Name: mimicking and manipulating pancreatic acinar-to-ductal metaplasia in 3-dimensional cell culture
Uploaded: 2019-02-11T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture at JoVE.com

Este trabajo fue financiado por una subvención R01 (CA200572) de los NIH a PS. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente la opinión oficial del Instituto Nacional del cáncer o los institutos nacionales de Health.The donantes no tenían ningún papel en estudiar diseño, recopilación de datos y análisis, decisión publicar, o la preparación del manuscrito.

Todos los trabajos de animales fue aprobado por el IACUC de Clínica Mayo.
1. preparación de materiales, soluciones y 3-dimensional matriz Bases
<ol><li>Plazas de 76 mm corte 105 μm polipropileno mallas en 76 mm y 500 μm. Doblar cada cuadrado por la mitad dos veces para crear un cuadrado más pequeño doblado. Lugar uno 500 μm y un 105 de malla cuadrado dentro de una bolsa de autoclave.</li>
	<li>Malla de polipropileno de autoclave para plazas, así como dos pares de tijeras y fórceps.<...

<ol>
	<li>Rooman, I., Real, F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+ductal+adenocarcinoma+and+acinar+cells:+a+matter+of+differentiation+and+development.">Pancreatic ductal adenocarcinoma and acinar cells: a matter of differentiation and development.</a> Gut. 61 (3), 449-458 (2012).</li><li>Stanger, B. Z., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+identity+in+pancreas+development+and+regeneration.">Control of cell identity in pancreas development and regeneration.</a> Gastroenterology. 144 (6), 1170-1179 (2013).</li><li>Caldas, C., Kern, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K-ras+mutation+and+pancreatic+adenocarcinoma.">K-ras mutation and pancreatic adenocarcinoma.</a> International Journal of Pancreatology. 18 (1), 1-6 (1995).</li><li>Kopp, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Sox9-dependent+acinar-to-ductal+reprogramming+as+the+principal+mechanism+for+initiation+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).</li><li>Morris, J. P. t., Cano, D. A., Sekine, S., Wang, S. C., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-catenin+blocks+Kras-dependent+reprogramming+of+acini+into+pancreatic+cancer+precursor+lesions+in+mice.">Beta-catenin blocks Kras-dependent reprogramming of acini into pancreatic cancer precursor lesions in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (2), 508-520 (2010).</li><li>Grippo, P. J., Nowlin, P. S., Demeure, M. J., Longnecker, D. S., Sandgren, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preinvasive+pancreatic+neoplasia+of+ductal+phenotype+induced+by+acinar+cell+targeting+of+mutant+Kras+in+transgenic+mice.">Preinvasive pancreatic neoplasia of ductal phenotype induced by acinar cell targeting of mutant Kras in transgenic mice.</a> Cancer Research. 63 (9), 2016-2019 (2003).</li><li>Sawey, E. T., Johnson, J. A., Crawford, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+7+controls+pancreatic+acinar+cell+transdifferentiation+by+activating+the+Notch+signaling+pathway.">Matrix metalloproteinase 7 controls pancreatic acinar cell transdifferentiation by activating the Notch signaling pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19327-19332 (2007).</li><li>Liou, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-secreted+cytokines+drive+pancreatic+acinar-to-ductal+metaplasia+through+NF-kappaB+and+MMPs.">Macrophage-secreted cytokines drive pancreatic acinar-to-ductal metaplasia through NF-kappaB and MMPs.</a> Journal of Cell Biology. 202 (3), 563-577 (2013).</li><li>De La, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+and+Kras+reprogram+pancreatic+acinar+cells+to+ductal+intraepithelial+neoplasia.">Notch and Kras reprogram pancreatic acinar cells to ductal intraepithelial neoplasia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18907-18912 (2008).</li><li>Habbe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+induction+of+murine+pancreatic+intraepithelial+neoplasia+(mPanIN)+by+acinar+cell+targeting+of+oncogenic+Kras+in+adult+mice.">Spontaneous induction of murine pancreatic intraepithelial neoplasia (mPanIN) by acinar cell targeting of oncogenic Kras in adult mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18913-18918 (2008).</li><li>Liou, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+KRas-Induced+Mitochondrial+Oxidative+Stress+in+Acinar+Cells+Upregulates+EGFR+Signaling+to+Drive+Formation+of+Pancreatic+Precancerous+Lesions.">Mutant KRas-Induced Mitochondrial Oxidative Stress in Acinar Cells Upregulates EGFR Signaling to Drive Formation of Pancreatic Precancerous Lesions.</a> Cell Report. 14 (10), 2325-2336 (2016).</li><li>Hughes, P., Marshall, D., Reid, Y., Parkes, H., Gelber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+costs+of+using+unauthenticated,+over-passaged+cell+lines:+how+much+more+data+do+we+need.">The costs of using unauthenticated, over-passaged cell lines: how much more data do we need.</a> Biotechniques. 43 (5), 577-578 (2007).</li><li>Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+explant+outgrowth+culture+model+for+mouse+pancreatic+acinar+cells+with+long-term+maintenance+of+secretory+phenotype.">A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype.</a> European Journal of Cell Biology. 90 (12), 1052-1060 (2011).</li><li>Gout, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+primary+pancreatic+acinar+cells.">Isolation and culture of mouse primary pancreatic acinar cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Artym, V. V., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cells+in+three-dimensional+collagen+matrix.">Imaging cells in three-dimensional collagen matrix.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 11-20 (2010).</li><li>Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+cytoskeletal+organization+of+invasive+cancer+cells+in+3D.">Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), e50763 (2013).</li></ol>

