Name: manipulation of gene function in mexican cavefish
Uploaded: 2019-04-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish at JoVE.com

Yazarlar Sunishka Thakur onun yardımı Genotipleme ve Şekil 2' de tasvir oca2 mutant balık görüntüleme için teşekkür ederiz. Bu eser Ulusal Bilim Vakfı (NSF) Ödülü 1656574 A.C.K. için NSF Ödülü 1754321 JK ve A.C.K. ve ulusal kurumları Sağlık (NIH) Ödülü R21NS105071 A.C.K. ve E.R.D. tarafından desteklenmiştir

1. Morpholino oligo tasarım
Not: A. mexicanus dizileri Ensembl genom tarayıcı (https://www.ensembl.org) yanı sıra, ulusal biyoteknoloji Merkezi bilgi (NCBI) gen ve NCBI SRA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) aracılığıyla kullanılabilir. Bir morpholino kullanılmak üzere her iki yüzeyi ve mağaralarda yaşayan formu tasarlarken, bu aşamada, bu genetik bölgeleri olarak morpholinos için hedefler önlenebilir bu yüzden morphs arasında herhangi bir genetik varyasyon belirlemek i...

Burada, morpholinos, CRISPR/Cas9 gen düzenleme ve transgenesis metodoloji kullanarak gen işlevini değiştirmek için bir metodoloji verdiğimiz. Genetik teknoloji zenginliği ve Zebra balığı bu sistem optimizasyonu büyük olasılıkla bu araçlar kolaylığı52ile transfer içine A. mexicanus sağlayacaktır. Son bulgular-si olmak kullanılmış bu yaklaşımlar A. mexicanusama bu sistem30,36,<sup class=...

