Name: behavioral tracking and neuromast imaging of mexican cavefish
Uploaded: 2019-04-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Behavioral Tracking and Neuromast Imaging of Mexican Cavefish at JoVE.com

Vi takker alle medlemmerne af Yoshizawa lab herunder N. Cetraro, N. Simon, C. Valdez, C. Macapac, J. Choi, L. Lu, J. Nguyen, S. Podhorzer, H. Hernandes, J. Fong, J. Kato og I. Herren for fisk pleje på den eksperimentelle fisk, der anvendes i dette håndskrift. Vi takker også A. Keene lab medlemmer herunder s. Masek for at træne min at samle IR CCD kamera. Endelig vil vi gerne takke Media Lab - College of Social Sciences - skole for kommunikation ved University of Hawaii Mānoa for deres uvurderlige hjælp med at gøre video, især B. Smith, J. Lam og S. hvid. Dette arbejde blev støttet af Hawaiian Fællesskabet Foundation (16CON-78919 og 18CON-90818) og nationale Institut for sundhed NIGMS (P20GM125508) tilskud til min.

Alle procedurer udføres efter retningslinjer beskrevet i "Principper af Laboratory Animal Care" (National Institute of Health publikation nr. 85-23, revideret 1985) og godkendt af University of Hawai'i at Manoa institutionelle dyrs pleje og brug Udvalget animalske protokol 17-2560-3.
1. vibrationer attraktion adfærd (VAB) assay (≤ 10 min for hele optagelsen procedure)
Bemærk: Brug et infrarød følsomme kamera eller bygge et infrarødt kamera ved at ændre en USB...

<ol>
	<li>Keene, A. C., Yoshizawa, M., McGaugh, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , (2015).</li><li>Mitchell, R. W., Russell, W. H., Elliott, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mexican eyeless characin fishes, genus Astyanax: Environment, distribution, and evolution.Special publications the museum Texas Tech University. (12), (1977).</li><li>Wilkens, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+genetics+of+epigean+and+cave+Astyanax-fasciatus+(Characidae,+Pisces)+-+Support+for+the+neutral+mutation+theory.">Evolution and genetics of epigean and cave Astyanax-fasciatus (Characidae, Pisces) - Support for the neutral mutation theory.</a> Evolutionary Biology. 23, 271-367 (1988).</li><li>Fumey, J., Hinaux, H., Noirot, C., Thermes, C., R&#233;taux, S., Casane, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+late+Pleistocene+origin+of+Astyanax+mexicanus+cavefish.">Evidence for late Pleistocene origin of Astyanax mexicanus cavefish.</a> BMC Evolutionary Biology. 18 (1), 1-19 (2018).</li><li>Yoshizawa, M., Gori&#269;ki, S., Soares, D., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+a+behavioral+shift+mediated+by+superficial+neuromasts+helps+cavefish+find+food+in+darkness.">Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness.</a> Current Biology. 20 (18), 1631-1636 (2010).</li><li>Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyeless+Mexican+cavefish+save+energy+by+eliminating+the+circadian+rhythm+in+metabolism.">Eyeless Mexican cavefish save energy by eliminating the circadian rhythm in metabolism.</a> PloS One. 9 (9), e107877 (2014).</li><li>Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+energetic+cost+of+vision+and+the+evolution+of+eyeless+Mexican+cavefish.">The energetic cost of vision and the evolution of eyeless Mexican cavefish.</a> Science Advances. 1 (8), e1500363 (2015).</li><li>Yoshizawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Evolution+of+a+Series+of+Behavioral+Traits+is+associated+with+Autism-Risk+Genes+in+Cavefish.">The Evolution of a Series of Behavioral Traits is associated with Autism-Risk Genes in Cavefish.</a> BMC Evolutionary Biology. 18 (1), 89 (2018).</li><li>Riddle, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+in+cavefish+as+an+adaptation+to+a+nutrient-limited+environment.">Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment.</a> Nature. 555 (7698), 647-651 (2018).</li><li>Protas, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+cavefish+reveals+molecular+convergence+in+the+evolution+of+albinism.">Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism.</a> Nature Genetics. 38 (1), 107-111 (2006).