ökat uttryck av HCRT peptid, vilket tyder på att e...

Watch this Scientific Journal Video about Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish at JoVE.com

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Vi beskriver metoder för manipulering av gener i den evolutionära modellsystem Astyanax mexicanus. Beskrivs tre olika tekniker: Tol2-medierad genmodifiering, riktade manipulering av genomet med CRISPR/Cas9 och överväldigande uttryck med hjälp av morpholinos. Dessa verktyg bör underlätta direkt undersökning av gener som ligger bakom variationen mellan surface - och grotta-bostad former.

Manipulation av geners funktion i mexikanska släktet

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Grottdjur ger ett övertygande system för att undersöka olika morfologiska, utvecklingsmässiga och beteendemässiga egenskaper. Men en av de begränsande faktorerna för att etablera detta modellsystem är en brist på genetiska verktyg som skulle tillåta oss att manipulera genfunktionen. Här visar vi tre olika tillvägagångssätt för att manipulera genfunktion i den mexikanska grottfisken, Astyanax mexicanus.Dessa verktyg kommer att möjliggöra undersökningen av de gener som ligger bakom naturliga variationer mellan ytfisk och grottfisk och hur de relaterar till fenotyper. Bethany Stahl, en begåvad postdoc i mitt laboratorium kommer att visa detta förfarande. Innan du börjar förfarandet, fyll en 100 milliliter Petri skålen med varma 3%agaros upplöst i fisk system vatten och försiktigt placera ett ägg injektion mögel i agaros i 45 graders vinkel, innan sakta sänka formen i agaros för att undvika att fånga luft under formen.När agarose har stelnat, försiktigt bort formen sedan lagra plattan på fyra grader Celsius i upp till en vecka. Dra sedan nålar från borosilikat glas kapillärer och en elektrod nål puller enligt tillverkarens riktlinjer. På dagen för injektionen, använd en glaspipett för att överföra encelliga ägg i injektionsplattan, fylla upp till fem rader av injektionsplattan med 30 till 40 ägg per rad.Håll äggen hydrerade med en liten mängd fisksystem vatten. Tina Morpholino på is och bered injektionslösningen så att 400 pikogram av Morpholino injiceras per ägg genom att använda en lång Microloader pipettspets eller lägga till en två till fyra microliter bolus till slutet. När alla nålar har laddats, använd tövjärtor för att trimma överskottslängden från injektionsnålsspetsarna och montera den första nålen till en mikromanipulator ansluten till en picoliter mikroinjector.Placera sedan injektionsfatet under ett dissekerande mikroskop och använd mikromanipulatorn för att penetrera varje ägg med nålen innan du injicerar en nanoliter av Morpholino-injektionslösning direkt i äggulan. För CRISPR-injektion, blanda 25 piogram av guide-RNA med 300 pikogram av CRISPR-associerat protein 9 messenger RNA och injicera två nanoliter av den resulterande RNA-lösningen i varje embryo som det visas. För Tol2 transposase och Tol2 flankerad plasmid injektion, kombinera 25 nanogram per mikroliter av Tol2 messenger RNA med 25 nanogram per mikroliter tol2 plasmid konstruera och fenol röd i RNase-fritt vatten.Injicera sedan en nanoliter lösning i varje embryo som just visats. För att screena de Morpholino-injicerade djuren vid fyra dagars efterinjektion, beroende på den gen av intresse, visualisera fisklarverna under ett stereomikroskop för att observera fenotypen av de injicerade djuren eller videoskivan för att mäta beteende. För att screena för CRISPR-indels, för över CRISPR-injicerade embryon i PCR-rör och extrahera DNA:t enligt vanliga DNA-extraktionsprotokoll för polymeraskedjereaktion eller PCR-analys.För att bedöma för mutagenes, kör fem mikroliter av PCR-produkten på en 3%agarosgel vid 70 volt i tre timmar. Vild-typ, icke-mutagenized DNA kommer att resultera i ett distinkt band, medan mutant DNA kommer att resultera i ett smeary band. Cave En mexicanus injiceras med en kontroll Morpholino uppvisar betydligt mer rörelseaktivitet och minskad sömn under en 24-timmarsperiod, jämfört med ytfisk injiceras med en förvrängd Morpholino.Injektionen av hypokretinmalxinet Morpholino har liten effekt på sömnen i ytfisk jämfört med kontrollinjicerad fisk. Däremot har hypocretin orexin knockdown via Morpholino injektion en betydande effekt på sömn i grotta-bostad fisk, vilket ger en direkt koppling mellan hypocretin orexin uttryck och sömnförlust. CRPSR-medierad mutagenes av albinism genen OCA2 i ytan fisk resulterar i vissa individer homozygous för vild-typ OCA2 positiv allel, och är associerad med hyser pigmentering, medan individer som har två kopior av CRISPR-muterade OCA2 negativ allel är albino, vilket ger en direkt koppling mellan den muterade OCA2 genen och albinism i grotta fisk.Välj F0:s positiva för den Överförda Tol2-transgenen till ryggkorset till vildtypen för att generera stabila F1-linjer. Detta möjliggör levande kalcium avbildning för att avslöja skillnader i neuronal aktivitet, medla beteendeförändringar i grottan miljön, lägga grunden för uttryck av många ytterligare transgener att karakterisera och manipulera genfunktion i A mexicanus. De viktigaste sakerna att komma ihåg är att ladda äggen tätt på plattan, att trimma nålen ordentligt, och att optimera microinjection.Efter en lyckad genetisk knockdown, transgen integration, eller CRISPR-medierad genredigering, dessa fiskar kan användas för utvecklingsmässiga, beteendemässiga och hjärnans aktivitet analyser.

