Name: behavioral tracking and neuromast imaging of mexican cavefish
Uploaded: 2019-04-06T14:00:00
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我们感谢包括 N ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' Cetraro, N. simon, C. valdez, C. Macapac, J. choi, l. lu, j. Nguyen, s. Podhorzer, H. Hernandes, j. fong, j. Kato 和 i. lorder, 用于本手稿中使用的实验鱼。我们还感谢基恩实验室成员, 包括 P. Masek 训练我组装红外 CCD 摄像机。最后, 我们要感谢夏威夷 a ' i Mānoa 大学通信学院媒体实验室, 特别是 B. smith、J. lam 和 S. white, 为制作视频提供了宝贵的帮助。这项工作得到了夏威夷社区基金会 (16CON-78919 和 18CON-90818) 和国家卫生研究所 (P20GM125508) 向我的赠款的支持。

所有程序都按照 "实验动物护理原则" (国家卫生研究所85-23 出版物, 1985年修订) 和 Manoa 机构动物护理和使用的夏威夷大学批准的准则进行委员会动物议定书17-2560-3。
1. 振动吸引行为 (VAB) 检测 (整个记录过程≤ 10分钟)
注: 使用红外敏感相机或通过修改 USB 网络摄像头构建红外摄像机。若要修改 USB 网络摄像头, 请参阅 Keene 实验室在 JoVE 的这一空富问题 (来自此...