</li><li>Yoshizawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+genetic+architecture+underlies+the+emergence+of+sleep+loss+and+prey-seeking+behavior+in+the+Mexican+cavefish.">Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish.</a> BMC Biology. 13 (1), 15 (2015).</li><li>Dubou&#233;, E. R., Keene, A. C., Borowsky, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+convergence+on+sleep+loss+in+cavefish+populations.">Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations.</a> Current Biology. 21 (8), 671-676 (2011).</li><li>Fernandes, V. F. L., Macaspac, C., Lu, L., Yoshizawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+developmental+plasticity+and+a+coupling+between+left+mechanosensory+neuromasts+and+an+adaptive+foraging+behavior.">Evolution of the developmental plasticity and a coupling between left mechanosensory neuromasts and an adaptive foraging behavior.</a> Developmental Biology. 441 (2), 262-271 (2018).</li><li>P&#233;rez-Escudero, A., Vicente-Page, J., Hinz, R. C., Arganda, S., de Polavieja, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=idTracker:+tracking+individuals+in+a+group+by+automatic+identification+of+unmarked+animals.">idTracker: tracking individuals in a group by automatic identification of unmarked animals.</a> Nature Methods. 11, 743 (2014).</li><li>Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+ethomics+in+large+groups+of+Drosophila.">High-throughput ethomics in large groups of Drosophila.</a> Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).</li><li>Yoshizawa, M., Jeffery, W. R., Van Netten, S. M., McHenry, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sensitivity+of+lateral+line+receptors+and+their+role+in+the+behavior+of+Mexican+blind+cavefish+(Astyanax+mexicanus).">The sensitivity of lateral line receptors and their role in the behavior of Mexican blind cavefish (Astyanax mexicanus).</a> Journal of Experimental Biology. 217 (6), (2014).</li><li>Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Virtualdub. , (2014).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Cavallari, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blind+circadian+clock+in+cavefish+reveals+that+opsins+mediate+peripheral+clock+photoreception.">A blind circadian clock in cavefish reveals that opsins mediate peripheral clock photoreception.</a> PLoS Biology. 9 (9), e1001142 (2011).</li><li>Swimmer, B., Lang, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Surface Wave Discrimination between Prey and Nonprey by the Back Swimmer Notonecta glauca L. (Hemiptera , Heteroptera ). 6 (3), 233-246 (1980).</li><li>Montgomery, J. C., Macdonald, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sensory Tuning of Lateral Line Receptors in Antarctic Fish to the Movements of Planktonic Prey. 235 (4785), 195-196 (1987).</li><li>Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A., Sung, R. J., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypocretin/orexin+overexpression+induces+an+insomnia-like+phenotype+in+zebrafish.">Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish.</a> The Journal of Neuroscience. 26 (51), 13400-13410 (2006).</li><li>Zhdanova, I. V., Wang, S. Y., Leclair, O. U., Danilova, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+promotes+sleep-like+state+in+zebrafish.">Melatonin promotes sleep-like state in zebrafish.</a> Brain Research. 903 (1-2), 263-268 (2001).</li><li>Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+Spreading+and+Toxicity+of+Prion-like+Proteins+Using+the+Metazoan+Model+Organism+C.+elegans.">Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52321 (2015).</li><li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Object Tracker. , (2000).</li><li>Ferreira, T., Rasband, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Create+Shortcuts.">Create Shortcuts.</a> ImageJ User Guide. , (2012).</li><li>Lochmatter, T., Roduit, P., Cianci, C., Correll, N., Jacot, J., Martinoli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SwisTrack. , (2008).</li></ol>

Disse præsenteres metoder er let adgang til men kan være kompliceret at udføre på grund af sin freeware oprindelse. Derfor er det stærkt anbefales at udføre retssag assays og analyser før nogen faktiske eksperimenter.
