Name: mimicking and manipulating pancreatic acinar-to-ductal metaplasia in 3-dimensional cell culture
Uploaded: 2019-02-11T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture at JoVE.com

이 작품 추 하는 NIH에서 R01 보조금 (CA200572)에 의해 지원 되었다 내용과 전적으로 저자의 책임은 반드시 국립 암 연구소의 공식 견해를 대표 하지 않는다 또는 funders에 역할을 했다 Health.The의 국가 학회 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비.

모든 동물 일 메이 요 클리닉 IACUC에 의해 승인 되었다.
1. 준비 재료, 솔루션, 및 3 차원 매트릭스의 기초
<ol><li>500 µ m와 76 m m로 105 µ m 폴 리 프로필 렌 메시 76 m m 사각형으로 잘라. 두 번 접힌된 작은 사각형을 만들 절반 접어 각 광장. 장소 한 500 µ m 및 1 105 µ m 멸 주머니에 사각형을 메쉬.</li>
	<li>오토 클레이 브 폴 리 프로필 렌 메쉬 정사각형으로 두 쌍의가 위와 집게.</li>
	<...

<ol>
	<li>Rooman, I., Real, F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+ductal+adenocarcinoma+and+acinar+cells:+a+matter+of+differentiation+and+development.">Pancreatic ductal adenocarcinoma and acinar cells: a matter of differentiation and development.</a> Gut. 61 (3), 449-458 (2012).</li><li>Stanger, B. Z., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+identity+in+pancreas+development+and+regeneration.">Control of cell identity in pancreas development and regeneration.</a> Gastroenterology. 144 (6), 1170-1179 (2013).</li><li>Caldas, C., Kern, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K-ras+mutation+and+pancreatic+adenocarcinoma.">K-ras mutation and pancreatic adenocarcinoma.</a> International Journal of Pancreatology. 18 (1), 1-6 (1995).</li><li>Kopp, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Sox9-dependent+acinar-to-ductal+reprogramming+as+the+principal+mechanism+for+initiation+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).</li><li>Morris, J. P. t., Cano, D. A., Sekine, S., Wang, S. C., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-catenin+blocks+Kras-dependent+reprogramming+of+acini+into+pancreatic+cancer+precursor+lesions+in+mice.">Beta-catenin blocks Kras-dependent reprogramming of acini into pancreatic cancer precursor lesions in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (2), 508-520 (2010).</li><li>Grippo, P. J., Nowlin, P. S., Demeure, M. J., Longnecker, D. S., Sandgren, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preinvasive+pancreatic+neoplasia+of+ductal+phenotype+induced+by+acinar+cell+targeting+of+mutant+Kras+in+transgenic+mice.">Preinvasive pancreatic neoplasia of ductal phenotype induced by acinar cell targeting of mutant Kras in transgenic mice.</a> Cancer Research. 63 (9), 2016-2019 (2003).</li><li>Sawey, E. T., Johnson, J. A., Crawford, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+7+controls+pancreatic+acinar+cell+transdifferentiation+by+activating+the+Notch+signaling+pathway.">Matrix metalloproteinase 7 controls pancreatic acinar cell transdifferentiation by activating the Notch signaling pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19327-19332 (2007).</li><li>Liou, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-secreted+cytokines+drive+pancreatic+acinar-to-ductal+metaplasia+through+NF-kappaB+and+MMPs.">Macrophage-secreted cytokines drive pancreatic acinar-to-ductal metaplasia through NF-kappaB and MMPs.</a> Journal of Cell Biology. 202 (3), 563-577 (2013).</li><li>De La, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+and+Kras+reprogram+pancreatic+acinar+cells+to+ductal+intraepithelial+neoplasia.">Notch and Kras reprogram pancreatic acinar cells to ductal intraepithelial neoplasia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18907-18912 (2008).</li><li>Habbe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+induction+of+murine+pancreatic+intraepithelial+neoplasia+(mPanIN)+by+acinar+cell+targeting+of+oncogenic+Kras+in+adult+mice.">Spontaneous induction of murine pancreatic intraepithelial neoplasia (mPanIN) by acinar cell targeting of oncogenic Kras in adult mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18913-18918 (2008).</li><li>Liou, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+KRas-Induced+Mitochondrial+Oxidative+Stress+in+Acinar+Cells+Upregulates+EGFR+Signaling+to+Drive+Formation+of+Pancreatic+Precancerous+Lesions.">Mutant KRas-Induced Mitochondrial Oxidative Stress in Acinar Cells Upregulates EGFR Signaling to Drive Formation of Pancreatic Precancerous Lesions.</a> Cell Report. 14 (10), 2325-2336 (2016).</li><li>Hughes, P., Marshall, D., Reid, Y., Parkes, H., Gelber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+costs+of+using+unauthenticated,+over-passaged+cell+lines:+how+much+more+data+do+we+need.">The costs of using unauthenticated, over-passaged cell lines: how much more data do we need.</a> Biotechniques. 43 (5), 577-578 (2007).</li><li>Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+explant+outgrowth+culture+model+for+mouse+pancreatic+acinar+cells+with+long-term+maintenance+of+secretory+phenotype.">A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype.</a> European Journal of Cell Biology. 90 (12), 1052-1060 (2011).</li><li>Gout, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+primary+pancreatic+acinar+cells.">Isolation and culture of mouse primary pancreatic acinar cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Artym, V. V., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cells+in+three-dimensional+collagen+matrix.">Imaging cells in three-dimensional collagen matrix.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 11-20 (2010).</li><li>Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+cytoskeletal+organization+of+invasive+cancer+cells+in+3D.">Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), e50763 (2013).</li></ol>

