Name: mimicking and manipulating pancreatic acinar-to-ductal metaplasia in 3-dimensional cell culture
Uploaded: 2019-02-11T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture at JoVE.com

Detta arbete stöds av en R01 grant (CA200572) från NIH till PS. Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Cancer Institute eller den nationella institut av Health.The finansiärer hade ingen roll i studera design, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet.

Alla djur arbetet godkändes av de Mayo Clinic IACUC.
1. beredning av material, lösningar och 3-dimensionella matris baser
<ol><li>Skär 500 µm och 105 µm polypropylen maskor till 76 mm av 76 mm rutor. Vik varje kvadrat på mitten två gånger för att skapa en mindre vikta kvadrat. Plats en 500 µm och en 105 µm mesh torget till ett autoklaverbart påse.</li>
	<li>Autoklav polypropylen mesh torg, samt två par sax och pincett.</li>
	<li>
Gör 100 mL 10 x Waymouths lösning. Rör...

<ol>
	<li>Rooman, I., Real, F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+ductal+adenocarcinoma+and+acinar+cells:+a+matter+of+differentiation+and+development.">Pancreatic ductal adenocarcinoma and acinar cells: a matter of differentiation and development.</a> Gut. 61 (3), 449-458 (2012).</li><li>Stanger, B. Z., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+identity+in+pancreas+development+and+regeneration.">Control of cell identity in pancreas development and regeneration.</a> Gastroenterology. 144 (6), 1170-1179 (2013).</li><li>Caldas, C., Kern, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K-ras+mutation+and+pancreatic+adenocarcinoma.">K-ras mutation and pancreatic adenocarcinoma.</a> International Journal of Pancreatology. 18 (1), 1-6 (1995).</li><li>Kopp, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Sox9-dependent+acinar-to-ductal+reprogramming+as+the+principal+mechanism+for+initiation+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).</li><li>Morris, J. P. t., Cano, D. A., Sekine, S., Wang, S. C., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-catenin+blocks+Kras-dependent+reprogramming+of+acini+into+pancreatic+cancer+precursor+lesions+in+mice.">Beta-catenin blocks Kras-dependent reprogramming of acini into pancreatic cancer precursor lesions in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (2), 508-520 (2010).</li><li>Grippo, P. J., Nowlin, P. S., Demeure, M. J., Longnecker, D. S., Sandgren, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preinvasive+pancreatic+neoplasia+of+ductal+phenotype+induced+by+acinar+cell+targeting+of+mutant+Kras+in+transgenic+mice.">Preinvasive pancreatic neoplasia of ductal phenotype induced by acinar cell targeting of mutant Kras in transgenic mice.</a> Cancer Research. 63 (9), 2016-2019 (2003).</li><li>Sawey, E. T., Johnson, J. A., Crawford, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+7+controls+pancreatic+acinar+cell+transdifferentiation+by+activating+the+Notch+signaling+pathway.">Matrix metalloproteinase 7 controls pancreatic acinar cell transdifferentiation by activating the Notch signaling pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19327-19332 (2007).</li><li>Liou, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-secreted+cytokines+drive+pancreatic+acinar-to-ductal+metaplasia+through+NF-kappaB+and+MMPs.">Macrophage-secreted cytokines drive pancreatic acinar-to-ductal metaplasia through NF-kappaB and MMPs.</a> Journal of Cell Biology. 202 (3), 563-577 (2013).</li><li>De La, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+and+Kras+reprogram+pancreatic+acinar+cells+to+ductal+intraepithelial+neoplasia.">Notch and Kras reprogram pancreatic acinar cells to ductal intraepithelial neoplasia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18907-18912 (2008).</li><li>Habbe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+induction+of+murine+pancreatic+intraepithelial+neoplasia+(mPanIN)+by+acinar+cell+targeting+of+oncogenic+Kras+in+adult+mice.">Spontaneous induction of murine pancreatic intraepithelial neoplasia (mPanIN) by acinar cell targeting of oncogenic Kras in adult mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18913-18918 (2008).</li><li>Liou, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+KRas-Induced+Mitochondrial+Oxidative+Stress+in+Acinar+Cells+Upregulates+EGFR+Signaling+to+Drive+Formation+of+Pancreatic+Precancerous+Lesions.">Mutant KRas-Induced Mitochondrial Oxidative Stress in Acinar Cells Upregulates EGFR Signaling to Drive Formation of Pancreatic Precancerous Lesions.</a> Cell Report. 14 (10), 2325-2336 (2016).</li><li>Hughes, P., Marshall, D., Reid, Y., Parkes, H., Gelber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+costs+of+using+unauthenticated,+over-passaged+cell+lines:+how+much+more+data+do+we+need.">The costs of using unauthenticated, over-passaged cell lines: how much more data do we need.</a> Biotechniques. 43 (5), 577-578 (2007).</li><li>Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+explant+outgrowth+culture+model+for+mouse+pancreatic+acinar+cells+with+long-term+maintenance+of+secretory+phenotype.">A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype.</a> European Journal of Cell Biology. 90 (12), 1052-1060 (2011).</li><li>Gout, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+primary+pancreatic+acinar+cells.">Isolation and culture of mouse primary pancreatic acinar cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Artym, V. V., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cells+in+three-dimensional+collagen+matrix.">Imaging cells in three-dimensional collagen matrix.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 11-20 (2010).</li><li>Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+cytoskeletal+organization+of+invasive+cancer+cells+in+3D.">Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), e50763 (2013).</li></ol>