Data generation kan være hurtig når den eksperimenterende og analytiske ramme er etableret. Når der oprettet, er det muligt at optage to fisk i 7 min til VAB assayet, 30 fisk i 24 h for assay aktivitet/søvn og en fisk i 2,5 til 3 min. til neuromast imaging, startende f...

Den mexicanske tetra, Astyanax mexicanus (Teleostei: Characidae), er unik blandt fisk for at have to radikalt forskellige alternative morphs - en seende, overflade-bolig morph og en blind, hulen-boligen morph består af flere særskilte populationer1. Selv om forskellige i morfologi og fysiologi, er de stadig interfertile2,3. Disse interfertile morfer synes at have udviklet sig hurtigt (~ 20.000 år)4, hvilket gør dem en ideel modelsystem for studiet af hurtig tilpasning. Cavefish er kendt for at have en suite af divergerende morfologiske og adfærdsmæssige træk herunder øget tæthed af smagsløg, øget antallet af mechanosensors, fouragering adfærd tunet til en bestemt frekvens af en vibrerende stimulus, hyperaktivitet, og søvnløshed. Mange af disse adfærd sandsynligvis udviklet sig samtidigt, hvoraf nogle har været foreslået for at være fordelagtige i mørke huler til fouragering5 og bevare energi i mørke og mad-sparsomme miljøer6,7.
I mange evolutionær modelsystemer er det vanskeligt at erhverve integreret viden om hvordan dyr morfologi og funktionsmåde ændring som reaktion på miljøet, fordi de fleste arter er fordelt på tværs af et kontinuerligt forløb i komplekse miljøer. Dog har kontrast mellem hule og overflade morph Astyanax der udviklede sig i stærkt kontrasterende miljøer afgrænset af en skarp ecotone ført til Astyanax fremstår som en fremragende model at forstå dyrenes udvikling. Dette gør det muligt lettere mellem gener og udviklingsprocesser med adaptive træk og udvalg i miljøet. Seneste biomedicinsk undersøgelser af disse træk i Astyanax har desuden vist, at disse egenskaber kan parallel menneskelige symptomer8,9,10. For eksempel, er tab af socialitet og søvn, og gevinst af hyperaktivitet, repetitiv adfærd og cortisol niveau lig hvad er observeret hos mennesker med autisme spektrum disorder8.
For at løse de komplekse Co-Evolution mange adfærd og morfologiske træk, er det en fordel at assay mange af dem til at fremhæve underliggende genetiske og molekylære veje. Præsenteres heri er metoder til kendetegner graden af cave-type adfærdsmæssige fænotyper af overfladen, hule og hybrid morphs af Astyanax. Fokale adfærd analyseres for at karakterisere fænotype er hule-tilpasset fouragering adfærd (vibration attraktion adfærd, benævnes fremover VAB) og hyperaktivitet/sleep varighed11,12. Også præsenteret er en billedbehandling metode til sensorisk system tilknyttet VAB13. For nylig, mange open source-tracking software til at køre adfærdsmæssige assays er blevet tilgængelig14,15. Disse arbejder meget godt for korte videoer, mindre end 10 minutter lange. Men det bliver problematisk, hvis videoen er længere på grund af intens beregning/tracking tid. I stand til kommercielt tilgængelige software kan være dyrt. De beskrevne metoder bruge primært freeware og derfor anses for omkostningseffektivt og høj overførselshastighed metoder. Også inkluderet er repræsentative resultater baseret på disse metoder.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:600px;" width="600">
	<tbody>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:221px;">4-Di-1-ASP (4-(4-(dimethylaminostyryl)-1-methylpyridinium iodide)</td>
			<td style="width:85px;">MilliporeSigma</td>
			<td style="width:123px;">D3418</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:221px;">880 nm wave length black light</td>
			<td style="width:85px;">Advanced Illumination</td>
			<td style="width:123px;">BL41192-880</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">avfs</td>
			<td style="width:85px;">freeware</td>
			<td style="width:123px;">Version 1.0.0.6</td>
			<td style="width:171px;">http://turtlewar.org/avfs/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Avisynth</td>
			<td style="width:85px;">freeware</td>
			<td style="width:123px;">Version 2.6.0</td>
			<td style="width:171px;">http://avisynth.nl/index.php/Main_Page</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Cygwin</td>
			<td style="width:85px;">freeware</td>
			<td style="width:123px;">Version 2.11.0</td>
			<td style="width:171px;">https://www.cygwin.com/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Cylindrical assay chamber (Pyrex 325 ml glass dish)</td>
