Name: mimicking and manipulating pancreatic acinar-to-ductal metaplasia in 3-dimensional cell culture
Uploaded: 2019-02-11T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture at JoVE.com

هذا العمل كان تدعمها منحة R01 (CA200572) من المعاهد الوطنية للصحة إلى س. المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعهد الوطني للسرطان أو الممولين لم يكن لها دور في "المعاهد الوطنية أجرت" دراسة تصميم وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر، أو إعداد المخطوطة.

وأقر جميع أعمال الحيوان IACUC عيادة مايو كلينيك.
1-إعداد مواد وحلول وقواعد مصفوفة ثلاثية الأبعاد
<ol><li>خفض 500 ميكرومتر و 105 ميكرون تنسجم والبولي بروبيلين إلى 76 ملم بالساحات 76 ملم. أمثال كل مربع نصف مرتين لإنشاء ساحة صغيرة مطوية. مكان واحد 500 ميكرومتر وميكرومتر واحد 105 مش مربعة في ?...

<ol>
	<li>Rooman, I., Real, F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+ductal+adenocarcinoma+and+acinar+cells:+a+matter+of+differentiation+and+development.">Pancreatic ductal adenocarcinoma and acinar cells: a matter of differentiation and development.</a> Gut. 61 (3), 449-458 (2012).</li><li>Stanger, B. Z., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+identity+in+pancreas+development+and+regeneration.">Control of cell identity in pancreas development and regeneration.</a> Gastroenterology. 144 (6), 1170-1179 (2013).</li><li>Caldas, C., Kern, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K-ras+mutation+and+pancreatic+adenocarcinoma.">K-ras mutation and pancreatic adenocarcinoma.</a> International Journal of Pancreatology. 18 (1), 1-6 (1995).</li><li>Kopp, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Sox9-dependent+acinar-to-ductal+reprogramming+as+the+principal+mechanism+for+initiation+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).</li><li>Morris, J. P. t., Cano, D. A., Sekine, S., Wang, S. C., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-catenin+blocks+Kras-dependent+reprogramming+of+acini+into+pancreatic+cancer+precursor+lesions+in+mice.">Beta-catenin blocks Kras-dependent reprogramming of acini into pancreatic cancer precursor lesions in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (2), 508-520 (2010).</li><li>Grippo, P. J., Nowlin, P. S., Demeure, M. J., Longnecker, D. S., Sandgren, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preinvasive+pancreatic+neoplasia+of+ductal+phenotype+induced+by+acinar+cell+targeting+of+mutant+Kras+in+transgenic+mice.">Preinvasive pancreatic neoplasia of ductal phenotype induced by acinar cell targeting of mutant Kras in transgenic mice.</a> Cancer Research. 63 (9), 2016-2019 (2003).</li><li>Sawey, E. T., Johnson, J. A., Crawford, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+7+controls+pancreatic+acinar+cell+transdifferentiation+by+activating+the+Notch+signaling+pathway.">Matrix metalloproteinase 7 controls pancreatic acinar cell transdifferentiation by activating the Notch signaling pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19327-19332 (2007).</li><li>Liou, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-secreted+cytokines+drive+pancreatic+acinar-to-ductal+metaplasia+through+NF-kappaB+and+MMPs.">Macrophage-secreted cytokines drive pancreatic acinar-to-ductal metaplasia through NF-kappaB and MMPs.</a> Journal of Cell Biology. 202 (3), 563-577 (2013).</li><li>De La, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+and+Kras+reprogram+pancreatic+acinar+cells+to+ductal+intraepithelial+neoplasia.">Notch and Kras reprogram pancreatic acinar cells to ductal intraepithelial neoplasia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18907-18912 (2008).</li><li>Habbe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+induction+of+murine+pancreatic+intraepithelial+neoplasia+(mPanIN)+by+acinar+cell+targeting+of+oncogenic+Kras+in+adult+mice.">Spontaneous induction of murine pancreatic intraepithelial neoplasia (mPanIN) by acinar cell targeting of oncogenic Kras in adult mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18913-18918 (2008).</li><li>Liou, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+KRas-Induced+Mitochondrial+Oxidative+Stress+in+Acinar+Cells+Upregulates+EGFR+Signaling+to+Drive+Formation+of+Pancreatic+Precancerous+Lesions.">Mutant KRas-Induced Mitochondrial Oxidative Stress in Acinar Cells Upregulates EGFR Signaling to Drive Formation of Pancreatic Precancerous Lesions.</a> Cell Report. 14 (10), 2325-2336 (2016).</li><li>Hughes, P., Marshall, D., Reid, Y., Parkes, H., Gelber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+costs+of+using+unauthenticated,+over-passaged+cell+lines:+how+much+more+data+do+we+need.">The costs of using unauthenticated, over-passaged cell lines: how much more data do we need.</a> Biotechniques. 43 (5), 577-578 (2007).</li><li>Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+explant+outgrowth+culture+model+for+mouse+pancreatic+acinar+cells+with+long-term+maintenance+of+secretory+phenotype.">A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype.</a> European Journal of Cell Biology. 90 (12), 1052-1060 (2011).</li><li>Gout, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+primary+pancreatic+acinar+cells.">Isolation and culture of mouse primary pancreatic acinar cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Artym, V. V., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cells+in+three-dimensional+collagen+matrix.">Imaging cells in three-dimensional collagen matrix.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 11-20 (2010).</li><li>Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+cytoskeletal+organization+of+invasive+cancer+cells+in+3D.">Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), e50763 (2013).</li></ol>

