Name: mimicking and manipulating pancreatic acinar-to-ductal metaplasia in 3-dimensional cell culture
Uploaded: 2019-02-11T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture at JoVE.com

Quest'opera è stata sostenuta da una sovvenzione di R01 (CA200572) da NIH al PS. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale dell'Istituto nazionale del cancro o di istituti nazionali di Health.The, i finanziatori non avevano alcun ruolo in studio progettazione, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto.

Tutto il lavoro animale è stato approvato dalla Mayo Clinic IACUC.
1. preparazione dei materiali, soluzioni e basi di matrice 3-dimensionale
<ol><li>Tagliare 500 µm e 105 µm in polipropilene mesh in 76 mm da 76 millimetri quadrati. Piegare ogni quadrato a metà due volte per creare un quadrato più piccolo piegato. Posto uno da 500 µm e un 105 µm maglia piazza in un sacchetto autoclavabile.</li>
	<li>La rete in polipropilene autoclave piazze, come pure due paia di forbici e pinze.</li>
...

<ol>
	<li>Rooman, I., Real, F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+ductal+adenocarcinoma+and+acinar+cells:+a+matter+of+differentiation+and+development.">Pancreatic ductal adenocarcinoma and acinar cells: a matter of differentiation and development.</a> Gut. 61 (3), 449-458 (2012).</li><li>Stanger, B. Z., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+identity+in+pancreas+development+and+regeneration.">Control of cell identity in pancreas development and regeneration.</a> Gastroenterology. 144 (6), 1170-1179 (2013).</li><li>Caldas, C., Kern, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K-ras+mutation+and+pancreatic+adenocarcinoma.">K-ras mutation and pancreatic adenocarcinoma.</a> International Journal of Pancreatology. 18 (1), 1-6 (1995).</li><li>Kopp, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Sox9-dependent+acinar-to-ductal+reprogramming+as+the+principal+mechanism+for+initiation+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).</li><li>Morris, J. P. t., Cano, D. A., Sekine, S., Wang, S. C., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-catenin+blocks+Kras-dependent+reprogramming+of+acini+into+pancreatic+cancer+precursor+lesions+in+mice.">Beta-catenin blocks Kras-dependent reprogramming of acini into pancreatic cancer precursor lesions in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (2), 508-520 (2010).</li><li>Grippo, P. J., Nowlin, P. S., Demeure, M. J., Longnecker, D. S., Sandgren, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preinvasive+pancreatic+neoplasia+of+ductal+phenotype+induced+by+acinar+cell+targeting+of+mutant+Kras+in+transgenic+mice.">Preinvasive pancreatic neoplasia of ductal phenotype induced by acinar cell targeting of mutant Kras in transgenic mice.</a> Cancer Research. 63 (9), 2016-2019 (2003).</li><li>Sawey, E. T., Johnson, J. A., Crawford, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+7+controls+pancreatic+acinar+cell+transdifferentiation+by+activating+the+Notch+signaling+pathway.">Matrix metalloproteinase 7 controls pancreatic acinar cell transdifferentiation by activating the Notch signaling pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19327-19332 (2007).</li><li>Liou, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-secreted+cytokines+drive+pancreatic+acinar-to-ductal+metaplasia+through+NF-kappaB+and+MMPs.">Macrophage-secreted cytokines drive pancreatic acinar-to-ductal metaplasia through NF-kappaB and MMPs.</a> Journal of Cell Biology. 202 (3), 563-577 (2013).</li><li>De La, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+and+Kras+reprogram+pancreatic+acinar+cells+to+ductal+intraepithelial+neoplasia.">Notch and Kras reprogram pancreatic acinar cells to ductal intraepithelial neoplasia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18907-18912 (2008).</li><li>Habbe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+induction+of+murine+pancreatic+intraepithelial+neoplasia+(mPanIN)+by+acinar+cell+targeting+of+oncogenic+Kras+in+adult+mice.">Spontaneous induction of murine pancreatic intraepithelial neoplasia (mPanIN) by acinar cell targeting of oncogenic Kras in adult mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18913-18918 (2008).</li><li>Liou, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+KRas-Induced+Mitochondrial+Oxidative+Stress+in+Acinar+Cells+Upregulates+EGFR+Signaling+to+Drive+Formation+of+Pancreatic+Precancerous+Lesions.">Mutant KRas-Induced Mitochondrial Oxidative Stress in Acinar Cells Upregulates EGFR Signaling to Drive Formation of Pancreatic Precancerous Lesions.</a> Cell Report. 14 (10), 2325-2336 (2016).</li><li>Hughes, P., Marshall, D., Reid, Y., Parkes, H., Gelber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+costs+of+using+unauthenticated,+over-passaged+cell+lines:+how+much+more+data+do+we+need.">The costs of using unauthenticated, over-passaged cell lines: how much more data do we need.</a> Biotechniques. 43 (5), 577-578 (2007).</li><li>Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+explant+outgrowth+culture+model+for+mouse+pancreatic+acinar+cells+with+long-term+maintenance+of+secretory+phenotype.">A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype.</a> European Journal of Cell Biology. 90 (12), 1052-1060 (2011).</li><li>Gout, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+primary+pancreatic+acinar+cells.">Isolation and culture of mouse primary pancreatic acinar cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Artym, V. V., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cells+in+three-dimensional+collagen+matrix.">Imaging cells in three-dimensional collagen matrix.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 11-20 (2010).</li><li>Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+cytoskeletal+organization+of+invasive+cancer+cells+in+3D.">Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), e50763 (2013).</li></ol>