Den relativt korta tid för isolering, infektion och plätering primära acinar celler är en fördel med denna metod. Däremot odlingsskålar acinar celler från en explant utväxt kräver lite hands-on tid, men det tar sju dagar för utväxten acinar celler13. Ett alternativt protokoll för acinar isolering14 noterar en mycket kort metod för att erhålla acinar celler; EGF är dock en viktig komponent i att hålla acinar celler levande vid isolerade använder protokollet...

Acinar-till-duktal metaplasi (ADM) är en skyddande mekanism under pankreatit och en viktig process som kör pankreascancer utveckling1 som kräver ytterligare mekanistiska insikter. Även inflammation-inducerad ADM är vändbar2, förhindra onkogena KRAS -mutationer, som är närvarande i 90% av cancer i bukspottskörteln fall3, differentiering tillbaka till ett acinar fenotyp4,5, 6. Culturing och differentiera primära acinar celler i duktal celler i 3D kultur möjliggör studiet av de molekylära mekanismer som reglerar ADM processen, vilket är svårt att studera invivo. Sådan ex vivo studier aktivera realtid visualisering av ADM, dess förare och dess tillsynsmyndigheter. Flera förare av de ADM process som mekanistisk insikt om deras nedströms signalvägar, har identifierats eller verifierade med hjälp av här beskrivna metoden. Dessa inkluderar ADM-induktion av TGF-α (omvandla tillväxtfaktor alpha)-medierade uttryck av MMP-7 (matrix metalloproteinas-7) och aktivering av Notch7, liksom RANTES (reglerat på aktivering, normala T-cell uttryckt och utsöndras; också känt som chemokine ligand 5 eller CCL5) och TNFα (tumörnekrosfaktor alfa)-inducerad ADM genom aktivering av NF-κB (nuclear factor-κB)8. En ytterligare medlare av ADM är onkogena KRas9,10, vilket orsakar en ökning av oxidativ stress som förbättrar ADM processen via ökat uttryck av EGFR (epidermal tillväxtfaktor receptor) och dess ligander, EGF ( Epidermal tillväxtfaktor) och TGF-α11.
Även användning av pankreas cancer cellinjer är vanligt för in vitro-studier, erbjuder primära cellkulturer många fördelar. Exempelvis primära acinar celler från icke-transgena möss eller möss härbärgerat initierande mutationer, såsom KrasG12D, är den lämpligaste modellen för att studera tidiga händelsen av ADM eftersom cellerna har några och kontrollerad mutationer, som är kända för att vara närvarande tidigt i cancer i bukspottskörteln utveckling. Detta är i kontrast till många bukspottskörteln cancer cellinjer som har flera mutationer och varierade uttryck baserat på passagen nummer12. Dessutom har de signalvägar som identifierats av sådana medel verifierats av djurstudier. En varning för att använda primära acinar celler är att de inte kan vara transfekterade typiska cancer cellinjer kan.
Metoden häri Detaljer tekniker för acinar cell isolering, 3D kultur som härmar ADM genom att lägga till stimulantia eller modulerande proteinuttryck via adenovirala eller lentiviral infektion, samt ny isolering av celler vid slutpunkten för ytterligare analyser.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2181px;" width="2179">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:357px;">37 &#176;C shaking incubator</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:171px;">SHKE4000-7</td>
			<td style="width:1487px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:357px;">5% CO2, 37 &#176;C Incubator</td>
			<td style="width:167px;">NUAIRE</td>
			<td style="width:171px;">NU-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">50 ml tubes</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Absorbent pad, 20&#34; x 24&#34;</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">1420662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Adenovirus, Ad-GFP</td>
			<td style="width:167px;">Vector Biolabs&#160;</td>
			<td style="width:171px;">1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">01-213-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">BD Precision Glide Needle 21G x 1/2</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:171px;">305167</td>
			<td>Use as pins for dissection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Beaker, 600 mL</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">FB-101-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Bleach, 8.25%</td>
			<td style="width:167px;">Clorox</td>
			<td style="width:171px;">31009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Cell Recovery Solution</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:171px;">354253</td>
			<td>Referred to as &#39;basement membrane matrix recovery solution&#39; in the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:171px;">Allegra X-15R Centrifuge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Collagenase Type I, Clostridium histolyticum</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">C0130-1G</td>
			<td>Create a 100 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">D1756</td>
			<td>Create a 4 mg/ml solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Ethanol, 200 proof</td>
			<td style="width:167px;">Decon Laboratories&#160;</td>
			<td style="width:171px;">2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">F0926-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:171px;">11002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:171px;">91127-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Glass slide, 8-well</td>
			<td style="width:167px;">Lab-Tek</td>