격리, 감염, 그리고 기본 포상 세포 도금에 대 한 시간의 상대적으로 짧은 시간이이 방법의 장점이 다. 반면, explant 파생물에서 포상 세포 배양 실습 시간이 좀 필요 하지만 포상 세포13의 파생물에 대 한 일 걸립니다. 포상 격리14 에 대 한 대체 프로토콜 노트 포상 세포;을 얻기 위해 매우 짧은 방법 그러나, EGF 살려 포상 세포 해당 프로토콜을 사용 하 여 격리 하?...

포상-ductal metaplasia (ADM)는 췌 장 염과 췌장암 개발1 기계 통찰력 더 필요한 운전 키 프로세스 동안 보호 메커니즘입니다. 염증 유발 ADM은 가역2, 종양 KRA 돌연변이, 췌장암의 경우3의 90%에 존재는 하는 동안 방지 한 포상 형4,5, 등을 맞댄 차별화 6. Culturing와 3D 문화에 ductal 세포로 기본 포상 세포 차별화 vivo에서 공부 하기가 ADM 과정을 규제 하는 분자 메커니즘의 연구에 대 한 수 있습니다. Ex vivo 연구 같은 ADM, 드라이버와 그 레 귤 레이 터의 실시간 시각화 가능 ADM 과정 뿐만 아니라 그들의 다운스트림 신호 경로에 기계적 통찰력의 몇 가지 드라이버 확인 되었습니다 또는 메서드를 설명 하는 여기를 사용 하 여 확인 된. ADM 유도 TGF-α (변형 성장 인자 알파)에 의해 포함 됩니다-MMP-7 (매트릭스 metalloproteinase-7) 라는 표현과 활성화 노치7, RANTES (활성화, 정상적인 T 세포와 분 비; 또한 알려진 표현에 통제의 중재 chemokine ligand 5 또는 CCL5) 및 TNFα (종양 괴 사 인자 알파)-NF-κB (핵 요인-κB)8의 활성화를 통해 ADM을 유도. ADM의 추가 중재자 종양 Kra9,10, EGFR (표 피 성장 인자 수용 체)의 증가 표현을 통해 ADM 프로세스와 ligands, EGF (향상 된 산화 스트레스에서 증가 일으키는 원인이 되는 표 피 성장 인자)와 TGF-α11.
췌장암 세포 라인의 사용은 체 외 연구에 대 한 일반적인, 1 차 셀 문화는 많은 이점을 제공 합니다. 예를 들어, 비-유전자 변형 쥐 또는 쥐 KraG12D와 같은 시작 돌연변이, 은닉에서 기본 포상 세포는 ADM의 초기 이벤트 셀 몇 및 제어 돌연변이 때문에 공부에 대 한 가장 적절 한 모델을 췌장암 개발 초기에 알려져 있습니다. 이것은 반대로 여러 돌연변이 많은 췌장암 세포 라인 식 통로 번호12에 따라 다양 하 고. 또한, 이러한 방법으로 식별 신호 경로 동물 연구에 의해 확인 되었습니다. 주 포상 세포를 사용 하 여 한 경고는 일반적인 암 세포 선 할 수 있는 그들은 페 수 수 없습니다.
여기 방법 포상 세포 격리, 각성제를 추가 하거나 adenoviral 또는 lentiviral 감염 뿐만 아니라 다시 격리 추가 분석에 대 한 끝점에서 세포의 단백질 발현을 조절 하 여 ADM을 3D 문화의 기법을 자세히 설명 합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2181px;" width="2179">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:357px;">37 &#176;C shaking incubator</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:171px;">SHKE4000-7</td>
			<td style="width:1487px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:357px;">5% CO2, 37 &#176;C Incubator</td>
			<td style="width:167px;">NUAIRE</td>
			<td style="width:171px;">NU-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">50 ml tubes</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Absorbent pad, 20&#34; x 24&#34;</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">1420662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Adenovirus, Ad-GFP</td>
			<td style="width:167px;">Vector Biolabs&#160;</td>
			<td style="width:171px;">1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">01-213-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">BD Precision Glide Needle 21G x 1/2</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:171px;">305167</td>
			<td>Use as pins for dissection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Beaker, 600 mL</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">FB-101-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Bleach, 8.25%</td>
			<td style="width:167px;">Clorox</td>
			<td style="width:171px;">31009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Cell Recovery Solution</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:171px;">354253</td>
			<td>Referred to as &#39;basement membrane matrix recovery solution&#39; in the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:171px;">Allegra X-15R Centrifuge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Collagenase Type I, Clostridium histolyticum</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">C0130-1G</td>
			<td>Create a 100 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">D1756</td>
			<td>Create a 4 mg/ml solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Ethanol, 200 proof</td>
			<td style="width:167px;">Decon Laboratories&#160;</td>
			<td style="width:171px;">2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">F0926-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:171px;">11002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:171px;">91127-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Glass slide, 8-well</td>
			<td style="width:167px;">Lab-Tek</td>
			<td style="width:171px;">177402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:171px;">SH3048801</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Ice bucket, rectangular</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:171px;">07-210-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Instant Sealing Sterilization Pouch</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">01-812-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection)&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Minigrip</td>
			<td style="width:171px;">SBL2X69S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Lentiviral Packaging Mix, Virapower</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:171px;">44-2050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Matrigel</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:171px;">356234</td>