			<td style="width:85px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">3140-100</td>
			<td style="width:171px;">10 cm diameter 5 cm high</td>
		</tr>
		<tr height="187">
			<td height="187" style="height:187px;width:221px;">Ethovision XT</td>
			<td style="width:85px;">Noldus Information&#160; Technology, Wageningen, The Netherlands</td>
			<td style="width:123px;">Version 14</td>
			<td style="width:171px;">https://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:221px;">Fish Aquarium Cylinder Soft Sponge Stone Water Filter, Black</td>
			<td style="width:85px;">Jardin (through Amazon.com)</td>
			<td style="width:123px;">NA</td>
			<td style="width:171px;">Sponge filter for Sleep/hyperactivity recording system</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:221px;">Grade A Brine shrimp eggs</td>
			<td style="width:85px;">Brine shrimp direct</td>
			<td style="width:123px;">BSEA16Z</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">ImageJ</td>
			<td style="width:85px;">freeware</td>
			<td style="width:123px;">Version 1.52e</td>
			<td style="width:171px;">https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:221px;">macro 1.8/12.5-75mm C-mount zoom lens</td>
			<td style="width:85px;">Toyo</td>
			<td style="width:123px;">NA</td>
			<td style="width:171px;">Attach to USB webcam by using c-mount, which is printed in 3-D printer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Neutral Regulator</td>
			<td style="width:85px;">Seachem</td>
			<td style="width:123px;">NA</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:221px;">Optical cast plastic IR long-pass filter</td>
			<td style="width:85px;">Edmund optics</td>
			<td style="width:123px;">43-948</td>
			<td style="width:171px;">Cut into a small piece to fit in the CCD of USB webcam</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:221px;">pfmap</td>
			<td style="width:85px;">freeware</td>
			<td style="width:123px;">Build 178</td>
			<td style="width:171px;">http://pismotec.com/download/ (at &#8220;Download Archive&#8221; link at the bottom)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Reef Crystals Reef Salt</td>
			<td style="width:85px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:123px;">RC15-10</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">SwisTrack</td>
			<td style="width:85px;">freeware</td>
			<td style="width:123px;">Version 4</td>
			<td style="width:171px;">https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">USB webcam (LifeCam Studio 1080p HD Webcam)</td>
			<td style="width:85px;">Microsoft</td>
			<td style="width:123px;">Q2F-00013</td>
			<td style="width:171px;">Cut 2-2.5 cm of the front</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:221px;">WinAutomation</td>
			<td style="width:85px;">freeware</td>
			<td style="width:123px;">Version 8</td>
			<td style="width:171px;">https://www.winautomation.com/ (free stand-alone app for this procedure)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Windows operating system</td>
			<td style="width:85px;">Microsoft</td>
			<td style="width:123px;">7, 8 or 10</td>
			<td style="width:171px;">https://www.microsoft.com/en-us/windows</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">x264vfw</td>
			<td style="width:85px;">freeware</td>
			<td style="width:123px;">NA</td>
			<td style="width:171px;">https://sourceforge.net/projects/x264vfw/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

behavioral tracking and neuromast imaging of mexican cavefish

Hulen-boligen dyr har udviklet en serie af morfologiske og adfærdsmæssige træk til at tilpasse sig deres evigt mørke og mad-sparsomme miljøer. Blandt disse træk er fouragering adfærd en af de nyttige windows i funktionelle fordele af adfærdsmæssige træk evolution. Præsenteres heri er opdateret metoder til at analysere vibrationer attraktion adfærd (VAB: en adaptive fouragering adfærd) og billeddannelse af tilknyttede mechanosensors af cave-tilpasset tetra, Astyanax mexicanus. Derudover præsenteres metoder for høj overførselshastighed tracking af en række yderligere cavefish adfærd herunder hyperaktivitet og søvn-tab. Cavefish viser også asociality, repetitive adfærd og højere angst. Derfor fungere cavefish som en dyremodel for udviklet adfærd. Disse metoder kan bruge fri software og skræddersyede scripts, der kan anvendes på andre typer af adfærd. Disse metoder giver praktiske og omkostningseffektive alternativer til kommercielt tilgængelige tracking software.