El relativamente corto período de tiempo de aislamiento, infección y revestimiento primarias células acinares es una ventaja de este método. Por el contrario, cultivo de células acinares de explante consecuencia requiere poco tiempo práctica, pero tarda siete días para la derivación de células acinares13. Un protocolo alternativo para acinar aislamiento14 notas de un método muy corto para la obtención de células acinares; sin embargo, el EGF es un componente ese...

La metaplasia acinar-ductal (ADM) es un mecanismo de protección durante la pancreatitis y un proceso clave de desarrollo de cáncer de páncreas1 que requiere aún más la visión mecanicista de la conducción. Mientras ADM inducida por la inflamación es reversible2, las mutaciones oncogénicas KRAS , que están presentes en el 90% de los casos de cáncer de páncreas3, evitan la diferenciación hacia un fenotipo acinar4,5, 6. cultivo y diferenciando las células acinares primarias en células ductales en cultura 3D permite el estudio de los mecanismos moleculares que regulan el proceso de ADM, que es difícil estudiar en vivo. Tales ex vivo estudios permiten la visualización en tiempo real de ADM, sus conductores y sus reguladores. Se han identificado varios conductores del proceso ADM, así como la visión mecanicista de sus vías de señalización corriente abajo, o verificado usando el aquí descrito método. Estos incluyen inducción de ADM por TGF-α (alfa del factor de crecimiento transformador)-mediada por la expresión de MMP-7 (matriz metaloproteinasa-7) y la activación de ranura7, así como RANTES (regulado en la activación, célula T normal expresado y secretado; también conocido como quimiocina ligando 5 o CCL5) y TNFα (factor de necrosis tumoral alfa)-inducida por ADM a través de la activación de NF-κB (factor nuclear-κB)8. Un mediador adicional de ADM es oncogénico KRas9,10, que provoca un aumento en el estrés oxidativo que mejora el proceso ADM a través del aumento de la expresión de EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico) y sus ligandos, EGF ( factor de crecimiento epidérmico) y TGF-α11.
Mientras que el uso de líneas celulares de cáncer de páncreas es común que en estudios in vitro, cultivos de células primarias ofrecen muchas ventajas. Por ejemplo, las células acinares primarias de ratones no transgénicos o ratones que mutaciones iniciadoras, como KrasG12D, son el modelo más apropiado para estudiar el evento temprano de ADM porque las células tienen pocos y controladas las mutaciones, que se sabe que estar presente temprano en el desarrollo de cáncer de páncreas. Esto es a diferencia de muchas líneas celulares de cáncer de páncreas que tienen mutaciones múltiples y variadas de expresión basado en paso número12. Además, las vías de señalización identificadas por estos medios han sido verificadas por estudios en animales. Una advertencia del uso de las células acinares primarias es que no pueden ser transfectadas como líneas celulares de cáncer típica pueden.
El método en el presente documento detalla las técnicas de aislamiento de células acinares, cultura 3D que imita el ADM por adición de estimulantes o modulación de expresión de la proteína vía infección adenoviral o lentivirales, así como la aislamiento de las células en el extremo de mayores análisis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2181px;" width="2179">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:357px;">37 &#176;C shaking incubator</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:171px;">SHKE4000-7</td>
			<td style="width:1487px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:357px;">5% CO2, 37 &#176;C Incubator</td>
			<td style="width:167px;">NUAIRE</td>
			<td style="width:171px;">NU-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">50 ml tubes</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Absorbent pad, 20&#34; x 24&#34;</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">1420662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Adenovirus, Ad-GFP</td>
			<td style="width:167px;">Vector Biolabs&#160;</td>
			<td style="width:171px;">1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">01-213-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">BD Precision Glide Needle 21G x 1/2</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:171px;">305167</td>
			<td>Use as pins for dissection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Beaker, 600 mL</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">FB-101-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Bleach, 8.25%</td>
			<td style="width:167px;">Clorox</td>
			<td style="width:171px;">31009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Cell Recovery Solution</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:171px;">354253</td>
			<td>Referred to as &#39;basement membrane matrix recovery solution&#39; in the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:171px;">Allegra X-15R Centrifuge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Collagenase Type I, Clostridium histolyticum</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">C0130-1G</td>
			<td>Create a 100 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">D1756</td>
			<td>Create a 4 mg/ml solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Ethanol, 200 proof</td>
			<td style="width:167px;">Decon Laboratories&#160;</td>
			<td style="width:171px;">2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">F0926-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:171px;">11002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:171px;">91127-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Glass slide, 8-well</td>