La relativamente breve lasso di tempo per isolamento, infezione e placcatura primario delle cellule acinose è un vantaggio di questo metodo. Al contrario, coltura delle cellule acinose da una conseguenza di espianto richiede poco tempo hands-on, ma sono necessari sette giorni per la conseguenza di cellule acinose13. Protocollo alternativo per isolamento acinose14 note un metodo molto breve per l'ottenimento di cellule acinose; Tuttavia, l'EGF è un componente essenziale ne...

Acinoso-ductal metaplasia (ADM) è un meccanismo protettivo durante un processo chiave Guida di sviluppo di cancro del pancreas1 che richiede ulteriore visione meccanicistica e pancreatite. Mentre l'infiammazione indotta ADM è reversibile2, oncogeniche mutazioni di KRAS , che sono presenti nel 90% dei casi di cancro del pancreas3, impedire differenziazione torna a un fenotipo acinose4,5, 6. Culturing e differenziazione di cellule acinose primarie in cellule duttali in 3D cultura permette per lo studio dei meccanismi molecolari che regolano il processo ADM, che è difficile da studiare in vivo. Tali ex vivo studi abilitare la visualizzazione in tempo reale di ADM, i suoi piloti e suoi regolatori. Sono stati identificati diversi piloti del processo di ADM, nonché informazioni sulle loro vie di segnalazione a valle, o verificato utilizzando il qui descritto metodo. Questi includono l'induzione di ADM da TGF-α (alfa di fattore di crescita trasformante)-mediata espressione di MMP-7 (matrix metalloproteinase-7) e l'attivazione della tacca7, così come RANTES (regolato sull'attivazione, la cellula T normale espressa e secreta; anche noto come ligando chemochina 5 o CCL5) e TNFα (fattore di necrosi tumorale alfa)-indotta ADM attraverso l'attivazione di NF-KB (nuclear factor-κB)8. Un ulteriore mediatore di ADM è oncogene KRas9,10, che provoca un aumento dello stress ossidativo che migliora il processo ADM attraverso l'aumentata espressione di EGFR (recettore del fattore di crescita epidermico) e suoi ligandi, EGF ( fattore di crescita epidermico) e TGF-α11.
Mentre l'uso di linee cellulari di cancro del pancreas è comune per gli studi in vitro, colture cellulari primarie offrono molti vantaggi. Per esempio, le cellule acinose primarie da topi non transgenica o topi che harboring le mutazioni d'iniziale, ad esempio KrasG12D, sono il modello più appropriato per studiare l'evento iniziale di ADM perché le cellule hanno mutazioni pochi e controllate, che sono noti per essere presente all'inizio dello sviluppo di cancro del pancreas. Questo è in contrasto con molte linee cellulari di cancro del pancreas che hanno mutazioni multiple e varie espressione basata sul passaggio numero12. Inoltre, le vie di segnalazione identificate da tali mezzi sono state verificate da studi sugli animali. Un avvertimento di usando le cellule acinose primarie è che essi non possono essere transfected come linee cellulari del cancro tipico possono.
Il metodo qui in dettaglio le tecniche di isolamento di cellule acinose, cultura 3D che imita ADM aggiungendo stimolanti o modulazione dell'espressione di proteine tramite infezione adenoviral o lentivirale, come pure re-isolamento delle cellule presso l'endpoint per ulteriori analisi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2181px;" width="2179">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:357px;">37 &#176;C shaking incubator</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:171px;">SHKE4000-7</td>
			<td style="width:1487px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:357px;">5% CO2, 37 &#176;C Incubator</td>
			<td style="width:167px;">NUAIRE</td>
			<td style="width:171px;">NU-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">50 ml tubes</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Absorbent pad, 20&#34; x 24&#34;</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">1420662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Adenovirus, Ad-GFP</td>
			<td style="width:167px;">Vector Biolabs&#160;</td>
			<td style="width:171px;">1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">01-213-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">BD Precision Glide Needle 21G x 1/2</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:171px;">305167</td>
			<td>Use as pins for dissection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Beaker, 600 mL</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">FB-101-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Bleach, 8.25%</td>
			<td style="width:167px;">Clorox</td>
			<td style="width:171px;">31009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Cell Recovery Solution</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:171px;">354253</td>
			<td>Referred to as &#39;basement membrane matrix recovery solution&#39; in the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:171px;">Allegra X-15R Centrifuge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Collagenase Type I, Clostridium histolyticum</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">C0130-1G</td>
			<td>Create a 100 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">D1756</td>
			<td>Create a 4 mg/ml solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Ethanol, 200 proof</td>
			<td style="width:167px;">Decon Laboratories&#160;</td>
			<td style="width:171px;">2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">F0926-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:171px;">11002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:171px;">91127-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Glass slide, 8-well</td>