			<td>Referred to as &#39;basement membrane matrix&#39; in the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Parafilm</td>
			<td style="width:167px;">Bemis</td>
			<td style="width:171px;">PM992</td>
			<td>Referred to as &#39;plastic paraffin film&#39; in the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PBS</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:171px;">SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipet tips, 10 &#181;l</td>
			<td style="width:167px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:171px;">1110-3700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipet tips, 1000 &#181;l&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Olympus Plastics</td>
			<td style="width:171px;">24-165RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipet tips, 200 &#181;l&#160;</td>
			<td style="width:167px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:171px;">1111-1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipet-Aid</td>
			<td style="width:167px;">Drummond</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PIPETMAN Classic P10, 1-10 &#956;l</td>
			<td style="width:167px;">Gilson</td>
			<td style="width:171px;">F144802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 &#956;l</td>
			<td style="width:167px;">Gilson</td>
			<td style="width:171px;">F123602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PIPETMAN Classic P20, 2-20 &#956;l</td>
			<td style="width:167px;">Gilson</td>
			<td style="width:171px;">F123600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PIPETMAN Classic P200, 20-200 &#956;l</td>
			<td style="width:167px;">Gilson</td>
			<td style="width:171px;">F123601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipettes, 10 ml&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipettes, 25 ml</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">357525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipettes, 5 ml&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Plate, 12-well</td>
			<td style="width:167px;">Corning Costar</td>
			<td style="width:171px;">3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Plate, 24-well plate</td>
			<td style="width:167px;">Corning Costar</td>
			<td style="width:171px;">3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Plate, 35 mm</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Plate, 6-well</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Polybrene</td>
			<td style="width:167px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:171px;">TR-1003-G</td>
			<td>Create a 40 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Polypropylene Mesh, 105 &#181;m</td>
			<td style="width:167px;">Spectrum Labs</td>
			<td style="width:171px;">146436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Polypropylene Mesh, 500 &#181;m&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Spectrum Labs</td>
			<td style="width:171px;">146418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Scissors&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:171px;">14568-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Scissors&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:171px;">91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Sodium Bicarbonate (Fine White Powder)</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:171px;">BP328-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:171px;">S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:357px;">Soybean Trypsin Inhibitor 8</td>
			<td style="width:167px;">Gibco</td>
			<td style="width:171px;">17075029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Spatula</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">21-401-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Steriflip 50 ml, 0.22 micron filters&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">TGF-&#945;</td>
			<td style="width:167px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:171px;">239-A-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Type I Rat Tail Collagen</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:171px;">354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Waymouth MB 752/1 Medium (powder)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">W1625-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Weigh boat, hexagonal, medium&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">02-202-101</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mimicking and manipulating pancreatic acinar-to-ductal metaplasia in 3-dimensional cell culture