			<td style="width:171px;">177402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:171px;">SH3048801</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Ice bucket, rectangular</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:171px;">07-210-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Instant Sealing Sterilization Pouch</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">01-812-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection)&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Minigrip</td>
			<td style="width:171px;">SBL2X69S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Lentiviral Packaging Mix, Virapower</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:171px;">44-2050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Matrigel</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:171px;">356234</td>
			<td>Referred to as &#39;basement membrane matrix&#39; in the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Parafilm</td>
			<td style="width:167px;">Bemis</td>
			<td style="width:171px;">PM992</td>
			<td>Referred to as &#39;plastic paraffin film&#39; in the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PBS</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:171px;">SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipet tips, 10 &#181;l</td>
			<td style="width:167px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:171px;">1110-3700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipet tips, 1000 &#181;l&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Olympus Plastics</td>
			<td style="width:171px;">24-165RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipet tips, 200 &#181;l&#160;</td>
			<td style="width:167px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:171px;">1111-1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipet-Aid</td>
			<td style="width:167px;">Drummond</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PIPETMAN Classic P10, 1-10 &#956;l</td>
			<td style="width:167px;">Gilson</td>
			<td style="width:171px;">F144802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 &#956;l</td>
			<td style="width:167px;">Gilson</td>
			<td style="width:171px;">F123602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PIPETMAN Classic P20, 2-20 &#956;l</td>
			<td style="width:167px;">Gilson</td>
			<td style="width:171px;">F123600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PIPETMAN Classic P200, 20-200 &#956;l</td>
			<td style="width:167px;">Gilson</td>
			<td style="width:171px;">F123601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipettes, 10 ml&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipettes, 25 ml</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">357525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipettes, 5 ml&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Plate, 12-well</td>
			<td style="width:167px;">Corning Costar</td>
			<td style="width:171px;">3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Plate, 24-well plate</td>
			<td style="width:167px;">Corning Costar</td>
			<td style="width:171px;">3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Plate, 35 mm</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Plate, 6-well</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Polybrene</td>
			<td style="width:167px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:171px;">TR-1003-G</td>
			<td>Create a 40 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Polypropylene Mesh, 105 &#181;m</td>
			<td style="width:167px;">Spectrum Labs</td>
			<td style="width:171px;">146436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Polypropylene Mesh, 500 &#181;m&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Spectrum Labs</td>
			<td style="width:171px;">146418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Scissors&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:171px;">14568-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Scissors&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:171px;">91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Sodium Bicarbonate (Fine White Powder)</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:171px;">BP328-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:171px;">S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:357px;">Soybean Trypsin Inhibitor 8</td>
			<td style="width:167px;">Gibco</td>
			<td style="width:171px;">17075029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Spatula</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">21-401-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Steriflip 50 ml, 0.22 micron filters&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">TGF-&#945;</td>
			<td style="width:167px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:171px;">239-A-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Type I Rat Tail Collagen</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:171px;">354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Waymouth MB 752/1 Medium (powder)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">W1625-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Weigh boat, hexagonal, medium&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">02-202-101</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mimicking and manipulating pancreatic acinar-to-ductal metaplasia in 3-dimensional cell culture