			<td style="width:167px;">Lab-Tek</td>
			<td style="width:171px;">177402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:171px;">SH3048801</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Ice bucket, rectangular</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:171px;">07-210-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Instant Sealing Sterilization Pouch</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">01-812-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection)&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Minigrip</td>
			<td style="width:171px;">SBL2X69S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Lentiviral Packaging Mix, Virapower</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:171px;">44-2050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Matrigel</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:171px;">356234</td>
			<td>Referred to as &#39;basement membrane matrix&#39; in the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Parafilm</td>
			<td style="width:167px;">Bemis</td>
			<td style="width:171px;">PM992</td>
			<td>Referred to as &#39;plastic paraffin film&#39; in the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PBS</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:171px;">SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipet tips, 10 &#181;l</td>
			<td style="width:167px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:171px;">1110-3700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipet tips, 1000 &#181;l&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Olympus Plastics</td>
			<td style="width:171px;">24-165RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipet tips, 200 &#181;l&#160;</td>
			<td style="width:167px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:171px;">1111-1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipet-Aid</td>
			<td style="width:167px;">Drummond</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PIPETMAN Classic P10, 1-10 &#956;l</td>
			<td style="width:167px;">Gilson</td>
			<td style="width:171px;">F144802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 &#956;l</td>
			<td style="width:167px;">Gilson</td>
			<td style="width:171px;">F123602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PIPETMAN Classic P20, 2-20 &#956;l</td>
			<td style="width:167px;">Gilson</td>
			<td style="width:171px;">F123600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PIPETMAN Classic P200, 20-200 &#956;l</td>
			<td style="width:167px;">Gilson</td>
			<td style="width:171px;">F123601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipettes, 10 ml&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipettes, 25 ml</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">357525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipettes, 5 ml&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Plate, 12-well</td>
			<td style="width:167px;">Corning Costar</td>
			<td style="width:171px;">3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Plate, 24-well plate</td>
			<td style="width:167px;">Corning Costar</td>
			<td style="width:171px;">3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Plate, 35 mm</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Plate, 6-well</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Polybrene</td>
			<td style="width:167px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:171px;">TR-1003-G</td>
			<td>Create a 40 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Polypropylene Mesh, 105 &#181;m</td>
			<td style="width:167px;">Spectrum Labs</td>
			<td style="width:171px;">146436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Polypropylene Mesh, 500 &#181;m&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Spectrum Labs</td>
			<td style="width:171px;">146418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Scissors&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:171px;">14568-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Scissors&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:171px;">91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Sodium Bicarbonate (Fine White Powder)</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:171px;">BP328-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:171px;">S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:357px;">Soybean Trypsin Inhibitor 8</td>
			<td style="width:167px;">Gibco</td>
			<td style="width:171px;">17075029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Spatula</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">21-401-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Steriflip 50 ml, 0.22 micron filters&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">TGF-&#945;</td>
			<td style="width:167px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:171px;">239-A-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Type I Rat Tail Collagen</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:171px;">354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Waymouth MB 752/1 Medium (powder)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">W1625-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Weigh boat, hexagonal, medium&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">02-202-101</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mimicking and manipulating pancreatic acinar-to-ductal metaplasia in 3-dimensional cell culture