<ol>
	<li>Keene, A. C., Yoshizawa, M., McGaugh, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , (2015).</li><li>Mitchell, R. W., Russell, W. H., Elliott, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mexican eyeless characin fishes, genus Astyanax: Environment, distribution, and evolution.Special publications the museum Texas Tech University. (12), (1977).</li><li>Wilkens, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+genetics+of+epigean+and+cave+Astyanax-fasciatus+(Characidae,+Pisces)+-+Support+for+the+neutral+mutation+theory.">Evolution and genetics of epigean and cave Astyanax-fasciatus (Characidae, Pisces) - Support for the neutral mutation theory.</a> Evolutionary Biology. 23, 271-367 (1988).</li><li>Fumey, J., Hinaux, H., Noirot, C., Thermes, C., R&#233;taux, S., Casane, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+late+Pleistocene+origin+of+Astyanax+mexicanus+cavefish.">Evidence for late Pleistocene origin of Astyanax mexicanus cavefish.</a> BMC Evolutionary Biology. 18 (1), 1-19 (2018).</li><li>Yoshizawa, M., Gori&#269;ki, S., Soares, D., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+a+behavioral+shift+mediated+by+superficial+neuromasts+helps+cavefish+find+food+in+darkness.">Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness.</a> Current Biology. 20 (18), 1631-1636 (2010).</li><li>Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyeless+Mexican+cavefish+save+energy+by+eliminating+the+circadian+rhythm+in+metabolism.">Eyeless Mexican cavefish save energy by eliminating the circadian rhythm in metabolism.</a> PloS One. 9 (9), e107877 (2014).</li><li>Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+energetic+cost+of+vision+and+the+evolution+of+eyeless+Mexican+cavefish.">The energetic cost of vision and the evolution of eyeless Mexican cavefish.</a> Science Advances. 1 (8), e1500363 (2015).</li><li>Yoshizawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Evolution+of+a+Series+of+Behavioral+Traits+is+associated+with+Autism-Risk+Genes+in+Cavefish.">The Evolution of a Series of Behavioral Traits is associated with Autism-Risk Genes in Cavefish.</a> BMC Evolutionary Biology. 18 (1), 89 (2018).</li><li>Riddle, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+in+cavefish+as+an+adaptation+to+a+nutrient-limited+environment.">Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment.</a> Nature. 555 (7698), 647-651 (2018).</li><li>Protas, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+cavefish+reveals+molecular+convergence+in+the+evolution+of+albinism.">Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism.</a> Nature Genetics. 38 (1), 107-111 (2006).</li><li>Yoshizawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+genetic+architecture+underlies+the+emergence+of+sleep+loss+and+prey-seeking+behavior+in+the+Mexican+cavefish.">Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish.</a> BMC Biology. 13 (1), 15 (2015).</li><li>Dubou&#233;, E. R., Keene, A. C., Borowsky, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+convergence+on+sleep+loss+in+cavefish+populations.">Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations.</a> Current Biology. 21 (8), 671-676 (2011).</li><li>Fernandes, V. F. L., Macaspac, C., Lu, L., Yoshizawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+developmental+plasticity+and+a+coupling+between+left+mechanosensory+neuromasts+and+an+adaptive+foraging+behavior.">Evolution of the developmental plasticity and a coupling between left mechanosensory neuromasts and an adaptive foraging behavior.</a> Developmental Biology. 441 (2), 262-271 (2018).</li><li>P&#233;rez-Escudero, A., Vicente-Page, J., Hinz, R. C., Arganda, S., de Polavieja, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=idTracker:+tracking+individuals+in+a+group+by+automatic+identification+of+unmarked+animals.">idTracker: tracking individuals in a group by automatic identification of unmarked animals.</a> Nature Methods. 11, 743 (2014).</li><li>Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+ethomics+in+large+groups+of+Drosophila.">High-throughput ethomics in large groups of Drosophila.</a> Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).</li><li>Yoshizawa, M., Jeffery, W. R., Van Netten, S. M., McHenry, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sensitivity+of+lateral+line+receptors+and+their+role+in+the+behavior+of+Mexican+blind+cavefish+(Astyanax+mexicanus).">The sensitivity of lateral line receptors and their role in the behavior of Mexican blind cavefish (Astyanax mexicanus).</a> Journal of Experimental Biology. 217 (6), (2014).</li><li>Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Virtualdub. , (2014).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Cavallari, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blind+circadian+clock+in+cavefish+reveals+that+opsins+mediate+peripheral+clock+photoreception.">A blind circadian clock in cavefish reveals that opsins mediate peripheral clock photoreception.</a> PLoS Biology. 9 (9), e1001142 (2011).</li><li>Swimmer, B., Lang, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Surface Wave Discrimination between Prey and Nonprey by the Back Swimmer Notonecta glauca L. (Hemiptera , Heteroptera ). 6 (3), 233-246 (1980).</li><li>Montgomery, J. C., Macdonald, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sensory Tuning of Lateral Line Receptors in Antarctic Fish to the Movements of Planktonic Prey. 235 (4785), 195-196 (1987).</li><li>Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A., Sung, R. J., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypocretin/orexin+overexpression+induces+an+insomnia-like+phenotype+in+zebrafish.">Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish.</a> The Journal of Neuroscience. 26 (51), 13400-13410 (2006).</li><li>Zhdanova, I. V., Wang, S. Y., Leclair, O. U., Danilova, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+promotes+sleep-like+state+in+zebrafish.">Melatonin promotes sleep-like state in zebrafish.</a> Brain Research. 903 (1-2), 263-268 (2001).</li><li>Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+Spreading+and+Toxicity+of+Prion-like+Proteins+Using+the+Metazoan+Model+Organism+C.+elegans.">Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52321 (2015).</li><li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Object Tracker. , (2000).</li><li>Ferreira, T., Rasband, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Create+Shortcuts.">Create Shortcuts.</a> ImageJ User Guide. , (2012).</li><li>Lochmatter, T., Roduit, P., Cianci, C., Correll, N., Jacot, J., Martinoli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SwisTrack. , (2008).</li></ol>

这些方法易于访问, 但由于其免费软件起源的性质, 可能会很复杂。因此, 强烈建议在进行任何实际试验之前进行试验检测和分析。
一旦建立了实验和分析框架, 数据生成的速度就会很快。一旦建立, 它可以记录两条鱼在7分钟内的 VAB 检测, 30 鱼在24小时的活动/睡眠检测, 和一条鱼2.5 至3分钟的神经质体成像, 从 MS222 麻醉到最终的图像捕获。根据所使用的计算机的性能, 视频和图?...