Differentiering av acinar celler till duktal celler under pankreatit och i den tidiga utvecklingen av cancer i bukspottskörteln är en viktig process som kräver vidare studier. För att förstå mekanismerna som erbjuder reglerar acinar-till-duktal metaplasi (ADM), ex vivo 3D kultur och differentiering av primära acinar celler till duktal celler många fördelar jämfört med andra system. Med tekniken häri är modulering av proteinuttryck enkel och snabb, kräver bara en dag att isolera, stimulera eller viralt infektera och börja odla primära acinar celler för att undersöka ADM processen. I motsats till med basalmembranet matris, odling av acinar cell kluster i kollagen jag extracellulärmatrix, tillåter acinar celler för att behålla deras acinar identitet innan manipulation. Detta är mycket viktigt när du testar olika komponenter till induktion av ADM. bidrag Inte bara är effekterna av cytokiner eller andra ectopically administrerade faktorer testbara genom denna teknik, men bidraget från vanliga mutationer, ökat proteinuttryck eller Nedslagning av proteinuttryck är testbara via virusinfektion primära acinar celler, med hjälp av lentiviral eller adenovirala vektorer. Dessutom celler åter kan isoleras från kollagen eller basalmembranet matris på slutpunkten och analyseras för proteinuttryck.

Slutförande av protokollet häri uppstår inom ett dygn och vid stimulering, ADM ses i 3-5 dagar. Figur 1 illustrerar sekvensen av metoden, whereby steg 1 till 4 är slutfört den första dagen. Detta inkluderar förberedelse, acinar isolering, virusinfektion och ingjutning i kollagen eller basalmembranet matris. Medan basalmembranet matrisen framkallar ADM, acinar celler inom kollagen jag kräver ett stimulus, såsom TGF-α, genomgå differentiering till du...

Watch this Scientific Journal Video about Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture at JoVE.com

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

Härma och manipulera bukspottskörteln Acinar-till-duktal metaplasi i 3-dimensionell cellodling

Primära acinar cell isolering, protein uttryck eller aktivitet modulering, kultur och nedströms tillämpningar är rikligt användbara i ex vivo studie av acinar-till-duktal metaplasi (ADM), en tidig händelse i utvecklingen av cancer i bukspottskörteln.