مقدار الوقت للعزلة والعدوى، وطلاء الخلايا acinar الأولية قصيرة نسبيا ميزة لهذا الأسلوب. وفي المقابل، استزراع الخلايا أسينار من ثمرة explant تتطلب القليل من الوقت العملي، ولكن يستغرق سبعة أيام لثمرة الخلايا أسينار13. بروتوكولا بديلة لعزل acinar14 تلاحظ أسلوب قصيرة جداً للح...

حؤول Acinar للأقنية (ADM) هو إليه وقائية أثناء التهاب البنكرياس وعملية رئيسية يقود التنمية سرطان البنكرياس1 الذي يحتاج إلى مزيد من التبصر آليا. بينما ADM التي يسببها التهاب عكسها2، النمطان كراس الطفرات، التي موجودة في 90% من حالات سرطان البنكرياس3، منع التفريق إلى النمط الظاهري أسينار4،5، 6-كولتورينج والتفريق بين الخلايا أسينار الأولية في خلايا الأقنية في الثقافة 3D يسمح لدراسة الآليات الجزيئية التي تنظم عملية ADM، مما يصعب من الدراسة المجراة في. مثل السابقين فيفو الدراسات تمكن في الوقت الحقيقي التصور ADM وسائقيها والمنظمين لها. تم تحديد العديد من برامج تشغيل عملية ADM، فضلا عن بصيرة آليا على هذه المسارات مما يشير إلى المصب، أو التحقق من استخدام هنا وصف الأسلوب. تشمل هذه ADM التعريفي ب TGF-α (تحويل عامل النمو ألفا)-بوساطة التعبير عن نظام التمثيل التناسبي المختلط-7 (مصفوفة أية-7) والتنشيط من الدرجة7، فضلا عن رنتيس (ينظم في التنشيط، الخلية تي العادية وأعرب ويفرز؛ أيضا معروفة كما يجند chemokine 5 أو CCL5) و TNFα (عامل نخر الورم ألفا)-التي يسببها ADM من خلال تفعيل NF-κB (النووية عامل-κB)8. وسيط إضافي ل ADM هي النمطان كراس9،10، مما يسبب ارتفاعا في الأكسدة التي تعزز عملية ADM من خلال زيادة التعبير عن EGFR (مستقبلات عامل نمو البشرة) ويغاندس، ولو ( عامل نمو البشرة) و TGF-α11.
وفي حين يشيع استخدام خطوط خلايا سرطان البنكرياس للدراسات في المختبر، الثقافات الخلية الابتدائية تقدم العديد من المزايا. على سبيل المثال، خلايا acinar الأولية من الفئران غير المعدلة وراثيا أو الفئران إيواء الطفرات المبادر، مثل كراسG12D، هي النموذج الأنسب لدراسة هذا الحدث بداية من ADM لأن الخلايا الطفرات القليلة والخاضعة للرقابة، التي من المعروف أن يكون حاضرا في بداية التنمية سرطان البنكرياس. هذا على النقيض من ذلك أن العديد من خطوط خلايا سرطان البنكرياس التي لديها طفرات متعددة ويختلف التعبير استناداً إلى الممر رقم12. بالإضافة إلى ذلك، تم التحقق من مسارات الإشارات المحددة بهذه الوسائل من الدراسات الحيوانية. أحد المحاذير من استخدام الخلايا acinar الأولية أنهم لا ترانسفيكتيد خطوط خلايا السرطان نموذجية يمكن.
الطريقة الواردة هنا تفاصيل تقنيات خلية أسينار العزلة والثقافة 3D الذي يحاكي ADM بإضافة المنشطات أو تحوير التعبير البروتين عن طريق العدوى أدينوفيرال أو لينتيفيرال، فضلا عن إعادة عزل الخلايا في نقطة النهاية لمزيد من التحليلات.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2181px;" width="2179">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:357px;">37 &#176;C shaking incubator</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:171px;">SHKE4000-7</td>
			<td style="width:1487px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:357px;">5% CO2, 37 &#176;C Incubator</td>
			<td style="width:167px;">NUAIRE</td>
			<td style="width:171px;">NU-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">50 ml tubes</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Absorbent pad, 20&#34; x 24&#34;</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">1420662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Adenovirus, Ad-GFP</td>
			<td style="width:167px;">Vector Biolabs&#160;</td>
			<td style="width:171px;">1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">01-213-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">BD Precision Glide Needle 21G x 1/2</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:171px;">305167</td>
			<td>Use as pins for dissection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Beaker, 600 mL</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">FB-101-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Bleach, 8.25%</td>
			<td style="width:167px;">Clorox</td>
			<td style="width:171px;">31009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Cell Recovery Solution</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:171px;">354253</td>
			<td>Referred to as &#39;basement membrane matrix recovery solution&#39; in the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:171px;">Allegra X-15R Centrifuge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Collagenase Type I, Clostridium histolyticum</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">C0130-1G</td>
			<td>Create a 100 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">D1756</td>
			<td>Create a 4 mg/ml solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Ethanol, 200 proof</td>
			<td style="width:167px;">Decon Laboratories&#160;</td>
			<td style="width:171px;">2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">F0926-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:171px;">11002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:171px;">91127-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Glass slide, 8-well</td>
			<td style="width:167px;">Lab-Tek</td>
			<td style="width:171px;">177402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:171px;">SH3048801</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Ice bucket, rectangular</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:171px;">07-210-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Instant Sealing Sterilization Pouch</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">01-812-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection)&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Minigrip</td>