Darwin'in Türlerin kökeni1beri bilim adamları nasıl özellikleri örümceklerle yanıt olarak tanımlanan çevre ve ekolojik baskılar, mağara organizmalar2sayesinde şeklinde içine derin anlayışlar kazandı. Nehirler boyunca Meksika ve Güney Teksas yaşayan gözlü atalarının 'yüzey' nüfus ve coğrafi olarak izole olasılığını en az 29: Sierra del Abra yaşayan türetilen mağara morphs Meksika tetra, A. mexicanus, oluşur ve diğer alanlarda kuzeydoğu Meksika3. Mağara ilişkili özellikleri bir dizi de dahil olmak üzere değiştirilmiş oksijen tüketimi, depigmentasyon, gözleri kaybı ve beslenme ve davranış4,5,6yiyecek arama değişmiş A. mexicanusiçinde tespit edilmiştir, 7,8,9. A. mexicanus sunar iyi tanımlanmış bir evrimsel geçmişi, ekolojik çevre detaylı karakterizasyonu ve varlığı nedeniyle yakınsak evrim mekanizmaları bağımsız soruşturma için güçlü bir model mağara gelişti nüfus10,11. Birçok göz kaybı da dahil olmak üzere cavefish içinde bulunması, kaybı uyku, beslenme, okul kaybı arttı, saldırganlık, azaltılmış ve stres yanıt azaltılmış, birden çok kez kez kullanan bağımsız kökenleri ile geliştiğini mağara kaynaklı özellikleri farklı genetik yolları arasında8,12,13,14,15mağaralar. Bu evrim A. mexicanus sistemi, güçlü bir yönüdür ve daha genel bir soru nasıl genetik sistemlerinin içgörü benzer fenotipleri oluşturmak için üzgün sağlayabilir tekrar.
Gen fonksiyonu mekanik incelenmesi için genetik teknolojisi uygulama ( A. mexicanusde dahil olmak üzere) birçok balık türlerinin sınırlı iken, Zebra balığı son gelişmeler genetik teknoloji geliştirme balık için bir temel sağlar 16,17,18,19,20. Çok sayıda araç içinde Zebra balığı gen ekspresyonu işlemek için yaygın olarak kullanılan ve bu yordamları uygulanması uzun standart hale. Örneğin, morpholino oligos (MOs) enjeksiyon tek hücreli aşamada seçerek RNA engeller ve geliştirme21,22sırasında kısa bir zamansal pencere için çeviri engeller. Buna ek olarak, yaklaşımlar, gen düzenleme gibi düzenli olarak kümelenmiş interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) / CRISPR ilişkili protein 9 (Cas9) ve transkripsiyon harekete geçirmek gibi efektör nükleaz (TALEN), tanımlanmış silme üretimi için izin ya da bazı durumlarda, eklemeler bir rekombinasyon genleri19,20,23,24içinde aracılığıyla. Transgenesis kararlı gen ifade veya işlev bir hücre tipi belirli şekilde işlemek için kullanılır. Tol2 sistemi transposase coinjecting tarafından Transjenik hayvanlar oluşturmak için kullanıldığı ve etkili biçimde mRNA bir transgene25,26içeren bir Tol2 DNA plazmid ile. Tol2 sistemi medaka transgenik construct17 istikrarlı germline eklemeler oluşturmak için Tol2 transposase kullanır. Tol2 transgenics üreten Tol2 entegrasyon siteleri ve mRNA ile Tol2 transposase17için çekilmiş bir transgene içeren bir plazmid coinjecting içerir. Bu sistem içinde Zebra balığı transgenik çizgiler bir dizi oluşturmak için kullanılan ve kullanımı son zamanlarda cichlidleri, killifish, stickleback de dahil olmak üzere ek acil sistemleri modellemek için genişletti ve daha yakın zamanlarda, Meksika cavefish27, 28,29,30.
Cavefish özelliği evrim elucidating mekanizmaları için büyüleyici bir biyolojik sistem olmakla birlikte, tam kapasitesini evrimsel bir model olarak tamamen harnessed değil. Bu kısmen genetik işlemek için bir yetersizlik nedeniyle olmuştur ve hücresel işlev doğrudan31. Karmaşık özellikleri düzenleyen aday genler nicel özellik loci (QTL) çalışmaları kullanarak tespit edilmiştir, ama bu aday genler doğrulanmasını zor32,33,34oldu. Son zamanlarda, morpholinos, CRISPR ve TALEN sistemleri ve Tol2kullanımı kullanarak düzenleme gen kullanarak geçici nakavt-aracılı transgenesis özellikleri35,36,37 sayısı altta yatan genetik temeli araştırmak için kullanılmıştır ,38. Uygulama ve standardizasyon bu tekniklerin gen işlev tanımlı hücre nüfus, etiketleme, manipülasyon dahil olmak üzere biyolojik özellikleri, moleküler ve sinirsel temelleri sorguya manipülasyonlar için izin verir ve fonksiyonel gazeteciler ifade. Başarılı uygulama gen veya hücresel fonksiyon işlemek için bu genetik araçların acil modeli sistemlerinde gösterdi ise detaylı iletişim kuralları hala A. mexicanusiçinde eksik.
A. mexicanus yanıt olarak değişen ortamın evrim mekanizmaları kritik içgörü sağlamak ve yeni genlerin farklı özellikleri düzenleyen tanımlamak için fırsat sunuyoruz. Bir dizi faktöre A. mexicanus kurulan genomik araçları kolayca balık laboratuvarları, büyük damızlık boy korumak yeteneği de dahil olmak üzere kurulan genetik modellerinde, mevcut uygulamak için son derece uysal bir model olduğunu gösteriyor, şeffaflık, sıralı genom ve tanımlı davranış deneyleri39. Burada, morpholinos, transgenesis ve A. mexicanusyüzey ve mağara nüfus gen düzenleme kullanımı için bir metodoloji açıklayın. A. mexicanus bu araçların daha geniş uygulama cavefish ve yüzey balık gelişimsel, fizyolojik ve davranışsal farklılıkları evrimi temel moleküler süreçleri mekanik bir soruşturma için izin verir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1025px;" width="1025">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fish breeding &#38; egg supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fine mesh fish net</td>