墨西哥的特拉, (Tele特征 idae) 在鱼类中是独一无二的, 因为它有两种截然不同的替代形态--一种是有视力的、表面居住的变形和一种由几种不同的形态组成的盲目的、洞穴居住的变形人口1。虽然在形态和生理上不同, 但它们仍然是干扰素2,3。这些干涉形态似乎发展迅速 (约 20, 000年)4, 使其成为研究快速适应的理想模型系统。据悉, 紫鱼具有一系列不同的形态和行为特征, 包括味蕾密度的增加、机械传感器数量的增加、按振动刺激的特定频率调整的觅食行为、多动症和失眠。其中许多行为可能同时进化, 其中一些被认为在黑暗的洞穴中觅食5和在黑暗和食物稀疏的环境中节能 6,7。
在许多进化模型系统中, 由于大多数物种分布在复杂环境中的连续梯度上, 很难获得关于动物形态和行为如何改变环境的综合知识。然而, 洞穴和表面变形的对比, 在一个尖锐的生态带描绘的高度对比的环境中演变, 导致阿斯特安纳克斯成为一个很好的模型, 了解动物的进化。这使得它能够更容易地将基因和发育过程与环境中的适应性特征和选择联系起来。此外, 最近对Astyanax这些特征的生物医学调查表明, 这些特征可能与人类症状8、9、10 平行.例如, 失去社交性和睡眠, 以及多动症、重复行为和皮质醇水平的增加, 与自闭症谱系障碍8中观察到的情况相似。
为了解决许多行为和形态特征的复杂的共同进化, 它是有利的, 以检测其中的许多突出潜在的遗传和分子途径。本文介绍了一种表征阿斯蒂亚纳克斯表面、洞穴和形态的洞穴型行为表型程度的方法。分析表型特征的焦点行为有空化觅食行为 (振动吸引行为, 简称 vab) 和多动症/睡眠持续时间11,12。还提出了一种与 VAB13相关的感觉系统的成像方法。最近, 许多用于运行行为检测的开源跟踪软件已经出现了14,15.这些工作非常好的短视频, 不到10分钟长。但是, 如果视频较长, 因为密集的计算跟踪时间, 则会出现问题。有能力的商业软件可能是昂贵的。所介绍的方法主要使用免费软件, 因此被认为是具有成本效益和高吞吐量的方法。其中还包括基于这些方法的代表性结果。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:600px;" width="600">
	<tbody>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:221px;">4-Di-1-ASP (4-(4-(dimethylaminostyryl)-1-methylpyridinium iodide)</td>
			<td style="width:85px;">MilliporeSigma</td>
			<td style="width:123px;">D3418</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:221px;">880 nm wave length black light</td>
			<td style="width:85px;">Advanced Illumination</td>
			<td style="width:123px;">BL41192-880</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">avfs</td>
			<td style="width:85px;">freeware</td>
			<td style="width:123px;">Version 1.0.0.6</td>
			<td style="width:171px;">http://turtlewar.org/avfs/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Avisynth</td>
			<td style="width:85px;">freeware</td>
			<td style="width:123px;">Version 2.6.0</td>
			<td style="width:171px;">http://avisynth.nl/index.php/Main_Page</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Cygwin</td>
			<td style="width:85px;">freeware</td>
			<td style="width:123px;">Version 2.11.0</td>
			<td style="width:171px;">https://www.cygwin.com/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Cylindrical assay chamber (Pyrex 325 ml glass dish)</td>
			<td style="width:85px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">3140-100</td>
			<td style="width:171px;">10 cm diameter 5 cm high</td>
		</tr>
		<tr height="187">
			<td height="187" style="height:187px;width:221px;">Ethovision XT</td>
			<td style="width:85px;">Noldus Information&#160; Technology, Wageningen, The Netherlands</td>
			<td style="width:123px;">Version 14</td>
			<td style="width:171px;">https://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:221px;">Fish Aquarium Cylinder Soft Sponge Stone Water Filter, Black</td>
			<td style="width:85px;">Jardin (through Amazon.com)</td>
			<td style="width:123px;">NA</td>
			<td style="width:171px;">Sponge filter for Sleep/hyperactivity recording system</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:221px;">Grade A Brine shrimp eggs</td>
			<td style="width:85px;">Brine shrimp direct</td>
			<td style="width:123px;">BSEA16Z</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">ImageJ</td>
			<td style="width:85px;">freeware</td>
			<td style="width:123px;">Version 1.52e</td>
			<td style="width:171px;">https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:221px;">macro 1.8/12.5-75mm C-mount zoom lens</td>
			<td style="width:85px;">Toyo</td>
			<td style="width:123px;">NA</td>
			<td style="width:171px;">Attach to USB webcam by using c-mount, which is printed in 3-D printer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Neutral Regulator</td>
			<td style="width:85px;">Seachem</td>
			<td style="width:123px;">NA</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:221px;">Optical cast plastic IR long-pass filter</td>
			<td style="width:85px;">Edmund optics</td>
			<td style="width:123px;">43-948</td>
			<td style="width:171px;">Cut into a small piece to fit in the CCD of USB webcam</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:221px;">pfmap</td>
			<td style="width:85px;">freeware</td>
			<td style="width:123px;">Build 178</td>
			<td style="width:171px;">http://pismotec.com/download/ (at &#8220;Download Archive&#8221; link at the bottom)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Reef Crystals Reef Salt</td>
			<td style="width:85px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:123px;">RC15-10</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">SwisTrack</td>
			<td style="width:85px;">freeware</td>
			<td style="width:123px;">Version 4</td>
			<td style="width:171px;">https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">USB webcam (LifeCam Studio 1080p HD Webcam)</td>
			<td style="width:85px;">Microsoft</td>
			<td style="width:123px;">Q2F-00013</td>
			<td style="width:171px;">Cut 2-2.5 cm of the front</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:221px;">WinAutomation</td>
			<td style="width:85px;">freeware</td>
			<td style="width:123px;">Version 8</td>
			<td style="width:171px;">https://www.winautomation.com/ (free stand-alone app for this procedure)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Windows operating system</td>
			<td style="width:85px;">Microsoft</td>
			<td style="width:123px;">7, 8 or 10</td>
			<td style="width:171px;">https://www.microsoft.com/en-us/windows</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">x264vfw</td>
			<td style="width:85px;">freeware</td>
			<td style="width:123px;">NA</td>
			<td style="width:171px;">https://sourceforge.net/projects/x264vfw/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