			<td style="width:171px;">SBL2X69S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Lentiviral Packaging Mix, Virapower</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:171px;">44-2050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Matrigel</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:171px;">356234</td>
			<td>Referred to as &#39;basement membrane matrix&#39; in the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Parafilm</td>
			<td style="width:167px;">Bemis</td>
			<td style="width:171px;">PM992</td>
			<td>Referred to as &#39;plastic paraffin film&#39; in the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PBS</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:171px;">SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipet tips, 10 &#181;l</td>
			<td style="width:167px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:171px;">1110-3700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipet tips, 1000 &#181;l&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Olympus Plastics</td>
			<td style="width:171px;">24-165RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipet tips, 200 &#181;l&#160;</td>
			<td style="width:167px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:171px;">1111-1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipet-Aid</td>
			<td style="width:167px;">Drummond</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PIPETMAN Classic P10, 1-10 &#956;l</td>
			<td style="width:167px;">Gilson</td>
			<td style="width:171px;">F144802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 &#956;l</td>
			<td style="width:167px;">Gilson</td>
			<td style="width:171px;">F123602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PIPETMAN Classic P20, 2-20 &#956;l</td>
			<td style="width:167px;">Gilson</td>
			<td style="width:171px;">F123600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PIPETMAN Classic P200, 20-200 &#956;l</td>
			<td style="width:167px;">Gilson</td>
			<td style="width:171px;">F123601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipettes, 10 ml&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipettes, 25 ml</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">357525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipettes, 5 ml&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Plate, 12-well</td>
			<td style="width:167px;">Corning Costar</td>
			<td style="width:171px;">3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Plate, 24-well plate</td>
			<td style="width:167px;">Corning Costar</td>
			<td style="width:171px;">3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Plate, 35 mm</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Plate, 6-well</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Polybrene</td>
			<td style="width:167px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:171px;">TR-1003-G</td>
			<td>Create a 40 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Polypropylene Mesh, 105 &#181;m</td>
			<td style="width:167px;">Spectrum Labs</td>
			<td style="width:171px;">146436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Polypropylene Mesh, 500 &#181;m&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Spectrum Labs</td>
			<td style="width:171px;">146418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Scissors&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:171px;">14568-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Scissors&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:171px;">91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Sodium Bicarbonate (Fine White Powder)</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:171px;">BP328-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:171px;">S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:357px;">Soybean Trypsin Inhibitor 8</td>
			<td style="width:167px;">Gibco</td>
			<td style="width:171px;">17075029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Spatula</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">21-401-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Steriflip 50 ml, 0.22 micron filters&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">TGF-&#945;</td>
			<td style="width:167px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:171px;">239-A-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Type I Rat Tail Collagen</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:171px;">354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Waymouth MB 752/1 Medium (powder)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">W1625-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Weigh boat, hexagonal, medium&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">02-202-101</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mimicking and manipulating pancreatic acinar-to-ductal metaplasia in 3-dimensional cell culture