동안 췌 장 염 및 췌장암의 초기 개발에 ductal 세포 포상 세포의 분화 추가 연구를 필요로 하는 핵심 과정 이다. 메커니즘을 이해 하기 ex vivo 3D 문화 그리고 ductal 세포 주 포상 세포의 분화 조절 포상-ductal metaplasia (ADM), 다른 시스템에 비해 많은 장점을 제공 합니다. 본 기술로, 단백질 식의 변조는 간단 하 고 신속 하 게, 분리, 자극 또는 virally 감염 및 ADM 과정 조사를 기본 포상 세포 배양 시작만 1 일 요구. 뿌리기 콜라겐에서 포상 세포 클러스터 나 기질, 지하실 멤브레인 매트릭스를 사용 하 여 달리 조작 하기 전에 포상 그들의 정체성을 유지 하기 위해 포상 셀 수 있습니다. 이 때 중요 한 해군 제 독의 유도에 다양 한 부품의 기여를 테스트 뿐만 아니라이 기술을 통해 쓸만한 cytokines 또는 다른 ectopically 관리 요인의 효과 하지만 일반적인 돌연변이, 증가 단백질 표정, 또는 단백질 식의 최저 기여의 바이러스 감염을 통해 쓸만한 주요 포상 세포, adenoviral 또는 lentiviral 벡터를 사용 하 여. 또한, 셀 콜라겐 또는 끝점에서 지하실 멤브레인 매트릭스에서 다시 고립 될 수 있다 고 단백질 식에 대 한 분석.

본 프로토콜의 완료 1 일 안에 발생 하 고 자극, 시 ADM은 3-5 일에서 볼 수 있습니다. 그림 1 첫날에 1-4 단계는 완료 하는 그것에 의하여 방법의 순서를 보여 줍니다. 이 콜라겐 또는 지하실 멤브레인 매트릭스 준비, 포상 절연, 바이러스 성 감염 및 임베디드 포함 됩니다. 지하실 막 매트릭스 ADM 유도, 콜라겐 내 포상 세포 나 필요 받아야 TGF-α와 같은 자?...

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Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

흉내 낸 고 3 차원 세포 배양에서 췌 장 Acinar-Ductal Metaplasia 조작

주 포상 세포 격리, 단백질 식 또는 활동 변조, 문화, 및 다운 스트림 응용 프로그램은 전에 다량 유용한 vivo 연구 포상-ductal metaplasia (ADM), 췌장암의 개발에는 초기 이벤트.