			<td style="width:196px;">Penn Plax</td>
			<td style="width:191px;">BN4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fish tank heater</td>
			<td style="width:196px;">Aqueon</td>
			<td style="width:191px;">100106108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Egg traps</td>
			<td style="width:196px;">Custom made</td>
			<td style="width:191px;">NA</td>
			<td>Design and create plastic grate to place at bottom of tank to protect eggs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass pipettes</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette bulbs</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">03-448-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Egg molds</td>
			<td style="width:196px;">Adaptive Science Tools</td>
			<td style="width:191px;">TU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Morpholino supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Control Morpholino</td>
			<td style="width:196px;">Gene Tools, LLC</td>
			<td style="width:191px;">Standard control olio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Custom Morpholino</td>
			<td style="width:196px;">Gene Tools, LLC</td>
			<td style="width:191px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenol Red</td>
			<td style="width:196px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">P0290-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CRISPR supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cas9 Plasmid</td>
			<td style="width:196px;">AddGene</td>
			<td style="width:191px;">46757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GoTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:196px;">Promega</td>
			<td style="width:191px;">M3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KOD Hot Start Taq</td>
			<td style="width:196px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:191px;">71-842-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Primers</td>
			<td style="width:196px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:191px;">Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T7 Megascript Kit</td>
			<td style="width:196px;">Ambion/Thermofisher</td>
			<td style="width:191px;">AM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">miRNeasy Kit</td>
			<td style="width:196px;">Qiagen</td>
			<td style="width:191px;">217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mMessage mMachine T3 kit</td>
			<td style="width:196px;">Ambion/Thermofisher</td>
			<td style="width:191px;">AM1348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MinElute Kit</td>
			<td style="width:196px;">Qiagen</td>
			<td style="width:191px;">28204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tol2 transgenesis supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pCS-zT2TP plasmid</td>
			<td style="width:196px;">Kawakami et al., 2004</td>
			<td style="width:191px;">Request from senior author</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CutSmart Buffer</td>
			<td style="width:196px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:191px;">B7204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NotI-HF Restriction Enzyme</td>
			<td style="width:196px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:191px;">R3189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PCR purification Kit</td>
			<td style="width:196px;">Qiagen</td>
			<td style="width:191px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SP6 mMessenger Kit</td>
			<td style="width:196px;">Ambion/Thermofisher</td>
			<td style="width:191px;">AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microinjection supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass Capillary Tubes</td>
			<td style="width:196px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:191px;">BF100-58-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette puller</td>
			<td style="width:196px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:191px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Picoinjector</td>
			<td style="width:196px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:191px;">PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:196px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:191px;">M3301R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micromanipulator Stand</td>
			<td style="width:196px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:191px;">M10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micmanipulator Base</td>
			<td style="width:196px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:191px;">Steel Plate Base, 10 lbs</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manipulation of gene function in mexican cavefish