التفريق بين الخلايا أسينار إلى خلايا الأقنية خلال التهاب البنكرياس وفي التطور المبكر لسرطان البنكرياس هو عملية رئيسية التي تتطلب مزيدا من الدراسة. لفهم الآليات التي تنظم حؤول acinar للأقنية (ADM)، السابقين فيفو ثقافة 3D وتمايز الخلايا أسينار الأولية لخلايا الأقنية يوفر مزايا عديدة أكثر النظم الأخرى. مع تقنية هنا، تعديل التعبير البروتين بسيطة وسريعة، التي تتطلب يوما واحداً فقط عزل وحفز أو فيروسي يصيب، والبدء في استزراع خلايا أسينار الأولية للتحقيق في عملية ADM. وعلى النقيض من استخدام مصفوفة غشاء الطابق السفلي، بذر مجموعات خلية acinar في الكولاجين أنا المصفوفة خارج الخلية، يسمح أسينار الخلايا الاحتفاظ بهويتهم acinar قبل التلاعب. وهذا أمر حيوي عند اختبار إسهام مختلف مكونات لاستحثاث اﻷدميرال ليس فقط هي آثار السيتوكينات أو غيرها من العوامل التي تدار اكتوبيكالي قابل للاختبار من خلال هذا الأسلوب، ولكن مساهمة مشتركة الطفرات أو تعبير البروتين زيادة أو ضربة قاضية للتعبير البروتين قابل للاختبار عن طريق العدوى الفيروسية الخلايا الأولية أسينار، باستخدام ناقلات أدينوفيرال أو لينتيفيرال. وعلاوة على ذلك، يمكن إعادة عزل من الكولاجين أو مصفوفة غشاء الطابق السفلي في نقطة النهاية الخلايا وتحليلها للتعبير البروتين.

إنجاز هذا البروتوكول هنا يحدث خلال يوم واحد وعلى التحفيز، ويعتبر ADM في 3-5 أيام. ويصور الشكل 1 تسلسل الأسلوب، حيث يتم إكمال الخطوات من 1 إلى 4 في اليوم الأول. هذا يتضمن إعداد والعدوى الفيروسية والعزلة أسينار امبيدمينت في الكولاجين أو مصفوفة غشاء الطابق السفل?...

Watch this Scientific Journal Video about Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture at JoVE.com

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

محاكاة والتلاعب في البنكرياس حؤول Acinar للأقنية في ثقافة الخلية 3 الأبعاد

عزل خلية acinar الأساسي والبروتين التحوير التعبير أو النشاط، الثقافة وتطبيقات تيار أسفل مفيدة تماما في السابق دراسة فيفو حؤول acinar للأقنية (ADM)، حدث مبكرا في الإصابة بسرطان البنكرياس.