behavioral tracking and neuromast imaging of mexican cavefish

栖息在洞穴中的动物进化出一系列的形态和行为特征, 以适应其永恒的黑暗和食物稀疏的环境。在这些特征中, 觅食行为是行为特征进化功能优势的有益窗口之一。本文介绍了分析振动吸引行为 (VAB: 自适应觅食行为) 和适应血管的 tetra、 Astyanax mexicanus相关机械传感器成像的最新方法。此外, 还提出了对包括多动症和睡眠损失在内的一系列额外的空鱼行为进行高通量跟踪的方法。紫鱼也表现出性, 重复的行为和更高的焦虑。因此, 空鱼作为进化行为的动物模型。这些方法使用可应用于其他类型行为的自由软件和自定义脚本。这些方法为商业上可获得的跟踪软件提供了实用和具有成本效益的替代办法。

本文给出的结果是用所提出的方法可以获得的有代表性的例子。因此, 根据实验条件, 结果可能会与这里给出的鱼和河豚稍有偏差。
振动吸引行为
VAB 的代表性结果可以在图 3中找到洞穴鱼和河豚。注意表面鱼的边缘跟随行为 (图 3 a...

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Behavioral Tracking and Neuromast Imaging of Mexican Cavefish

墨西哥辣鱼的行为跟踪与神经吻合

在这里, 我们提出了方法的高通量研究一系列的墨西哥紫鱼行为和重要染色的机械感官系统。这些方法使用自由软件和定制脚本, 为行为研究提供了一种实用且经济高效的方法。

Cave-dwelling animals have evolved a series of morphological and behavioral traits to adapt to their perpetually dark and food-sparse environments. Among ...