			<td style="width:167px;">Lab-Tek</td>
			<td style="width:171px;">177402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:171px;">SH3048801</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Ice bucket, rectangular</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:171px;">07-210-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Instant Sealing Sterilization Pouch</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">01-812-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection)&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Minigrip</td>
			<td style="width:171px;">SBL2X69S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Lentiviral Packaging Mix, Virapower</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:171px;">44-2050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Matrigel</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:171px;">356234</td>
			<td>Referred to as &#39;basement membrane matrix&#39; in the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Parafilm</td>
			<td style="width:167px;">Bemis</td>
			<td style="width:171px;">PM992</td>
			<td>Referred to as &#39;plastic paraffin film&#39; in the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PBS</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:171px;">SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipet tips, 10 &#181;l</td>
			<td style="width:167px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:171px;">1110-3700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipet tips, 1000 &#181;l&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Olympus Plastics</td>
			<td style="width:171px;">24-165RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipet tips, 200 &#181;l&#160;</td>
			<td style="width:167px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:171px;">1111-1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipet-Aid</td>
			<td style="width:167px;">Drummond</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PIPETMAN Classic P10, 1-10 &#956;l</td>
			<td style="width:167px;">Gilson</td>
			<td style="width:171px;">F144802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 &#956;l</td>
			<td style="width:167px;">Gilson</td>
			<td style="width:171px;">F123602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PIPETMAN Classic P20, 2-20 &#956;l</td>
			<td style="width:167px;">Gilson</td>
			<td style="width:171px;">F123600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PIPETMAN Classic P200, 20-200 &#956;l</td>
			<td style="width:167px;">Gilson</td>
			<td style="width:171px;">F123601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipettes, 10 ml&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipettes, 25 ml</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">357525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipettes, 5 ml&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Plate, 12-well</td>
			<td style="width:167px;">Corning Costar</td>
			<td style="width:171px;">3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Plate, 24-well plate</td>
			<td style="width:167px;">Corning Costar</td>
			<td style="width:171px;">3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Plate, 35 mm</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Plate, 6-well</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Polybrene</td>
			<td style="width:167px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:171px;">TR-1003-G</td>
			<td>Create a 40 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Polypropylene Mesh, 105 &#181;m</td>
			<td style="width:167px;">Spectrum Labs</td>
			<td style="width:171px;">146436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Polypropylene Mesh, 500 &#181;m&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Spectrum Labs</td>
			<td style="width:171px;">146418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Scissors&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:171px;">14568-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Scissors&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:171px;">91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Sodium Bicarbonate (Fine White Powder)</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:171px;">BP328-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:171px;">S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:357px;">Soybean Trypsin Inhibitor 8</td>
			<td style="width:167px;">Gibco</td>
			<td style="width:171px;">17075029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Spatula</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">21-401-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Steriflip 50 ml, 0.22 micron filters&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">TGF-&#945;</td>
			<td style="width:167px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:171px;">239-A-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Type I Rat Tail Collagen</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:171px;">354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Waymouth MB 752/1 Medium (powder)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">W1625-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Weigh boat, hexagonal, medium&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">02-202-101</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mimicking and manipulating pancreatic acinar-to-ductal metaplasia in 3-dimensional cell culture