Mağara hayvanlar evrimsel mekanizmaları ve göz dejenerasyon, albinizm, uyku kaybı, hyperphagia ve duyusal işleme de dahil olmak üzere çok sayıda karmaşık özellikleri değişiklikleri altta yatan genetik Üsler araştırıyor için zorlayıcı bir sistemi sağlar. Dünyanın dört bir yanından cavefish türün morfolojik ve davranışsal özelliklerin farklı mağara sistemleri arasında paylaşılan çevresel baskılar nedeniyle bir yakınsak evrim görüntüler. Çeşitli mağara tür laboratuvar ortamında inceledik. Meksika tetra, Astyanax mexicanus, kör ve görme biçimleri, karmaşık özellikleri evrimi temel biyolojik ve moleküler süreçlerini benzersiz anlayışlar sağlamıştır ve gelişmekte olan bir modeli sistemi olarak iyi hazır. Farklı biyolojik süreçlerin evrimi düzenleyen aday genler A. mexicanus tespit edilen süre, bir rol bireysel genler için doğrulamak için yeteneği sınırlandırılmış durumda. Transgenesis ve gen düzenleme teknoloji uygulanması önemli bu engeli aşmak için ve karmaşık özellikleri evrimi temel mekanizmaları incelemek için potansiyele sahiptir. Burada, A. mexicanusgen ifade değiştirmek için farklı bir metodoloji açıklayın. Morpholinos, Tol2 transgenesis, kullanımı bir yaklaşım içerir ve gen düzenleme sistemleri, yaygın olarak kullanılan Zebra balığı ve diğer balık modelleri, A. mexicanusişlevinde gen işlemek için. Bu protokollerin ayrıntılı açıklamalar için zamanlanmış üreme yordamlar, döllenmiş yumurta, iğne ve genetiği değiştirilmiş hayvanlar yelpazesi topluluğu içerir. Bu yöntembilimsel yaklaşımlar çeşitli özellikleri A. mexicanusevrimi altta yatan genetik ve sinirsel mekanizmalar incelenmesi için izin verir.