洞穴鱼作为一个梦幻般的动物壁画饲养，以了解进化和生物医学的过程。我们现在正在进行生物医学调查，利用这些特征作为人类症状的平行。在这里，我们将展示可用于进化和生物医学研究的行为分析的电池和分析系统。为了检测振动的吸引和行为，振动玻璃棒入一个玻璃碗，里面装着一条鱼在黑暗中。鱼在测定前四天在有条件的水中进行适应，有12，12光，暗循环。前一天的检测后，经过三天的适应，用新鲜的条件水代替检测室中的水。在测定当天，鱼被剥夺食物，直到测定完成，因为停止将改变他们对振动的反应。通过调谐到 40 赫兹来准备振动发射装置。设置正确的记录参数、库存条件和目标文件。将检测圆筒放在录音舞台上，在黑暗的房间里用红外背光照明，让鱼在放置在舞台上后适应三分钟。在黑暗中适应3分钟后，记录3分30秒的视频。在记录开始时，将直径为 7.5 毫米的振动玻璃棒插入水柱，深度约为 5 厘米。将振动玻璃棒定位在水中时，避免发出任何噪音或振动，因为鱼可以感应到轻微的噪音和振动。确保在开始视频录制后 30 秒内完成此过程，以确保记录超过 3 分钟的行为。通过双击用户运行批avs_creator。蝙蝠将压缩的 AVI 视频转换为 ImageJ 的可读格式。只需将宏拖入图形用户界面 shell 即可加载宏。此宏将启用某些热键进行以下分析。在工作目录中，创建一个新文件夹并命名Process_ImageJ。此文件夹将自动用于存储以下分析中的输出文件。右键单击要分析的 AVS 视频文件并选择快速安装。将 AVS 文件装载为外部驱动器后，在 ImageJ 中打开 AVI 文件。要设置距离测量的尺度，请使用直线选择工具在测量室上绘制一条直线，选择测定室的直径，然后通过单击分析设置比例，设置比例函数。对于我们的情况，我们输入9.4厘米。检查全局的无线电盒，以标准化以下所有视频分析的规模。使用椭圆形选择工具复制检测室区域，然后右键单击并选择图像重复。此时，指定要保留的帧范围，以进行进一步分析。清除检测室外部，通过点击数字栏上的热键七将图像转换为二进制图像。清除背景后，系统将提示您将在中心添加一个黑点，以使用已设置为黑色的椭圆形选择工具来指示振动玻璃棒的位置。单击"确定"，宏将提示您继续进行阈值调整。调整阈值，以便在整个视频剪辑中可以看到鱼，然后选择"应用"。通过点击数字栏上的热键八来运行跟踪器插件。当出现提示时，将最小像素大小设置为 100。此过程将产生振动玻璃棒和鱼每帧之间的距离，所有三分钟的二进制视频。要保存跟踪器文件，请点击数字栏上的热键 9。这将自动导出整个视频的图像和包含坐标和距离数据的 XLS 文件的二进制堆栈，以防需要重新分析。这也将关闭与当前视频关联的所有文件。现在，根据具体的研究问题，可以进一步分析生成的文件。在定制设计10升丙烯酸记录水族馆的每个房间适应五条实验鱼四天或四天以上，充满条件的水。每个单独的腔室都用黑色丙烯酸板隔开。必须覆盖每个水箱，以防止鱼跳进另一个房间。设置可编程电源定时器，在适应期间自动打开白色 LED 灯 12 小时，每天关闭 12 小时。如果鱼容易被感染，这将约束鱼的昼夜节律。为了提供更漫射的白光，我们使用与 10 升储罐尺寸相似的扁平白色不透明丙烯酸板作为扩散器，为每个储罐传递光线。在此期间，每天提供一次活盐水虾喂养，并通过每个水族馆的海绵过滤器提供通化。请注意，确保鱼在一致的时间喂养。