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Vårt protokoll erbjuder direkt visualisering av Acinar-till-duktal metaplasi och möjliggör studiet av bidraget av ektopiskt administrerade faktorer eller proteinmodulering till denna process. Den största fördelen med denna teknik är att Acinar-till-Ductal Metaplasi kan ses i realtid och cell signalering studier kan utföras. För att dissekera bukspottkörteln från en avlivad mus, fäster först musens tassar till polystyrenlocket, orienterar den så att svansen är vänd mot forskaren och sprayar buken med 70%etanol.Använd autoklaverade tång för att lyfta päls och hud vid mittlinjen, och med autoklaverade saxar, gör ett snitt genom päls och hud från urethral öppningen till membranet bröstkorg område. Gör ytterligare snitt till vänster och höger för att skära bort päls och hud, vilket skapar en klar bild av bukhålan. Skär sedan i peritonealfoder, ner i mitten och till höger och vänster och dra bort den från organen.Använd tövråkar för att lyfta tarmarna och flytta dem till vänster sida av musen, skapa utrymme för att se den ljusrosa bukspottkörteln fäst vid den mörka, röda, ovala mjälte. Bukspottskörteln vävnaden kommer att ha mjuk, svampig konsistens. Klipp ut bukspottkörteln, som löper längs magen, sammanflätning med tarmarna.Separera mjälten från bukspottkörteln och placera bukspottkörteln i ett 50 milliliterrör som innehåller 10 milliliter HBSS, med en gång penicillin streptomycin och överför det till laminärflödeshuva. Häll innehållet i röret i en tom väga båt och använda tokmedel för att tvätta bukspottkörteln genom att virvla den. Använd sedan tivorna för att flytta bukspottkörteln till en andra vägbåt som innehåller HBSS med penicillinsreptomycin och tvätta igen genom att snurra.Flytta bukspottkörteln till den tredje vägbåten som innehåller HBSS med penicillin streptomycin och börja skära bukspottkörteln i fem millimeter eller mindre bitar. För att hälla innehållet i väga båten i en färsk 50 milliliter rör, först använda tlyckor för att flytta bukspottkörteln bitar i vätskan som båten är tippas. När bitarna inte längre är fastsatta på båten, häll dess innehåll i röret.Plocka upp eventuella återstående bitar med tlynorna och tvätta tlyset i röret. Efter centrifugering röret på 931 gånger gravitationen vid fyra grader Celsius i två minuter, använd en fem milliliter pipetter för att ta bort HBSS och allt flytande fett. Tillsätt fem milliliter kollagenas utspädd i HBSS.Stäng röret och säkerställa ett förseglat lock genom att linda röret i plastparaffinfilm. Placera den i en inkubator, skaka på 220 RPM vid 37 grader Celsius i 20 minuter. Vilket kommer att ge den grumliga lösningen, och få återstående vävnad bitar.För att stoppa dissociationen, placera röret på is och tillsätt fem milliliter kall HBSS med 5%FBS. Efter centrifugering vid 931 gånger gravitationen vid fyra grader Celsius i två minuter, ta bort supernatanten med en fem milliliter pipett. Åter upphäva pelleten i 10 milliliter HBSS med 5%FBS, och centrifug igen vid 931 gångers gravitation i två minuter vid fyra grader Celsius.Ta bort supernatanten med hjälp av en fem milliliterpipett och upprepa detta steg med ytterligare 10 milliliter HBSS med 5%FBS. Därefter åter avbryta pelleten i fem milliliter HBSS med 5%FBS. Använd en P1000-pipett för att filtrera cellupphängningen en milliliter i taget genom ett 500 mikrometernät till ett 50 milliliterrör.För att tvätta eventuella kvarvarande bukspottskörtelceller genom nätet, tillsätt ytterligare fem milliliter HBSS med 5%FBS. Använd sedan en P1000-pipetten för att passera detta filtrat en milliliter i taget genom 105 mikrometernätet i ett 50 milliliterrör. Försiktigt pipettera denna cell suspension i en 50 milliliter rör som innehåller HBSS med 30%FBS, som kommer att bilda ett lager av cell suspension i toppen.Centrifugera denna cell suspension vid 233 gånger gravitationen vid fyra grader Celsius i två minuter och ta bort supernatanten. Åter upphäva pelleten som innehåller Acinar cellerna i en gång Waymouth kompletta medium. Eftersom en bukspottkörtel är tillräcklig för två virusinfektioner, dela cellen suspension mellan locken av två 35 millimeter plattor, vilket möjliggör infektion i suspension.För adenoviral infektion, tillsätt viruset vid en 1/1000 utspädning till locket på varje platta och virvel. Placera plattorna i en cellkultur inkubator på 37 grader Celsius och 5%CO2. Snurra var 15:e minut under den första timmen och fortsätt inkubationen i ytterligare två timmar.För att göra en kollagengel, kombinera sju milliliter av typ en råtta svans kollagen, 700 mikroliter av 10 gånger Waymouths medium och 466,6 mikroliter av 0,34 molar natriumhydroxid i en 50 milliliter rör på is för att göra kollagen gel. I ett 50 milliliter rör, kombinera lika stora volymer av cell suspension och kollagen gel efter tre timmar inkubation och försiktigt blanda. Plate 2000 mikroliter, en brunn i taget i en sex brunnsplatta samtidigt som plattan på is och virvel för att jämnt fördela kollagencellskiktet.För att stelna mediet, inkubera plattan i en cellkultur inkubator vid 37 grader Celsius och 5%Koldioxid i 30 minuter. Tillsätt sedan 1,5 milliliter per brunn av en gång Waymouths kompletta medium med önskad stimulans eller hämmare. Byt medium följande dag och sedan varannan dag.Beroende på vilken stimulans som används kan Acinar-till-duktal metaplasi eller ADM observeras mellan dag tre och dag fem. 24 timmar post infektion med GFP adenovirus, bilder av celler inbäddade i kollagen eller källaren membran matris, visade att infektion var effektiv. Vid fem dagar efter infektion, celler inbäddade i kollagen bildas kanal-liknande strukturer när stimuleras med 50 nanogram per milliliter av TGF alfa.Celler inbäddade i källaren membran matris bildas kanal-liknande strukturer i avsaknad av en stimulans vid fem dagar efter infektion. Medan större kanaler bildades vid stimulering med 50 nanogram per milliliter av TGF alfa. En av de mest kritiska punkterna i protokollet är längden på kollagenas matsmältningen.Korrekt matsmältning indikeras av en grumlig lösning och få återstående vävnad bitar.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Ett protokoll för Rapid Post mortem Cell Culture av Diffus Intrinsic Pontine Gliom (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