Resultaterne præsenteres heri er repræsentative eksempler på hvad kan erhverves med de metoder, der præsenteres. Derfor kan resultater afvige lidt fra dem, der præsenteres her for både cavefish og overflade fisk alt efter de eksperimentelle betingelser.
Vibration attraktion adfærd
Repræsentative resultater for VAB kan findes i <strong class="xf...

Watch this Scientific Journal Video about Behavioral Tracking and Neuromast Imaging of Mexican Cavefish at JoVE.com

Behavioral Tracking and Neuromast Imaging of Mexican Cavefish

Adfærdsmæssige Tracking og Neuromast billeddannelse af mexicanske Cavefish

Vi præsenterer her, metoder til høj overførselshastighed undersøgelse af en serie af den mexicanske cavefish adfærd og vitale farvning af et mechanosensory system. Disse metoder kan bruge fri software og skræddersyede scripts, giver en praktisk og omkostningseffektiv metode til undersøgelser af adfærd.

Cave-dwelling animals have evolved a series of morphological and behavioral traits to adapt to their perpetually dark and food-sparse environments. Among ...

Cavefish er at hæve som en fantastisk dyr vægmaleri til at forstå evolution og biomedicinske processer. Vi er nu gennemføre biomedicinsk undersøgelse ved at bruge disse træk som en parallel til et menneske symptomer. Her vil vi vise batteriet i adfærdsanalysen og analysesystemet, der kan bruges til både evolutionære og biomedicinske undersøgelser.At assay vibrationer tiltrækker og adfærd, en vibrerende glasstang er indsat i en glasskål, der indeholder en fisk i mørke. Fisk akklimatiseres fire dage før analysen i konditioneret vand med en 12, 12 lys, mørk cyklus. Dagen før analysedagen efter tre dages akklimatisering erstattes vand i analysekammeret med frisk konditioneret vand.På analysedagen berøves fisk mad, indtil analysen er afsluttet, fordi ophør vil ændre deres reaktion på vibrationer. Forbered vibrationsudledende apparater ved at indstille til 40 Hertz. Angiv de korrekte optagelsesparametre, lagerbetingelser og destinationsfil.Placer analyse cylinder på optagelse scenen, belyst med infrarød baggrundsbelysning i et mørkt rum, og lad fisken akklimatisere i tre minutter efter at være blevet placeret på scenen. Efter de tre minutters akklimatisering i mørke, optage tre minutter og 30 sekunder af video. Ved indståningen indsættes den 7,5 millimeter diameter, der vibrerer glasstangen, i vandsøjlen, ca. 5 centimeter i dybden.Undgå at lave støj eller vibrationer, mens du placerer den vibrerende glasstang i vandet, da fisk kan fornemme mindre lyde og vibrationer. Sørg for at afslutte denne procedure inden for 30 sekunder efter, at videooptagelsen er startet, for at sikre, at der optages mere end tre minutters funktionsmåde. Kør batchfilen ved at dobbeltklikke på avs_creator.bat for at konvertere den komprimerede AVI-video til læsbart format for ImageJ. Makroen kan indlæses ved blot at trække og slippe ind i en grafisk brugergrænseflade shell. Denne makro aktiverer visse genvejstaster til følgende analyse.Opret en ny mappe i arbejdsmappen, og navnd den Process_ImageJ. Denne mappe bruges automatisk til at gemme outputfiler fra følgende analyse. Højreklik på AVS-videofilen, der skal analyseres, og vælg hurtigmontering.Når AVS-filen er tilsluttet som et eksternt drev, skal du åbne AVI-filen i ImageJ. Hvis du vil indstille skalaen for afstandsmålingen, skal du vælge diameteren af analysekammeret ved at tegne en lige linje hen over kammeret ved hjælp af værktøjet til lige linjevalg og derefter indstille skalaen ved at klikke