La differenziazione delle cellule acinose a cellule duttali durante la pancreatite e l'inizio dello sviluppo del cancro del pancreas è un processo chiave che richiede ulteriore studio. Per comprendere i meccanismi di regolazione metaplasia acinoso--duttale (ADM), ex vivo di cultura 3D e differenziazione delle cellule acinose primarie a cellule duttali offre molti vantaggi rispetto ad altri sistemi. Con la tecnica qui, modulazione dell'espressione della proteina è semplice e veloce, che richiede un solo giorno per isolare, stimolare o viralmente infettare e iniziare la coltura delle cellule acinose primarie per studiare il processo ADM. A differenza dell'utilizzo di matrice della membrana basale, la semina dei mazzi delle cellule acinose in collagene extracellulare, permette che le cellule acinose mantengono la loro identità acinose prima manipolazione. Ciò è vitale quando si verifica il contributo delle varie componenti all'induzione di ADM. Non solo sono gli effetti delle citochine o altri fattori ectopically amministrati testabile attraverso questa tecnica, ma il contributo di comuni mutazioni, proteina aumentata espressione o atterramento di espressione della proteina è verificabile tramite l'infezione virale di cellule acinose primarie, utilizzando vettori adenoviral o lentivirali. Inoltre, le cellule possono essere ri-isolate da collagene o matrice della membrana basale all'endpoint e analizzati per l'espressione della proteina.

Completamento del protocollo nel presente documento si verifica entro un giorno e dopo stimolazione, ADM è visto in 3-5 giorni. Figura 1 illustra la sequenza del metodo, per cui i passaggi da 1 a 4 sono stati completati il primo giorno. Questo include la preparazione, isolamento acinosa, infezione virale e infissione in collagene o matrice della membrana basale. Mentre la matrice della membrana basale induce ADM, cellule acinose all'interno di collagene ho b...

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Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

Che imita e manipolare Metaplasia acinoso--Ductal pancreatico nella coltura cellulare 3-dimensionale

Isolamento primario delle cellule acinose, modulazione di espressione o attività di proteina, cultura e applicazioni a valle sono abbondantemente utili nell'ex vivo uno studio del metaplasia acinoso--duttale (ADM), un evento iniziale nello sviluppo del cancro del pancreas.