La diferenciación de las células acinares a células ductales durante pancreatitis y en el desarrollo temprano del cáncer de páncreas es un proceso clave que requiere mayor estudio. Para entender los mecanismos de regulación metaplasia acinar ductal (ADM), ex cultura 3D vivo y diferenciación de las células acinares primarias a células ductales ofrece muchas ventajas sobre otros sistemas. Con la técnica aquí, modulación de la expresión de la proteína es simple y rápida, requiere solamente de un día para aislar, estimular o virus infectar y comenzar el cultivo de las células acinares primarias para investigar el proceso ADM. En contraste con utilizando la matriz de la membrana basal, la siembra de racimos de células acinares en colágeno I matriz extracelular, permite a las células acinares conservan su identidad acinar antes de manipulación. Esto es vital cuando la contribución de los diversos componentes para la inducción de la ADM. No sólo son los efectos de citoquinas u otros factores ectopically administrados comprobable a través de esta técnica, pero la contribución de común mutaciones, expresión de la proteína aumento o caída de expresión de la proteína es comprobable a través de la infección viral del primario las células acinares, uso de vectores lentivirales o adenoviral. Además, las células se puede volver a aisladas de colágeno o matriz de la membrana del sótano en el extremo y analizan para la expresión de la proteína.

Finalización del protocolo aquí ocurre dentro de un día y sobre el estímulo, el ADM se ve en 3-5 días. La figura 1 muestra la secuencia del método, por el que se completan los pasos 1 a 4 en el primer día. Esto incluye preparación, aislamiento acinar, infección viral y empotramiento en colágeno o matriz de la membrana del sótano. Mientras que la matriz de la membrana del sótano induce ADM, células acinares en colágeno requieren un estímulo, com...

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Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

Imitando y manipulando Metaplasia pancreática Acinar Ductal en cultivo celular 3-dimensional

Aislamiento primario de la célula acinar, la modulación de actividad o expresión de la proteína, cultura y últimas aplicaciones son muy útiles en el ex estudio vivo de metaplasia acinar ductal (ADM), un evento temprano en el desarrollo de cáncer de páncreas.