på analyser, indstille skalafunktionen. For vores tilfælde indtaster vi 9,4 centimeter.Markér radioboksen for global for at standardisere skalaen på tværs af alle følgende videoanalyser. Kopier analysekammerområdet ved hjælp af det ovale markeringsværktøj, og højreklik og vælg billed dublet. Angiv på nuværende tidspunkt det område af rammer, der skal bevares til yderligere analyse.Ryd uden for analysen kammer og konvertere billedet til et binært billede ved at trykke på genvejstasten syv på nummerlinjen. Når baggrunden er ryddet, vil du blive bedt om at tilføje en sort prik i midten for at angive placeringen af den vibrerende glasstang ved hjælp af det ovale markeringsværktøj, der allerede er indstillet til sort med fyldfunktionen. Klik på OK, hvormakroen beder dig om at gå videre til tærskeljusteringen.Juster tærsklen, så fisken kan ses i hele videoklippet, og vælg derefter anvende. Kør Tracker plug-in ved at trykke på genvejstasten otte på nummerlinjen. Angiv minimumpixelstørrelsen til 100, når du bliver bedt om det.Denne proces vil generere afstanden mellem den vibrerende glasstang og fisken pr. ramme i alle tre minutter af den binære video. Hvis du vil gemme sporingsfilen, skal du trykke på genvejstasten ni på nummerlinjen. Dette vil automatisk eksportere en binær stak af billeder af hele videoen og en XLS-fil med koordinater og afstandsdata, hvis det er nødvendigt at reanalysere.Dette vil også lukke alle filer, der er knyttet til den aktuelle video. De genererede filer kan nu analyseres yderligere afhængigt af det specifikke forskningsspørgsmål. Akklimatisere fem eksperimentelle fisk i fire dage eller mere i hvert kammer af en brugerdefineret design 10 liter akryl optagelse akvarium fyldt med konditioneret vand.Hvert enkelt kammer er adskilt med sort akryl bord. Hver tank skal være dækket for at forhindre fisk i at hoppe ind i et andet kammer. Indstil programmerbar effekttimer til automatisk at tænde hvidt LED-lys i 12 timer og slukke i 12 timer hver dag i akklimatiseringsperioden.Dette vil indtræde fiskens døgnrytme, hvis fisken er modtagelig for indtrædelse. For at give en mere diffust hvidt lys, bruger vi en flad hvid uigennemsigtig akryl bord af samme dimension som 10 liter tank som en diffuser til at passere lys igennem for hver tank. I denne periode, give en gang om dagen fodring med levende saltlage rejer og give befrugtning gennem svamp filter i hvert akvarium.Bemærk, sørg for, at fisk fodres på et ensartet tidspunkt. For eksempel en gang om dagen om morgenen. Dagen før analysedagen, tre dage eller mere af akklimatiseringen, erstatte vand i analysekammeret med frisk konditioneret vand.Indstil optagelsen af parametrene i VirtualDub-software. Videoen optages i 15 billeder pr. sekund i den faste eksponeringstid. Video komprimeres i X264VFW codec for at opnå ca. 700 gange komprimering.På optagelsesdagen fodres hver fisk med levende saltlagerejer. Fjern alle svamp filter og begynde at optage. Tænd for det infrarøde lys i optagelsesfasen.Ved at observere VirtualDub live billede på skærmen, justere placeringen af hvert akvarium for at sikre, at de står over for USB-kameraet korrekt. Start 24-timers optagelse i morgen. Starttidseringstid er f..m eks.og sluttid er 9 a.m den følgende dag. Begynd at optage videoen og sikre placeringen for at undgå forstyrrelser.Kontroller af og til, om optagelsen kører. Efter 24 timers optagelse skal du sørge for, at videoen er gemt korrekt. Overfør videoen til pc-arbejdsstationen for at spore fiskens adfærd.Når du har overført videoen