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

우리의 프로토콜은 Acinar-to-덕탈 메타플라시아의 직접적인 시각화를 제공하고 이 과정에 국소 투여 된 요인 또는 단백질 변조의 기여에 대한 연구를 허용합니다. 이 기술의 주요 장점은 아시나르-덕탈 메타플라시아가 실시간으로 볼 수 있고 세포 신호 연구가 수행될 수 있다는 것입니다. 안락사 된 마우스에서 췌장을 해부하려면 먼저 마우스의 발을 폴리스티렌 뚜껑에 고정하고 꼬리가 연구원을 향하도록 방향을 지정하고 70 %의 에탄올로 복부를 분사하십시오.오토클레이브 포셉을 사용하여 미드라인에서 털과 피부를 들어 올리고, 자동 가위를 사용하여 요도 개구부에서 다이어프램 리브 케이지 부위에 이르기까지 모피와 피부를 절개합니다. 왼쪽과 오른쪽에 추가 절개를 하여 털과 피부를 잘라 내어 복강의 선명한 시야를 만듭니다. 그런 다음 복막 안감으로 자르고 중간과 오른쪽과 왼쪽으로 잘라 장기에서 끌어냅니다.집게를 사용하여 내장을 들어 올리고 마우스 왼쪽으로 이동하여 어두운 빨간색, 타원형 비장에 부착 된 밝은 분홍색 췌장을 볼 수있는 공간을 만듭니다. 췌장 조직은 부드럽고 스폰지 질감을 갖습니다. 위장을 따라 흐르는 췌장을 잘라 내고 창자와 얽혀 있습니다.췌장에서 비장을 분리하고 췌장을 HBSS 10 밀리리터를 포함하는 50 밀리리터 튜브에 넣고 페니실린 연쇄 절제술을 한 번 씩 사용하여 라미나르 플로우 후드로 옮겨냅니다. 튜브의 내용물을 빈 계량 보트에 붓고 집게를 사용하여 췌장을 소용돌이로 씻어냅니다. 그런 다음, 집게를 사용하여 췌장을 페니실린 연쇄상 구균증으로 HBSS가 함유 된 두 번째 계량 보트로 이동하고 소용돌이에 의해 다시 씻습니다.췌장을 페니실린 연쇄상 구균증으로 HBSS가 함유된 세 번째 계량 보트로 옮기고 췌장을 5mm 또는 작은 조각으로 자르기 시작합니다. 계량 보트의 내용을 신선한 50 밀리리터 튜브에 붓기 위해 먼저 집게를 사용하여 배가 기울어질 때 췌장 조각을 액체로 옮겨 넣습니다. 조각이 더 이상 보트에 부착되지 않은 후, 튜브에 그 내용을 부어.집게로 남은 조각을 집어 들고 튜브의 집게를 씻으십시오. 2 분 동안 섭씨 4도에서 931 배 중력으로 튜브를 원심 분리 한 후 5 밀리리터 파이펫을 사용하여 HBSS 및 부동 지방을 제거하십시오. HBSS에 희석된 콜라게나아제 5밀리리터를 추가합니다.튜브를 닫고 튜브를 플라스틱 파라핀 필름으로 래핑하여 밀봉 된 뚜껑을 확인하십시오. 인큐베이터에 놓고 20분 동안 섭씨 37도에서 220 RPM에서 흔들어 놓습니다. 탁탁액을 산출하고 남은 조직 조각은 거의 없습니다.해리를 막으려면 튜브를 얼음 위에 놓고 5%의 FBS로 차가운 HBSS 5밀리리터를 추가합니다. 2분 동안 섭씨 4도에서 931배의 중력에서 원심분리한 후 5밀리리터 파이펫을 사용하여 상퍼를 제거합니다. 5%의 FBS로 HBSS 의 10 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고, 원심분리기는 섭씨 4도에서 2분 동안 931배의 중력으로 다시 정지합니다.5 밀리리터 파이펫을 사용하여 상체를 제거하고 5 % FBS와 HBSS의 또 다른 10 밀리리터와이 단계를 반복합니다. 그런 다음 5 %의 FBS로 HBSS의 5 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. P1000 파이펫을 사용하여 500 마이크로미터 메쉬를 통해 한 번에 1밀리리터의 셀 서스펜션을 50 밀리리터 튜브로 필터링합니다.메쉬를 통해 남은 췌장 세포를 세척하려면 5%의 FBS를 사용하여 HBSS의 5밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 P1000 파이펫을 사용하여 105 마이크로미터 메쉬를 통해 한 번에 이 여과 1 밀리리터를 50 밀리리터 튜브로 전달합니다. 이 셀 서스펜션을 30%의 FBS로 HBSS를 함유한 50밀리리터 튜브로 부드럽게 피펫하여 상단에 셀 서스펜션 층을 형성합니다.원심 분리는 2 분 동안 섭씨 4도에서 233 배 중력으로 이 세포 현탁액을 제거하고 상퍼를 제거합니다. 웨이머스의 완전한 배지를 1회 나타내세포에 함유한 펠릿을 다시 중단한다. 한 췌장은 두 개의 바이러스 성 감염에 대 한 충분 하기 때문에, 두 개의 뚜껑 사이 세포 현탁액을 분할 35 밀리 미터 플레이트, 현 탁 트에 감염을 허용.아데노바이러스 감염의 경우, 각 플레이트의 뚜껑에 1/1000 희석에 바이러스를 추가하고 소용돌이칩니다. 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 섭씨 37도, CO2 5%로 배치합니다. 첫 번째 시간 동안 15 분마다 소용돌이를 가하고 추가 로 2 시간 동안 인큐베이션을 계속하십시오.콜라겐 젤을 만들기 위해 1형 쥐 꼬리 콜라겐 7밀리리터, 웨이머스 의 10배 의 마이크로리터 700개, 얼음 위에 50밀리리터 튜브에 수산화나트륨 466.6 마이크로리터를 결합하여 콜라겐 젤을 만듭니다. 50 밀리리터 튜브에서 3시간 동안 배양한 후 동일한 양의 셀 서스펜션과 콜라겐 젤을 결합하고 부드럽게 섞습니다. 플레이트 2000 마이크로리터는 접시를 얼음에 보관하고 소용돌이면서 6개의 우물 판에 한 번에 잘 하여 콜라겐 세포 층을 고르게 분배합니다.매체를 고화시키기 위해 세포 배양 인큐베이터에서 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 30분간 배양한다. 그런 다음 원하는 자극이나 억제제로 Waymouth의 전체 배지를 1배 나 잘 할 때 1.5 밀리리터를 추가합니다. 다음 날, 그리고 격일로 매체를 변경합니다.사용되는 자극에 따라, 아시나르-덕탈 메타플라시아 또는 ADM은 3일째와 5일 사이에 관찰될 수 있다. GFP 아데노바이러스를 통한 감염 후 24시간, 콜라겐 또는 지하 막 매트릭스에 내장된 세포의 이미지는 감염이 효율적이라는 것을 보여주었다. 5 일 감염 후, 콜라겐형성 덕트 구조에 내장 된 세포는 TGF 알파의 밀리 리터 당 50 나노 그램으로 자극 할 때 덕트 같은 구조를 형성.지하 막 매트릭스에 내장 된 세포는 감염 후 5 일 동안 자극이없는 덕트 와 같은 구조를 형성했다. 반면 더 큰 덕트는 TGF 알파의 밀리리터 당 50 나노그램으로 자극시 형성되었다. 프로토콜에서 가장 중요한 점 중 하나는 콜라게나아제 소화의 길이입니다.적절한 소화는 탁탁액과 남은 조직 조각으로 표시됩니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