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Nuestro protocolo ofrece visualización directa de la Metaplasia Acinar-Ductal y permite el estudio de la contribución de factores administrados ectópicamente o modulación de proteínas a este proceso. La principal ventaja de esta técnica es que la Metaplasia Acinar-ductal se puede ver en tiempo real y se pueden realizar estudios de señalización celular. Para diseccionar el páncreas de un ratón eutanasiado, primero clavar las patas del ratón a la tapa de poliestireno, orientarlo de modo que la cola está frente al investigador y rociar el abdomen con 70%etanol.Utilice fórceps autoclaves para levantar el pelaje y la piel en la línea media, y con tijeras autoclaves, haga una incisión a través del pelaje y la piel desde la abertura uretral hasta el área de la caja torácica del diafragma. Haga incisiones adicionales a la izquierda y a la derecha para cortar el pelaje y la piel, creando una vista clara de la cavidad abdominal. Luego, corta en el revestimiento peritoneal, por el centro y hacia la derecha y la izquierda y aparta de los órganos.Usa los fórceps para levantar los intestinos y moverlos al lado izquierdo del ratón, creando espacio para ver el páncreas rosado claro unido al bazo oscuro, rojo y ovalado. El tejido pancreático tendrá una textura suave y esponjosa. Cortar el páncreas, que corre a lo largo del estómago, entrelazando con los intestinos.Separe el bazo del páncreas y coloque el páncreas en un tubo de 50 mililitros que contenga 10 mililitros de HBSS, con una vez estreptomicina de penicilina y transfiéralo a la campana de flujo laminar. Vierta el contenido del tubo en un bote de pesaje vacío y use fórceps para lavar el páncreas arremolinado. Luego, utilice los fórceps para mover el páncreas a un segundo bote de pesaje que contenga HBSS con estreptomicina de penicilina y lavar de nuevo girando.Mueva el páncreas al tercer bote de pesaje que contiene HBSS con estreptomicina de penicilina y comience a cortar el páncreas en trozos de cinco milímetros o más pequeños. Para verter el contenido del bote de pesaje en un tubo fresco de 50 mililitros, primero utilice los fórceps para mover las piezas del páncreas en el líquido mientras el barco está siendo inclinado. Una vez que las piezas ya no estén unidas al barco, vierta su contenido en el tubo.Recoja las piezas restantes con los fórceps y lave los fórceps en el tubo. Después de centrifugar el tubo a 931 veces la gravedad a cuatro grados centígrados durante dos minutos, utilice una pipeta de cinco mililitros para eliminar el HBSS y cualquier grasa flotante. Añadir cinco mililitros de colagenasa diluidos en HBSS.Cierre el tubo y asegúrese de que la tapa esté sellada envolviendo el tubo en una película de parafina de plástico. Colóquelo en una incubadora, agitando a 220 RPM a 37 grados Celsius durante 20 minutos. Lo que producirá la solución turbia, y pocos trozos de tejido restantes.Para detener la disociación, coloque el tubo sobre hielo y agregue cinco mililitros de HBSS frío con 5%FBS. Después de centrifugar a 931 veces la gravedad a cuatro grados centígrados durante dos minutos, retire el sobrenadante usando una pipeta de cinco mililitros. Vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de HBSS con 5% FBS, y centrifugar de nuevo a 931 veces la gravedad durante dos minutos a cuatro grados centígrados.Retire el sobrenadante con una pipeta de cinco mililitros y repita este paso con otros 10 mililitros de HBSS con 5%FBS. A continuación, vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de HBSS con 5%FBS. Utilice una pipeta P1000 para filtrar la suspensión celular de un mililitro a la vez a través de una malla de 500 micrómetros en un tubo de 50 mililitros.Para lavar las células pancreáticas restantes a través de la malla, agregue cinco mililitros adicionales de HBSS con 5%FBS. A continuación, utilice una pipeta P1000 para pasar este filtrado de un mililitro a la vez a través de la malla de 105 micrómetros en un tubo de 50 mililitros. Pipetee suavemente esta suspensión celular en un tubo de 50 mililitros que contenga HBSS con 30%FBS, que formará una capa de suspensión celular en la parte superior.Centrifugar esta suspensión celular a 233 veces la gravedad a cuatro grados centígrados durante dos minutos y retire el sobrenadante. Re-suspende el pellet que contiene las células Acinar en una vez el medio completo de Waymouth. Dado que un páncreas es suficiente para dos infecciones virales, dividir la suspensión celular entre los párpados de dos placas de 35 milímetros, lo que permite la infección en suspensión.Para la infección adenoviral, agregue el virus a una dilución de 1/1000 a la tapa de cada plato y gire. Coloque las placas en una incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados y 5%CO2. Gire cada 15 minutos durante la primera hora y continúe la incubación durante dos horas adicionales.Para hacer un gel de colágeno, combine siete mililitros de colágeno de cola de rata tipo uno, 700 microlitros de 10 veces el medio de Waymouth y 466,6 microlitros de 0,34 molar de hidróxido de sodio en un tubo de 50 mililitros sobre hielo para hacer gel de colágeno. En un tubo de 50 mililitros, combine volúmenes iguales de suspensión celular y gel de colágeno después de tres horas de incubación y mezcle suavemente. Placa 2000 microlitros, uno bien a la vez en una placa de seis pozos mientras mantiene la placa en hielo y remolino para distribuir uniformemente la capa de celda de colágeno.Para solidificar el medio, incubar la placa en una incubadora de cultivo celular a 37 grados celsius y 5% dióxido de carbono durante 30 minutos. A continuación, añadir 1,5 mililitros por pozo de una de las veces medio completo de Waymouth con estímulo o inhibidores deseados. Cambie el medio al día siguiente y luego cada dos días.Dependiendo del estímulo utilizado, se puede observar metaplasia a-ductal o ADM entre el día tres y el día cinco. 24 horas después de la infección con adenovirus GFP, imágenes de células incrustadas en colágeno o matriz de membrana sótano, mostraron que la infección era eficiente. A los cinco días después de la infección, las células incrustadas en estructuras similares a conductos de colágeno cuando se estimulan con 50 nanogramos por mililitro de TGF alfa.Las células incrustadas en la matriz de membrana del sótano formaron estructuras similares a conductos en ausencia de un estímulo a los cinco días después de la infección. Mientras que los conductos más grandes se formaron tras la estimulación con 50 nanogramos por mililitro de TGF alfa. Uno de los puntos más críticos en el protocolo es la longitud de la digestión de la colagenasa.La digestión adecuada se indica mediante una solución turbia y pocos trozos de tejido restantes.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Un protocolo para la rápida post-mortem de cultivos celulares de glioma pontino intrínsecos difusos (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