例如，每天上午一次。在测定的前一天，三天或三天以上，用新鲜的条件水代替检测室中的水。在 VirtualDub 软件中设置录制参数。视频将在固定曝光时间以每秒 15 帧的速度录制。视频在 X264VFW 编解码器中压缩，实现大约 700 倍的压缩。在录音当天，用活盐水虾喂每条鱼。取出所有海绵过滤器并开始录制。在录制阶段打开红外线灯。通过在屏幕上观察 VirtualDub 实时图像，调整每个水族馆的位置，以确保它们正确面对 USB 摄像机。早上开始24小时录音。例如，开始时间是 9 a.m。第二天完成时间是上午 9 点.m 9 点。开始捕获视频并固定位置以避免干扰。有时检查录制是否正在运行。录制 24 小时后，请确保正确保存视频。将视频传输到 PC 工作站以跟踪鱼的行为。将视频传输到相应的文件夹后，快速对视频进行质量检查，以确保其质量良好。这包括查看照明，检查每个部分是否有一条鱼，以及是否有任何外国运动可能会导致雾化。从这里，免费软件SwisTrack用于动物跟踪。该软件的优点是，该软件可以跟踪多个动物一次和减去背景图像使用任意帧，我们识别。缺点是跟踪可能在包含不同鱼的竞技场之间跳跃。背景图像可能不足以满足以后的帧，SwisTrack 随机为单个鱼分配跟踪 ID，因此有必要通过绘制每种鱼的平均物理位置来恢复鱼 ID。为了克服这些问题，使用了三种方法。使用二进制掩码，一个用于跟踪偶数竞技场，一个用于跟踪奇数竞技场。使用 Win-自动化每三分钟自动更新一次背景图像，并使用 Perl 脚本重建鱼 ID。分析的第一步是为奇数和偶数的竞技场制作二进制掩码。检查视频质量后，在视频编辑软件中选择一个代表性帧，并用它来创建两个二进制蒙版，一个用于偶数，一个用于奇数竞技场。这些二元掩码的目的是避免相邻竞技场之间的误入。创建二进制掩码后，打开 SsisTrack 参数文件，该文件确定跟踪过程的文件路径和参数。在每个偶数和奇数文件夹中准备一个参数文件，用于视频跟踪。在此文件中，键入视频和掩码文件的文件位置的路径。准备参数文件后，打开每三分钟自动重置一次背景的 Win-自动化可执行文件。使用此可执行文件，SwisTrack 将自动运行，然后打开此跟踪软件中每个偶数或奇数文件夹中的参数文件。运行跟踪软件来跟踪鱼的运动。在头9000帧的跟踪中，通过查看最近的相邻跟踪组件，确保鱼被正确跟踪。正确建立跟踪后，返回到自适应背景减法组件选项卡并点击键盘上的热键 R 以运行 Win-自动化以进行连续自适应背景减法。大约五个小时后，将生成每个鱼的文本文件，其中包含视频每帧的 X 和 Y 坐标。若要继续分析，请将三个 Perl 脚本文件分配给包含偶数文件夹和奇数文件夹的文件夹。为了将长度（以像素为单位）转换为厘米，必须了解厘米与像素的比率。在名为"创建"的 Perl 脚本文件的适当位置键入1.fillupGaps.pl。运行 1. 填充加普斯。pl Perl 脚本使用 Windows 的 Unix 模拟器。首先，使用 CD 命令移动到当前工作目录，然后键入 Perl 1.fillupGaps。pl 运行 Perl 脚本。其他两个脚本将自动按顺序调用。这三个脚本将每个跟踪文件分配给水族馆的每个部分，因此可用于分析每条鱼的行为。与运行脚本后Summary_Sleep文本文件进行协商，以仔细检查从分析中丢弃的帧数是否低得可以接受。