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

يقدم بروتوكولنا تصورًا مباشرًا لـ Acinar-to-Ductal Metaplasia ويسمح بدراسة مساهمة العوامل المدارة خارج الرحم أو تعديل البروتين في هذه العملية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن عرض Acinar-to-Ductal Metaplasia في الوقت الحقيقي ويمكن إجراء دراسات إشارة الخلية. لتشريح البنكرياس من فأر القتل الرحيم، أولا دبوس الكفوف من الماوس إلى غطاء البوليسترين، وتوجيهه بحيث يواجه الذيل الباحث ورش البطن مع 70٪الإيثانول.استخدام ملقط autoclaved لرفع الفراء والجلد في خط الوسط، ومع مقص autoclaved، وجعل شق من خلال الفراء والجلد من فتح مجرى البول إلى منطقة القفص الصدري الحجاب الحاجز. جعل شقوق إضافية إلى اليسار واليمين لقطع بعيدا الفراء والجلد، وخلق رؤية واضحة لتجويف البطن. ثم، وقطع في بطانة الصفاق، أسفل الوسط وإلى اليمين واليسار وسحبه بعيدا عن الأعضاء.استخدام ملقط لرفع الأمعاء ونقلها إلى الجانب الأيسر من الماوس، وخلق مساحة لرؤية البنكرياس الوردي الفاتح تعلق على الظلام، الأحمر، والطحال البيضاوي. سوف يكون نسيج البنكرياس لينة, نسيج الإسفنجي. قطع البنكرياس، الذي يمتد على طول المعدة، متشابكة مع الأمعاء.فصل الطحال عن البنكرياس ووضع البنكرياس في أنبوب 50 ملليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من HBSS، مع مرة واحدة البنسلين الستربتوميسين ونقله إلى غطاء محرك تدفق اللامينا. صب محتويات الأنبوب في قارب وزن فارغ واستخدام ملقط لغسل البنكرياس عن طريق دوامة ذلك. ثم، استخدام ملقط لنقل البنكرياس إلى قارب وزن الثاني الذي يحتوي على HBSS مع ستربتوميسين البنسلين وغسل مرة أخرى عن طريق دوامة.نقل البنكرياس إلى ثالث وزن قارب يحتوي على HBSS مع ستربتوميسين البنسلين والبدء في قطع البنكرياس إلى خمسة ملليمترات أو قطع أصغر. لصب محتويات قارب الوزن في أنبوب 50 ملليلتر جديد ، استخدم أولاً ملقط لنقل قطع البنكرياس إلى السائل حيث يتم تحويل القارب. مرة واحدة لم تعد تعلق القطع على القارب، صب محتوياته في أنبوب.التقاط أي قطع المتبقية مع ملقط وغسل ملقط في أنبوب. بعد الطرد المركزي للأنبوب في 931 مرة الجاذبية في أربع درجات مئوية لمدة دقيقتين، استخدم ماصة خمسة ملليلتر لإزالة HBSS وأية الدهون العائمة. إضافة خمسة ملليلتر من الكولاجيناز المخفف في HBSS.أغلق الأنبوب وتأكد من وجود غطاء مغلق عن طريق تغليف الأنبوب في فيلم البارافين البلاستيكي. ضعه في حاضنة، ويرتجف عند 220 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. والتي سوف تسفر عن حل عكر، وعدد قليل من قطع الأنسجة المتبقية.لوقف التفكك، ووضع أنبوب على الجليد وإضافة خمسة ملليلتر من HBSS الباردة مع 5٪ FBS. بعد الطرد المركزي في 931 مرة الجاذبية في أربع درجات مئوية لمدة دقيقتين، وإزالة فائقة باستخدام ماصة خمسة ملليلتر. إعادة تعليق بيليه في 10 ملليلتر من HBSS مع 5٪ FBS، والطرد المركزي مرة أخرى في 931 مرة الجاذبية لمدة دقيقتين في أربع درجات مئوية.إزالة افرنح باستخدام ماصة 5 ملليلتر وتكرار هذه الخطوة مع آخر 10 ملليلتر من HBSS مع 5٪ FBS. ثم إعادة تعليق بيليه في خمسة ملليلتر من HBSS مع 5٪ FBS. استخدام ماصة P1000 لتصفية تعليق الخلية ملليلتر واحد في وقت واحد من خلال شبكة 500 ميكرومتر في أنبوب 50 ملليلتر.لغسل أي خلايا البنكرياس المتبقية من خلال شبكة, إضافة 5 ملليلتر إضافية من HBSS مع 5٪ FBS. ثم استخدام ماصة P1000 لتمرير هذا الترشيح ملليلتر واحد في وقت واحد من خلال شبكة 105 ميكرومتر في أنبوب 50 ملليلتر. بلطف هذا الماصة تعليق الخلية في أنبوب 50 ملليلتر تحتوي على HBSS مع 30٪ FBS, والتي سوف تشكل طبقة من تعليق الخلية في الجزء العلوي.الطرد المركزي هذا تعليق الخلية في 233 مرة الجاذبية في أربع درجات مئوية لمدة دقيقتين وإزالة فائقة. إعادة تعليق بيليه تحتوي على خلايا Acinar في مرة واحدة في وسط وايموث الكامل. منذ البنكرياس واحد يكفي لعدوى فيروسية اثنين، وتقسيم تعليق الخلية بين أغطية اثنين من 35 ملليمتر لوحات، والذي يسمح للعدوى في التعليق.بالنسبة للعدوى الغدية، أضف الفيروس عند تخفيف 1/1000 إلى غطاء كل صفيحة ودوامة. ضع اللوحات في حاضنة لثقافة الخلية عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون. دوامة كل 15 دقيقة للساعة الأولى ومواصلة الحضانة لمدة ساعتين إضافيتين.لجعل هلام الكولاجين، والجمع بين سبعة ملليلتر من نوع واحد ذيل الفئران الكولاجين، 700 ميكرولتر من 10 مرات متوسطة Waymouth و 466.6 microliters من 0.34 هيدروكسيد الصوديوم المولر في أنبوب 50 ملليلتر على الجليد لجعل هلام الكولاجين. في أنبوب 50 ملليلتر، والجمع بين وحدات متساوية من تعليق الخلية وهلام الكولاجين بعد ثلاث ساعات الحضانة ومزيج بلطف. لوحة 2000 ميكرولترات، بئر واحد في وقت واحد في لوحة ستة بئر مع الحفاظ على لوحة على الجليد ودوامة لتوزيع طبقة الخلايا الكولاجين بالتساوي.لترسيخ المتوسطة، احتضان لوحة في حاضنة ثقافة الخلية في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة. ثم إضافة 1.5 ملليلتر في بئر واحد من الوقت وسيلة وايموث كاملة مع التحفيز المطلوب أو مثبطات. تغيير المتوسطة في اليوم التالي ثم كل يوم.اعتمادا على التحفيز المستخدمة، يمكن ملاحظة Acinar-to-Ductal Metaplasia أو ADM بين اليوم الثالث واليوم الخامس. 24 ساعة بعد العدوى مع فيروس الغدة GFP، صور الخلايا جزءا لا يتجزأ من الكولاجين أو مصفوفة الغشاء الطابق السفلي، وأظهرت أن العدوى كانت فعالة. في خمسة أيام بعد العدوى، شكلت الخلايا جزءا لا يتجزأ من الكولاجين هياكل تشبه القناة عندما حفزت مع 50 نانوغرام لكل ملليلتر من TGF ألفا.شكلت الخلايا جزءا لا يتجزأ من مصفوفة غشاء الطابق السفلي هياكل تشبه القناة في غياب التحفيز في خمسة أيام بعد العدوى. في حين تم تشكيل قنوات أكبر على التحفيز مع 50 نانوغرام لكل ملليلتر من TGF ألفا. واحدة من النقاط الأكثر أهمية في البروتوكول هو طول هضم الكولاجيناز.يشار إلى الهضم السليم من قبل محلول عكر وعدد قليل من قطع الأنسجة المتبقية.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