La evaporación de reducción de Cultura condición aumenta la reproducibilidad del esferoide multicelular Formación en placas de microtitulación

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Preparación y análisis metabólico de 3 dimensiones del esferoide co-cultivos de células de cáncer de páncreas y fibroblastos

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Terapia de prueba en un modelo de cultivo celular 3D basado en el esferoide para cabeza y cuello de células escamosas

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Aislamiento de células similares a tallos de cultivos esferoides tridimensionales

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generación de tumores pancreáticos ortotópicos y caracterización ex vivo de la citotoxicidad de células T infiltrantes en tumores

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Monitoreo de la invasión de células cancerosas y la citotoxicidad de células T en el cultivo 3D

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer

Un modelo ortotópico de ratón reseccional de cáncer de páncreas

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer ...

Robot Assisted Distal Pancreatectomy with Celiac Axis Resection (DP-CAR) for Pancreatic Cancer: Surgical Planning and Technique

Robot Assisted Distal Pancreatectomy with Celiac Axis Resection DP-CAR for Pancreatic Cancer: Surgical Planning and Technique

Pancreatectomía distal asistida por robot con resección del eje celíaco (DP-CAR) para el cáncer de páncreas: planificación y técnica quirúrgica

Malignant pancreatic tumors involving the celiac artery can be resected with a distal pancreatectomy, splenectomy and celiac axis resection (DP-CAR), ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Establecimiento de esferoides tridimensionales a partir de muestras tumorales derivadas de pacientes y evaluación de su sensibilidad a los fármacos

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...