til den relevante mappe, skal du hurtigt foretage et kvalitetstjek af videoen for at sikre, at den er af god kvalitet. Dette omfatter at se på belysningen, kontrollere, om der er en fisk i hver sektion, og om der er nogen udenlandske bevægelser, der kan forårsage fejlsporing. Herfra bruges freeware SwisTrack til dyresporing.Fordelen ved denne software er, at softwaren kan spore flere dyr på én gang og trække baggrundsbillede ved hjælp af en vilkårlig ramme, vi identificerer. Ulemperne er, at sporing kan hoppe mellem arenaer, der indeholder en anden fisk. Baggrundsbilledet er muligvis ikke tilstrækkeligt til de senere rammer, og SwisTrack tildeler tilfældigt sporings-id til individuelle fisk, derfor er det nødvendigt at inddrive fiske-id ved at plotte den gennemsnitlige fysiske position af hver fisk.For at løse disse problemer anvendes der tre tilgange. Brugen af binære masker, en til sporing af lige-nummererede arenaer, og en til sporing af ulige-nummererede arenaer. Brugen af Win-automation til automatisk at opdatere baggrundsbilleder hvert tredje minut og brugen af Perl scripts til at rekonstruere fiske-id'erne.Det første skridt i analysen er at gøre de binære masker for ulige og lige arenaer. Når du har kontrolleret videokvaliteten, skal du vælge et repræsentativt billede i en videoredigeringssoftware og bruge den til at oprette to binære masker, en til lige og en til ulige arenaer. Formålet med disse binære masker er at undgå fejlspor mellem tilstødende arenaer.Når du har lavet binære masker, skal du åbne De SwisTrack-parameterfiler, der bestemmer filstier og parametre for sporingsprocessen. Forbered én parameterfil i hver af de lige og ulige filmapper til videosporingen. Skriv stien til filplaceringerne for video- og maskefilerne i denne fil.Når du har forberedt parameterfilerne, skal du åbne den eksekverbare win-automation-fil, der automatisk nulstiller baggrunden hvert tredje minut. Med denne eksekverbare fil kører SwisTrack automatisk og åbner derefter parameterfilen i hver lige eller ulige mappe i denne sporingssoftware. Kør tracking software til at spore flytning af fisk.Inden for de første 9, 000 rammer af sporing, sikre, at fiskene bliver ordentligt sporet ved at se på den nærmeste nabo tracking komponent. Efter propery oprettelse sporing, vende tilbage til adaptive baggrund subtraktion komponent fanen og ramte genvejstast R på tastaturet for at køre Win-automatisering for kontinuerlig adaptive baggrund subtraktion. Efter ca. fem timer genereres tekstfiler for hver fisk, der indeholder X- og Y-koordinater for hver ramme i videoen.Hvis du vil fortsætte analysen, skal du allokere de tre Perl-scriptfiler til den mappe, der indeholder både lige og ulige mapper. For at konvertere længde i pixels til centimeter, er det nødvendigt at kende forholdet mellem centimeter og pixel. Skriv dette forhold på den relevante placering af Perl-scriptfilen med navnet 1.fillupGaps.pl.Kør 1.fillupGaps. pl Perl script ved hjælp af en Unix emulator til Windows. Brug først cd-kommandoen til at flytte til den aktuelle arbejdsmappe og derefter skrive Perl 1.fillupGaps.pl til at køre Perl script. De to andre scripts kaldes automatisk i rækkefølge. Disse tre scripts tildele hver tracking fil til hver del af akvariet, og dermed kan bruges til at analysere adfærd hver fisk.Overfr. tekstfilen med navnet Summary_Sleep der genereres efter at have kørt scriptene for at dobbelttjekke, at antallet af rammer, der er faldet fra analysen, er acceptabelt lavt. Mangler færre end 15 % af rammerne, anses