Mağaralarda yaşayan A. mexicanus birden fazla nüfus az uyku ve onların yüzey-konut conspecifics14göre artan uyanıklık/etkinlik gösterir. Hipokretin/Oreksin (HCRT) anestezi (film) artırmak için davranır, son derece korunmuş bir peptit ve HCRT yolu anomalileri Narkolepsi insanlar ve diğer memeliler47,48neden. Daha önce o mağaranın göstermiştir A. mexicanus bu peptid artan bir ifade cavefish<sup class="xre...

Watch this Scientific Journal Video about Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish at JoVE.com

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Evrimsel modeli sistem Astyanax mexicanusgenler manipülasyon yaklaşımları açıklar. Üç farklı teknikler açıklanmıştır: Tol2-aracılı transgenesis, CRISPR/Cas9 ve nakavt morpholinos kullanarak ifade kullanarak genom hedeflenen manipülasyon. Bu araçları doğrudan soruşturma yüzey ve mağaralarda yaşayan biçimler arasında varyasyon yatan genlerin kolaylaştıracaktır.

Meksika Cavefish işlevinde Gene manipülasyon

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Mağara hayvanları çeşitli morfolojik, gelişimsel ve davranışsal özellikleri araştırmak için zorlayıcı bir sistem sağlar. Ama bu model sisteminin kurulmasında sınırlayıcı faktörlerden biri gen fonksiyonlarını manipüle etmemizi sağlayacak genetik araçların eksikliğidir. Burada Meksika mağara balığı Astyanax mexicanus'ta gen fonksiyonlarını manipüle etmek için üç farklı yaklaşım gösteriyoruz.Bu araçlar, yüzey balıkları ve mağara balıkları arasındaki doğal varyasyonların altında yatan genlerin ve bunların fenotiplerle nasıl ilişkili olduğunu araştırmanızı sağlayacaktır. Bethany Stahl, laboratuvarımda yetenekli bir doktora sonrası bu prosedürü gösterecek. İşleme başlamadan önce, 100 mililitrelik Petri kabını balık sistemi suyunda çözünmüş sıcak %3 agarose ile doldurun ve kalıbın altında ki havayı yakalamamak için kalıbı yavaşça agarose'a indirmeden önce agarose'a dikkatlice bir yumurta enjeksiyon kalıbı yerleştirin.Agarose katılaşmış olduğunda, dikkatlice kalıp çıkarın ve bir hafta kadar dört derece santigrat plaka saklayın. Daha sonra borosilikat cam kılcal damarlardan iğneleri ve üreticinin yönergelerine göre bir elektrot iğnesi çekmecesini çekin. Enjeksiyon günü, tek hücreli yumurtaları enjeksiyon plakasına aktarmak için cam bir pipet kullanın, enjeksiyon plakasının beş sırasını satır başına 30 ila 40 yumurta ile doldurun.Balık sistemi su küçük bir miktar ile sulu yumurta tutun. Buz üzerinde Morpholino'yu eritin ve enjeksiyon çözeltisini hazırlayın, böylece 400 pikogram Morpholino yumurta başına uzun bir Microloader pipet ucu kullanılarak veya sonuna iki ila dört mikrolitre lik bir bolu ekleyerek enjekte edilir. Tüm iğneler yüklendiğinde, enjeksiyon iğne uçlarından fazla uzunluğu kesmek için forcep kullanın ve ilk iğneyi pikolitre mikroenjektöre bağlı bir mikromanipülatöre monte edin.Daha sonra, bir diseksiyon mikroskobu altında enjeksiyon çanak yerleştirin ve doğrudan sarısı içine Morpholino enjeksiyon çözeltisi bir nanolitre enjekte etmeden önce iğne ile her yumurta nüfuz mikromanipülatör kullanın. CRISPR enjeksiyonu için, 25 pikogram kılavuz RNA'yı CRISPR ile ilişkili protein 9 messenger RNA'nın 300 pikogramı ile karıştırın ve ortaya çıkan RNA çözeltisinin iki nanolitresini gösterildiği gibi her embriyoya enjekte edin. Tol2 transposaz ve Tol2 kanatlı plazmid enjeksiyonu için, Tol2 messenger RNA'nın mikrolitre başına 25 nanogramını Tol2 plazmid yapının mikrolitresine 25 nanogram ve RNase içermeyen suda fenol kırmızısı ile birleştirin.Sonra her embriyoya az önce gösterildiği gibi bir nanolitre çözelti enjekte edin. Morpholino enjekte edilen hayvanları enjeksiyondan dört gün sonra, ilgi genine bağlı olarak taramak için, balık larvalarını stereo mikroskop altında görselleştirerek enjekte edilen hayvanların fenotipini veya davranışı ölçmek için video kaydını gözlemleyin. CRISPR indels için tarama için, PCR tüpler içine CRISPR enjekte embriyolar transfer ve polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR analizi için standart DNA çıkarma protokolleri uyarınca DNA ayıklamak.Mutagenez değerlendirmek için, üç saat boyunca 70 volt bir% 3 agarose jel pcr ürün beş mikrolitre çalıştırın. Yabani tip, mutajenize olmayan DNA farklı bir bantla sonuçlanırken mutant DNA smeary bandıile sonuçlanır. Mağara Bir mexicanus bir kontrol Morpholino ile enjekte önemli ölçüde daha fazla lokomotor aktivite sergiler ve 24 saatlik bir süre içinde azaltılmış uyku, bir şifreli Morpholino ile enjekte yüzey balık ile karşılaştırıldığında.Hipokretin oreksin Morpholino enjeksiyonu kontrol enjekte balık ile karşılaştırıldığında yüzey balık uyku üzerinde çok az etkisi vardır. Buna karşılık, Morpholino enjeksiyonu ile hipokretin oreksin nakavt mağara da yaşayan balık uyku üzerinde önemli bir etkisi vardır, hipokretin oreksin ekspresyonu ve uyku kaybı arasında doğrudan bir bağlantı sağlayan. Yüzey balıklarında albinizm geni OCA2'nin CRPSR aracılı mutagenezi bazı bireylerin yabani tip OCA2 pozitif alel için homozigot olarak sonuçlanmasına neden olur ve pigmentasyon barındırma ile ilişkilidir, OYSA CRISPR mutasyona uğramış OCA2 negatif alelin iki kopyasına sahip bireyler albinodur, mağara balıklarında mutant OCA2 geni ile albinizm arasında doğrudan bir bağlantı sağlar.Kararlı F1 çizgileri oluşturmak için tol2 iletilmiş transgeni niçin yabani tipe arkadan çapraz olarak F0 pozitif'ini seçin. Bu, nöronal aktivitedeki farklılıkları ortaya çıkarmak, mağara ortamındaki davranış değişikliklerine aracılık etmek, a mexicanus'taki gen fonksiyonunu karakterize etmek ve işlemek için birçok ek transgenin ekspresyonuna zemin hazırlamak için canlı kalsiyum görüntülemeyi sağlar. Hatırlanması gereken en önemli şey yumurtaları sıkıca tabağa yüklemek, iğneyi düzgün kesmek ve mikroenjeksiyonu optimize etmektir.Başarılı bir genetik nakavt, transgen entegrasyonu veya CRISPR aracılı gen düzenleme sonra, bu balık gelişimsel, davranışsal ve beyin aktivitesi analizleri için kullanılabilir.