بروتوكول للثقافة السريع بعد الوفاة خلية من منتشر الجوهرية جسري بالورم الدبقي (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

تبخر تخفيض الشرط الثقافة يزيد من القدرة على التكاثر من متعددة الخلايا كروي التشكيل في صفيحة معايرة دقيقة

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

الإعداد والتحليل الأيضي الثقافات المشارك كروي ثلاثي الأبعاد لخلايا سرطان البنكرياس والخلايا الليفية

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

اختبار في نموذج ثقافة خلية 3D على أساس كروي للرأس والرقبة الحرشفية خلية العلاج

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

عزل خلايا شبيهه بالجذعية من ثقافات كروي ثلاثية الابعاد

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

توليد أورام البنكرياس التقويمية وتوصيف الجسم السابق للخلايا التي تتسلل إلى الخلايا T

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

رصد غزو الخلايا السرطانية والسمية الخلوية للخلايا T-Cell في الثقافة ثلاثية الأبعاد

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer

نموذج الماوس استئصال العظام لسرطان البنكرياس

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer ...

Robot Assisted Distal Pancreatectomy with Celiac Axis Resection (DP-CAR) for Pancreatic Cancer: Surgical Planning and Technique

Robot Assisted Distal Pancreatectomy with Celiac Axis Resection DP-CAR for Pancreatic Cancer: Surgical Planning and Technique

الروبوت بمساعدة استئصال البنكرياس مع استئصال محور الاضطرابات الهضمية (DP-CAR) لسرطان البنكرياس: التخطيط الجراحي والتقنية

Malignant pancreatic tumors involving the celiac artery can be resected with a distal pancreatectomy, splenectomy and celiac axis resection (DP-CAR), ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

إنشاء كرويات 3 الأبعاد من عينات الورم المشتقة من المريض وتقييم حساسيتها للأدوية

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...