manipulation-of-gene-function-in-mexican-cavefish

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Genetics

Evolution

Evolutionary History

SCIENTISTS IN ACTION

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the replacement of the entire gene with a selectable marker via homologous recombination. During homologous recombination, exchange of DNA takes place between sequences with high similarity. Therefore, linear genomic sequences flanking a target gene can be used to specifically direct a selectable marker to the desired integration site. Blunt ends of the deletion construct activate the cell&#39;s DNA repair systems and thereby promote integration of the construct either via homologous recombination or by non-homologous-end-joining. In organisms with efficient homologous recombination, the rate of successful gene deletion can reach more than 50% making this strategy a valuable gene disruption system. The smut fungus Ustilago maydis is a eukaryotic model microorganism showing such efficient homologous recombination. Out of its about 6,900 genes, many have been functionally characterized with the help of deletion mutants, and repeated failure of gene replacement attempts points at essential function of the gene. Subsequent characterization of the gene function by tagging with fluorescent markers or mutations of predicted domains also relies on DNA exchange via homologous recombination. Here, we present the U. maydis strain generation strategy in detail using the simplest example, the gene deletion.

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

We describe a robust gene replacement strategy to genetically manipulate the smut fungus Ustilago maydis. This protocol explains how to generate deletion mutants to investigate infection phenotypes. It can be extended to modify genes in any desired way, e.g., by adding a sequence encoding a fluorescent protein tag.

Genmanipulation av växtpatogen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Att studera Svamp biologi och växt mikrobinteraktioner

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

Parallell Mätning av dygnsrytm klocka genuttryck och hormon i mänskliga primära cellkulturer

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

Uppfödning och dubbelsträngade RNA-medierad Gene Knockdown i Hide Beetle,<em&gt; Rävänger</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

En standardmetod att undersöka Hotellets mutagenicitet som en funktion av punktmutation reparation katalyseras av CRISPR/Cas9 och SsODN i mänskliga celler

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in which the gene of interest has been disrupted. A gene-disruption DNA construct containing a suitable antibiotic resistance marker gene is useful for the generation of gene-disrupted strains in bacteria. However, conventional construction methods, which require gene cloning steps, involve complex and time-consuming protocols. Here, a relatively facile, rapid, and cost-effective method for targeted gene disruption in Streptococcus mutans is described. The method utilizes a 2-step fusion polymerase chain reaction (PCR) to generate the disruption construct and electroporation for genetic transformation. This method does not require an enzymatic reaction, other than PCR, and additionally offers greater flexibility in terms of the design of the disruption construct. Employment of electroporation facilitates the preparation of competent cells and improves the transformation efficiency. The present method may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