manipulation-of-gene-function-in-mexican-cavefish

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Genetics

Evolution

Evolutionary History

SCIENTISTS IN ACTION

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the replacement of the entire gene with a selectable marker via homologous recombination. During homologous recombination, exchange of DNA takes place between sequences with high similarity. Therefore, linear genomic sequences flanking a target gene can be used to specifically direct a selectable marker to the desired integration site. Blunt ends of the deletion construct activate the cell&#39;s DNA repair systems and thereby promote integration of the construct either via homologous recombination or by non-homologous-end-joining. In organisms with efficient homologous recombination, the rate of successful gene deletion can reach more than 50% making this strategy a valuable gene disruption system. The smut fungus Ustilago maydis is a eukaryotic model microorganism showing such efficient homologous recombination. Out of its about 6,900 genes, many have been functionally characterized with the help of deletion mutants, and repeated failure of gene replacement attempts points at essential function of the gene. Subsequent characterization of the gene function by tagging with fluorescent markers or mutations of predicted domains also relies on DNA exchange via homologous recombination. Here, we present the U. maydis strain generation strategy in detail using the simplest example, the gene deletion.

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

We describe a robust gene replacement strategy to genetically manipulate the smut fungus Ustilago maydis. This protocol explains how to generate deletion mutants to investigate infection phenotypes. It can be extended to modify genes in any desired way, e.g., by adding a sequence encoding a fluorescent protein tag.

Bitki patojeni olarak genetik manipülasyonu<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Mantar Biyoloji ve Bitki Mikrop Etkileşimleri Eğitim için

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Genetik

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

İnsan Primer Hücre Kültürleri içinde Sirkadyen Saat Gen İfade ve Hormon salgısını Paralel Ölçümü

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

Yetiştirme ve Gizle böcek RNA aracılı gen demonte çift sarmallı,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

Yerinde mutagenisitesinin CRISPR/Cas9 ve SsODN insan hücrelerinde tarafından katalize nokta mutasyon onarım bir fonksiyonu olarak incelemek için standart bir metodoloji

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in which the gene of interest has been disrupted. A gene-disruption DNA construct containing a suitable antibiotic resistance marker gene is useful for the generation of gene-disrupted strains in bacteria. However, conventional construction methods, which require gene cloning steps, involve complex and time-consuming protocols. Here, a relatively facile, rapid, and cost-effective method for targeted gene disruption in Streptococcus mutans is described. The method utilizes a 2-step fusion polymerase chain reaction (PCR) to generate the disruption construct and electroporation for genetic transformation. This method does not require an enzymatic reaction, other than PCR, and additionally offers greater flexibility in terms of the design of the disruption construct. Employment of electroporation facilitates the preparation of competent cells and improves the transformation efficiency. The present method may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

We describe a facile, rapid, and relatively inexpensive method for the generation of gene-disrupted Streptococcus mutans strains; this technique may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Nesil bir gen kesintiye Streptococcus mutans çoğunlukla zorlanma olmadan Gen Klonlama

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has been associated with both the progression of cancer and the development of drug resistance. Until now, it has not been feasible to easily manipulate the ploidy of a multicellular animal without generating mostly sterile progeny. Presented here is a simple and rapid protocol for generating tetraploid Caenorhabditis elegans animals from any diploid strain. This method allows the user to create a bias in chromosome segregation during meiosis, ultimately increasing ploidy in C. elegans. This strategy relies on the transient reduction of expression of the rec-8 gene to generate diploid gametes. A rec-8 mutant produces diploid gametes that can potentially produce tetraploids upon fertilization. This tractable scheme has been used to generate tetraploid strains carrying mutations and chromosome rearrangements to gain insight into chromosomal dynamics and interactions during pairing and synapsis in meiosis. This method is efficient for generating stable tetraploid strains without genetic markers, can be applied to any diploid strain, and can be used to derive triploid C. elegans. This straightforward method is useful for investigating other fundamental biological questions relevant to genome instability, gene dosage, biological scaling, extracellular signaling, adaptation to stress, development of resistance to drugs, and mechanisms of speciation.