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Il nostro protocollo offre la visualizzazione diretta della Metaplasia Acinar-to-Ductal e consente lo studio del contributo di fattori somministrati ectopicamente o modulazione proteica a questo processo. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la Metaplasia da Acinar a Ductal può essere vista in tempo reale e possono essere eseguiti studi di segnalazione cellulare. Per sezionare il pancreas da un topo eutanasiato, per prima cosa inchiodare le zampe del topo al coperchio in polistirolo, orientarlo in modo che la coda sia rivolta verso il ricercatore e spruzzare l'addome con il 70% di etanolo.Utilizzare le forceza autoclavate per sollevare la pelliccia e la pelle a metà linea e, con le forbici autoclavate, fare un'incisione attraverso la pelliccia e la pelle dall'apertura uretrale all'area della gabbia toracica del diaframma. Fai ulteriori incisioni a sinistra e a destra per tagliare via la pelliccia e la pelle, creando una visione chiara della cavità addominale. Quindi, tagliare nel rivestimento peritoneale, verso il centro e a destra e a sinistra e tirarlo via dagli organi.Usa le forcep per sollevare l'intestino e spostarli sul lato sinistro del mouse, creando spazio per vedere il pancreas rosa chiaro attaccato alla milza scura, rossa e ovale. Il tessuto pancreatico avrà una consistenza morbida e spugnosa. Ritaglia il pancreas, che corre lungo lo stomaco, intrecciandosi con l'intestino.Separare la milza dal pancreas e posizionare il pancreas in un tubo da 50 millilitri contenente 10 millilitri di HBSS, con una volta la streptomicina di penicillina e trasferirlo nella cappa di flusso laminare. Versare il contenuto del tubo in una barca di pesatura vuota e utilizzare le forcep per lavare il pancreas ruotandolo. Quindi, utilizzare le forcep per spostare il pancreas su una seconda barca di pesatura contenente HBSS con streptomicina penicillina e lavare di nuovo ruotando.Spostare il pancreas sulla terza barca di pesata contenente HBSS con streptomicina penicillina e iniziare a tagliare il pancreas in cinque millimetri o pezzi più piccoli. Per versare il contenuto della barca di pesatura in un tubo fresco da 50 millilitri, utilizzare prima le forcep per spostare i pezzi del pancreas nel liquido mentre la barca viene ribaltata. Una volta che i pezzi non sono più attaccati alla barca, versare il suo contenuto nel tubo.Raccogliere i pezzi rimanenti con le forcep e lavare le forcep nel tubo. Dopo aver centrifugato il tubo a 931 volte la gravità a quattro gradi Celsius per due minuti, utilizzare una pipetta da cinque millilitri per rimuovere l'HBSS e qualsiasi grasso galleggiante. Aggiungere cinque millilitri di collagenasi diluiti in HBSS.Chiudere il tubo e assicurarsi un coperchio sigillato avvolgendo il tubo in pellicola di paraffina di plastica. Mettilo in un'incubatrice, tremando a 220 giri/min a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Che produrrà la soluzione torbida e pochi pezzi di tessuto rimanenti.Per interrompere la dissociazione, posizionare il tubo sul ghiaccio e aggiungere cinque millilitri di HBSS freddo con 5%FBS. Dopo aver centrifugato a 931 volte la gravità a quattro gradi Celsius per due minuti, rimuovere il supernatante usando una pipetta da cinque millilitri. Sospendere nuovamente il pellet in 10 millilitri di HBSS con 5%FBS e centrifugare nuovamente a 931 volte la gravità per due minuti a quattro gradi Celsius.Rimuovere il supernatante utilizzando una pipetta da cinque millilitri e ripetere questo passaggio con altri 10 millilitri di HBSS con 5%FBS. Quindi sospendere di nuovo il pellet in cinque millilitri di HBSS con 5%FBS. Utilizzare una pipetta P1000 per filtrare la sospensione cellulare di un millilitro alla volta attraverso una rete da 500 micrometri in un tubo da 50 millilitri.Per lavare le celle pancreatiche rimanenti attraverso la rete, aggiungere altri cinque millilitri di HBSS con 5%FBS. Quindi utilizzare una pipetta P1000 per passare questo filtrato un millilitro alla volta attraverso la rete da 105 micrometri in un tubo da 50 millilitri. Pipettare delicatamente questa sospensione cellulare in un tubo da 50 millilitri contenente HBSS con 30%FBS, che formerà uno strato di sospensione cellulare nella parte superiore.Centrifuga questa sospensione cellulare a 233 volte la gravità a quattro gradi Celsius per due minuti e rimuovi il supernatante. Sospendere di nuovo il pellet contenente le cellule Acinar in un mezzo completo di Waymouth. Poiché un pancreas è sufficiente per due infezioni virali, dividere la sospensione cellulare tra i coperchi di due piastre da 35 millimetri, il che consente l'infezione in sospensione.Per l'infezione adenovirale, aggiungere il virus con una diluizione 1/1000 al coperchio di ogni piastra e ruotare. Posizionare le piastre in un incubatore di coltura cellulare a 37 gradi Celsius e 5%CO2. Ruotare ogni 15 minuti per la prima ora e continuare l'incubazione per altre due ore.Per produrre un gel di collagene, combinare sette millilitri di collagene di coda di ratto di tipo uno, 700 microlitri di 10 volte il mezzo di Waymouth e 466,6 microlitri di idrossido di sodio molare 0,34 in un tubo da 50 millilitri sul ghiaccio per produrre gel di collagene. In un tubo da 50 millilitri, combinare uguali volumi di sospensione cellulare e gel di collagene dopo tre ore di incubazione e mescolare delicatamente. Piastra 2000 microlitri, un pozzo alla volta in una piastra di sei poggiasolo mantenendo la piastra sul ghiaccio e ruotando per distribuire uniformemente lo strato cellulare di collagene.Per solidificare il mezzo, incubare la piastra in un incubatore di coltura cellulare a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 30 minuti. Quindi aggiungere 1,5 millilitri per pozzo di uno volte il mezzo completo di Waymouth con lo stimolo o gli inibitori desiderati. Cambiare il mezzo il giorno seguente e poi a giorni diversi.A seconda dello stimolo utilizzato, la metaplasia acinare-ductale o ADM può essere osservata tra il terzo e il quinto giorno. 24 ore dopo l'infezione da adenovirus GFP, le immagini delle cellule incorporate nella matrice di collagene o membrana basale hanno dimostrato che l'infezione era efficiente. A cinque giorni dall'infezione, le cellule incorporate in strutture simili a condotto formate da collagene quando stimolate con 50 nanogrammi per millilitro di TGF alpha.Le cellule incorporate nella matrice della membrana basale formavano strutture simili a dutti in assenza di uno stimolo a cinque giorni dopo l'infezione. Mentre i condotti più grandi si formavano alla stimolazione con 50 nanogrammi per millilitro di TGF alfa. Uno dei punti più critici del protocollo è la lunghezza della digestione della collagenasi.Una corretta digestione è indicata da una soluzione torbida e pochi pezzi di tessuto rimanenti.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Un protocollo per Rapid post-mortem delle cellule Cultura della diffusa intrinseca Pontine glioma (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