확산 내장 뇌교 신경 교종의 신속한 사후 세포 배양을위한 프로토콜 (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

연구

암 연구학

Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

증발 감소 문화 조건은 미세 적정 플레이트에서 다세포 회전 타원체 형성의 재현성을 증가

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

준비 및 췌장암 세포 및 섬유 아 세포의 3 차원 회전 타원 체 공동 문화의 변화 분석 결과

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

머리와 목 편평 상피 세포 암에 대 한 회전 타원 체 기반 3D 셀 문화 모델에서 테스트 하는 치료

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

3차원 스페로이드 배양에서 줄기와 같은 세포의 분리

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

종양 침투 T 세포 독성의 정형 외 췌장 종양 및 Ex 생체 특성의 생성

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

3D 배양에서 암 세포 침략 및 T 세포 세포 독성 을 감시

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer

췌장암의 정형소 절제술 마우스 모델

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer ...

Robot Assisted Distal Pancreatectomy with Celiac Axis Resection (DP-CAR) for Pancreatic Cancer: Surgical Planning and Technique

Robot Assisted Distal Pancreatectomy with Celiac Axis Resection DP-CAR for Pancreatic Cancer: Surgical Planning and Technique

췌장암을 위한 체강 축 절제술 (DP-CAR)를 가진 로봇 지원 황실 판생성절제술: 외과 계획 및 기술

Malignant pancreatic tumors involving the celiac artery can be resected with a distal pancreatectomy, splenectomy and celiac axis resection (DP-CAR), ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

환자 유래 종양 샘플에서 3차원 스페로이드 설정 및 약물에 대한 민감도 평가

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...