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

This method allows for the generation of tetraploid and triploid Caenorhabditis nematodes from any diploid strain. Polyploid strains generated by this method have been used to study chromosome interactions in meiotic prophase, and this method is useful for examining important basic questions in cell, developmental, evolutionary, and cancer biology.

Caenorhabditis elegans Ploitlik manipülasyon

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

Mayoz sırasında insan gen işlevini değerlendirmek için fare yumurta kullanarak ben

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and organs. The O9-1 cell line is derived from the endogenous mouse embryonic NCCs and maintains its multipotency. However, under specific culture conditions, O9-1 cells can differentiate into different cell types and be utilized in a wide range of research applications. Recently, with the combination of mouse studies and O9-1 cell studies, we have shown that the Hippo signaling pathway effectors Yap and Taz play important roles in neural crest-derived craniofacial development. Although the culturing process for O9-1 cells is more complicated than that used for other cell lines, the O9-1 cell line is a powerful model for investigating NCCs in vitro. Here, we present a protocol for culturing the O9-1 cell line to maintain its stemness, as well as protocols for differentiating O9-1 cells into different cell types, such as smooth muscle cells and osteoblasts. In addition, protocols are described for performing gene loss-of-function studies in O9-1 cells by using CRISPR-Cas9 deletion and small interfering RNA-mediated knockdown.

O9-1 is a multipotent mouse neural crest cell line. Here we describe detailed step-by-step protocols for culturing O9-1 cells, differentiating O9-1 cells into specific cell types, and genetically manipulating O9-1 cells by using siRNA-mediated knockdown or CRISPR-Cas9 genome editing.

Kültür ve manipülasyon O9-1 nöral Crest hücre

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and ...

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult forms has revealed the genetic basis of some of these differences. Less is known about how the populations differ at post-larval stages (at the onset of feeding). Such studies may provide insight into how cavefish survive through adulthood in their natural environment. Methods for comparing post-larval development in the laboratory require standardized aquaculture and feeding regimes. Here we describe how to raise fish on a diet of nutrient-rich rotifers in non-recirculating water for up to two-weeks post fertilization. We demonstrate how to collect post-larval fish from this nursery system and perform whole-mount immunostaining. Immunostaining is an attractive alternative to transgene expression analysis for investigating development and gene function in A. mexicanus. The nursery method can also be used as a standard protocol for establishing density-matched populations for growth into adults.

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

In this protocol, we demonstrate how to breed Astyanax mexicanus adults, raise the larvae, and perform whole-mount immunohistochemistry on post-larval fish to compare the phenotypes of surface and cave morphotypes.

Meksika Tetra Astyanax mexicanus analiz Post-larval fenotipleri ve bütün Dağı immünhistokimya için yetiştirme

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for reversible and tunable expression control of an endogenous gene of interest in living model systems. The REMOTE-control system employs enhanced lac repression and tet activation systems to achieve down- or upregulation of a target gene within a single biological system. Tight repression can be achieved from repressor binding sites flexibly located far downstream of a transcription start site by inhibiting transcription elongation. Robust upregulation can be attained by enhancing the transcription of an endogenous gene by targeting tet transcriptional activators to the cognate promoter. This reversible and tunable expression control can be applied and withdrawn repeatedly in organisms. The potency and versatility of the system, as demonstrated for endogenous Dnmt1 here, will allow more precise in vivo functional analyses by enabling investigation of gene function at various expression levels and by testing the reversibility of a phenotype.

This protocol outlines the steps needed to generate a model system in which the transcription of an endogenous gene of interest can be conditionally controlled in live animals or cells using enhanced lac repressor and/or tet activator systems.

Uzaktan kumandalı sistem in vivo uygulama için işleme endojen gen ekspresyonu

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...