Evaporazione di riduzione Cultura Condizione Aumenta la riproducibilità dei multicellulare Spheroid Formazione in micropiastre

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Preparazione e dosaggio metabolica della sferoide 3-dimensionale co-colture di cellule di cancro del pancreas e dei fibroblasti

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Terapia test in un modello di coltura cellulare 3D basati su sferoide per testa e collo a cellule squamose

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Isolamento di cellule simili a stelo dalle colture speroidi a 3 dimensioni

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generazione di tumori pancreatici ortotopici e caratterizzazione ex vivo della citotossicità delle cellule T infiltranti di tumore

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Monitoraggio dell'invasione delle cellule tumorali e della citotossicità delle cellule T nella cultura 3D

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer

Un modello ortotopico di topo resezionale del cancro al pancreas

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer ...

Robot Assisted Distal Pancreatectomy with Celiac Axis Resection (DP-CAR) for Pancreatic Cancer: Surgical Planning and Technique

Robot Assisted Distal Pancreatectomy with Celiac Axis Resection DP-CAR for Pancreatic Cancer: Surgical Planning and Technique

Pancreatectomia distale assistita da robot con resezione dell'asse celiaco (DP-CAR) per il cancro al pancreas: pianificazione chirurgica e tecnica

Malignant pancreatic tumors involving the celiac artery can be resected with a distal pancreatectomy, splenectomy and celiac axis resection (DP-CAR), ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Stabilire sferoidi 3-dimensionali da campioni tumorali derivati dal paziente e valutare la loro sensibilità ai farmaci

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...