We describe a facile, rapid, and relatively inexpensive method for the generation of gene-disrupted Streptococcus mutans strains; this technique may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Generation av en gen-stört Streptococcus mutans stam utan genen kloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has been associated with both the progression of cancer and the development of drug resistance. Until now, it has not been feasible to easily manipulate the ploidy of a multicellular animal without generating mostly sterile progeny. Presented here is a simple and rapid protocol for generating tetraploid Caenorhabditis elegans animals from any diploid strain. This method allows the user to create a bias in chromosome segregation during meiosis, ultimately increasing ploidy in C. elegans. This strategy relies on the transient reduction of expression of the rec-8 gene to generate diploid gametes. A rec-8 mutant produces diploid gametes that can potentially produce tetraploids upon fertilization. This tractable scheme has been used to generate tetraploid strains carrying mutations and chromosome rearrangements to gain insight into chromosomal dynamics and interactions during pairing and synapsis in meiosis. This method is efficient for generating stable tetraploid strains without genetic markers, can be applied to any diploid strain, and can be used to derive triploid C. elegans. This straightforward method is useful for investigating other fundamental biological questions relevant to genome instability, gene dosage, biological scaling, extracellular signaling, adaptation to stress, development of resistance to drugs, and mechanisms of speciation.

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

This method allows for the generation of tetraploid and triploid Caenorhabditis nematodes from any diploid strain. Polyploid strains generated by this method have been used to study chromosome interactions in meiotic prophase, and this method is useful for examining important basic questions in cell, developmental, evolutionary, and cancer biology.

Manipulation av ploiditeten i Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

Använda mus oocyter att bedöma mänskliga geners funktion under meios jag

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and organs. The O9-1 cell line is derived from the endogenous mouse embryonic NCCs and maintains its multipotency. However, under specific culture conditions, O9-1 cells can differentiate into different cell types and be utilized in a wide range of research applications. Recently, with the combination of mouse studies and O9-1 cell studies, we have shown that the Hippo signaling pathway effectors Yap and Taz play important roles in neural crest-derived craniofacial development. Although the culturing process for O9-1 cells is more complicated than that used for other cell lines, the O9-1 cell line is a powerful model for investigating NCCs in vitro. Here, we present a protocol for culturing the O9-1 cell line to maintain its stemness, as well as protocols for differentiating O9-1 cells into different cell types, such as smooth muscle cells and osteoblasts. In addition, protocols are described for performing gene loss-of-function studies in O9-1 cells by using CRISPR-Cas9 deletion and small interfering RNA-mediated knockdown.

O9-1 is a multipotent mouse neural crest cell line. Here we describe detailed step-by-step protocols for culturing O9-1 cells, differentiating O9-1 cells into specific cell types, and genetically manipulating O9-1 cells by using siRNA-mediated knockdown or CRISPR-Cas9 genome editing.

Odling och manipulering av O9-1 Neural Crest celler

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and ...

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult forms has revealed the genetic basis of some of these differences. Less is known about how the populations differ at post-larval stages (at the onset of feeding). Such studies may provide insight into how cavefish survive through adulthood in their natural environment. Methods for comparing post-larval development in the laboratory require standardized aquaculture and feeding regimes. Here we describe how to raise fish on a diet of nutrient-rich rotifers in non-recirculating water for up to two-weeks post fertilization. We demonstrate how to collect post-larval fish from this nursery system and perform whole-mount immunostaining. Immunostaining is an attractive alternative to transgene expression analysis for investigating development and gene function in A. mexicanus. The nursery method can also be used as a standard protocol for establishing density-matched populations for growth into adults.

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

In this protocol, we demonstrate how to breed Astyanax mexicanus adults, raise the larvae, and perform whole-mount immunohistochemistry on post-larval fish to compare the phenotypes of surface and cave morphotypes.

Att höja den mexikanska Tetra Astyanax mexicanus för analys av Post-larval fenotyper och hela-mount immunohistokemi

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for reversible and tunable expression control of an endogenous gene of interest in living model systems. The REMOTE-control system employs enhanced lac repression and tet activation systems to achieve down- or upregulation of a target gene within a single biological system. Tight repression can be achieved from repressor binding sites flexibly located far downstream of a transcription start site by inhibiting transcription elongation. Robust upregulation can be attained by enhancing the transcription of an endogenous gene by targeting tet transcriptional activators to the cognate promoter. This reversible and tunable expression control can be applied and withdrawn repeatedly in organisms. The potency and versatility of the system, as demonstrated for endogenous Dnmt1 here, will allow more precise in vivo functional analyses by enabling investigation of gene function at various expression levels and by testing the reversibility of a phenotype.

This protocol outlines the steps needed to generate a model system in which the transcription of an endogenous gene of interest can be conditionally controlled in live animals or cells using enhanced lac repressor and/or tet activator systems.

In vivo tillämpning av systemet med fjärrkontroll för Manipulation av endogena genuttrycket

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...