Avdunstning minskande Culture skick Ökar Reproducerbarhet av flercelliga Sfäroid Bildning i mikrotiterplattor

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Förberedelse och metabola haltbestämning av 3-dimensionell sfäroid samtidig kulturer av pankreascancer celler och fibroblaster

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Terapi testning i sfäroid-baserat 3D Cell kultur modell för huvud och hals skivepitelcancer

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Isolering av Stem-liknande celler från 3-dimensionella sfäroid kulturer

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generering av ortotopisk Pankreastumörer och ex vivo karakterisering av tumörinfiltrerande T-cell cytotoxicitet

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Övervakning Cancer Cell Invasion och T-Cell cytotoxicitet i 3D-kultur

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer

En ortopisk sambandsmusmodell av bukspottskörtelcancer

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer ...

Robot Assisted Distal Pancreatectomy with Celiac Axis Resection (DP-CAR) for Pancreatic Cancer: Surgical Planning and Technique

Robot Assisted Distal Pancreatectomy with Celiac Axis Resection DP-CAR for Pancreatic Cancer: Surgical Planning and Technique

Robot assisterad distal bukspottkörtelektomi med celiac axel samband (DP-CAR) för bukspottskörtelcancer: Kirurgisk planering och teknik

Malignant pancreatic tumors involving the celiac artery can be resected with a distal pancreatectomy, splenectomy and celiac axis resection (DP-CAR), ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Etablera 3-dimensionella sfäroider från patient-härledda tumörprover och utvärdera deras känslighet för läkemedel

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...