缺少少于 15% 的帧被认为是可接受的。使用内部宏将跟踪数据复制并粘贴到电子表格文件中。此宏将分析的数据重组为几个步骤过程级别，如平均睡眠持续时间和游泳距离之和。为了染色鱼侧线，将DASPEI库存溶液溶解在条件水中，最终浓度为每毫升5微克，然后在室温下将鱼浸入溶液中，在黑暗的环境中浸泡45分钟。45分钟后，从DASPEI溶液中回收鱼，并浸入冰冷的调节水中，使用 MES 三重二。一旦鱼被深度麻醉，将鱼放在培养皿中，并在有效的显微镜下观察。确保采取统计系列，包括鱼的所有计划的焦点，并编译在一个单一的图片的所有。对于图像分析，请将名为"Process_ImageJ和宏文件的新文件夹添加到包含要分析的图片的文件夹中。打开 ImageJ 软件，然后通过将宏文件拖动到 ImageJ 来打开宏。通过单击宏运行宏，运行宏。如果图片未自动打开，请单击宏、文件取件。然后，宏将自动拾取图片文件进行分析。对于神经mast量化通过单击多边形 2 显示感兴趣的区域，并在图片上绘制区域。八、五要复制感兴趣区域。使用绘制工具删除或添加上一个图像中任何额外或缺失的点，然后是八点、六点。一旦你八，六，两个新的窗口将出现。显示编号神经mast点方案的窗口和具有总神经瘤量化表的窗口。点击七来保存两个文件。单击"确定"后，将存储这些文件，并将打开一个新的图片文件以进行进一步分析。通过运行宏合并神经瘤计数。以下结果是受控条件下鱼类两种形态的代表性结果。这四个数字显示了振动吸引行为测定的代表性结果。A 和 B 是 A、水面鱼和 B 山洞鱼游泳路径的顶视图。红线是 ImageJ 跟踪在三分钟内记录时生成的坐标的轨迹。C 和 D 显示了从 TXT 文件中提取的电子表格宏提取的 C、表鱼和洞穴鱼 D 的结果的比较。Y 轴是鱼接近振动杆的计数数。每个点代表一个鱼的行为分析过程中的实验观察。请注意，表层鱼不会显示任何频率的方法增加，而洞穴鱼显示的最大吸引力约 35 至 40 赫兹。这两个数字显示了由从 TXT 文件中提取的电子表格宏提取的睡眠行为分析的代表性结果。A 和 B 演示宏文件自动汇总的两个指标。图 A 显示了地表鱼和洞穴鱼在白天和夜间的游泳距离，而 B 显示了两种形态的睡眠持续时间。在这种情况下，洞穴鱼表现出多动和睡眠较少相比，表面鱼。这些数字显示了由从 TXT 文件中提取的电子表格宏提取的 DASPEI 图像分析结果。A 和 B 演示了神经雄数与振动吸引行为与神经雄星大小与洞穴鱼、表鱼和 F1 后代行为之间的关系。每个点代表每条鱼。请注意，神经瘤数与振动吸引行为呈正相关，这表明神经瘤可以调节此行为。神经瘤大小也支持这一结论。C 和 D 是 DASPEI 染色神经瘤 C、表面鱼和 D（洞穴鱼）的示例图像。图像中的每个荧光点是一个神经瘤，它已经采取了DASPEI。注意，洞穴鱼的神经瘤明显更丰富。我们展示了一系列基于横向行为游泳活动和睡眠的行为分析。动物跟踪系统也可以适应其他行为，如立体重复行为、社交互动和行为横向。

Research

JoVE Journal

Behavior

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科研

行为学

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