for acceptable. Kopiere og indsætte sporingsdata i en regnearksfil med en in-house makro.Denne makro omstrukturerer de analyserede data til flere trinprocesniveauer, f.eks. For at plette fisk lateral linje, opløses DASPEI bestand opløsning i konditioneret vand til en endelig koncentration af fem mikrogram pr. milliliter, derefter nedsænkes fisken i opløsningen ved stuetemperatur i et mørkt miljø i 45 minutter. Efter 45 minutter, inddrive fisken fra DASPEI opløsning og nedsænkes i iskoldt konditioneret vand med MES triple to.Når fisken er dybt bedøvet, montere fisken i en petriskål og observere det under effektivt mikroskop. Sørg for at tage en statistik serie til at omfatte alle planer for fisk i fokus og kompilere alt i et enkelt billede. Til billedanalyse skal du tilføje en ny mappe med titlen Process_ImageJ og makrofilen til den mappe, der indeholder de billeder, der skal analyseres.Åbn ImageJ-softwaren, og åbn derefter makroen ved at trække makrofilen til ImageJ. Kør makro ved at klikke på makroer, afspille makro. Hvis billedet ikke åbnes automatisk, skal du klikke på makro og filafhentning.Makro vil derefter automatisk afhente en billedfil til at analysere. For neuromast kvantificering viser regionen af interesse ved at klikke polygon to, og tegne området på billedet. Otte, fem til at duplikere region af interesse.Brug maleværktøjet til at fjerne eller tilføje en prik, der er ekstra eller mangler i det forrige billede, og derefter otte, seks. Når du otte, seks, to nye vinduer vises. Et vindue, der viser en ordning med nummererede neuromast prikker og et vindue med et bord med samlede neuromast kvantificeret.Hit syv for at gemme begge filer. Når du klikker på OK, gemmes disse filer, og en ny billedfil åbnes til yderligere analyse. Konsolider antallet af neuromast ved at køre makro.Følgende resultater er repræsentative resultater af, hvad der kan forventes for begge morf af fisk under kontrollerede forhold. Disse fire tal viser repræsentative resultater fra vibrationer attraktion adfærd analyser. A og B er den bedste udsigt over svømmestien A, en overfladefisk og B en hulefisk.Røde linjer er spor af koordinaterne genereret af ImageJ sporing på tværs af tre minutters optagelse. C og D viser en sammenligning af resultaterne fra C, en overflade fisk, og D, en hulefisk, udvundet af regnearket makro fra TXT filer. Y-aksen er det optalte antal gange, fisken nærmede sig den vibrerende stang.Hver prik repræsenterer en eksperimentel observation under adfærdsmæssige analyse af en fisk. Bemærk, at overfladefisk ikke viser en stigning i tilgange på nogen frekvens, mens hulefisk viser et maksimum af attraktion omkring 35 til 40 Hertz. Disse to tal viser repræsentative resultater fra søvn adfærd analyser udvundet af regnearket makroer fra TXT filer.A og B viser to af de målinger, der automatisk opsummeres af makrofilen. Figur A viser svømmeafstanden i dagtimerne og om natten for overfladefisk og hulefisk, mens B viser søvnvarighed for begge morfer. I dette tilfælde viste hulefisk hyperaktivitet og mindre søvn sammenlignet med overfladefisk.Disse tal viser resultaterne af DASPEI billedanalyse udvundet af regnearksmakroen fra TXT-filerne. A og B demonstrere forholdet mellem neuromast nummer versus vibrationer attraktion adfærd og neuromast størrelse versus adfærd i hulefisk, overflade fisk, og F1 afkom. Hver prik repræsenterer hver fisk.Bemærk, at neuromasttallet er positivt korreleret med vibration attraktion adfærd, hvilket tyder på, at neuromast kan regulere denne adfærd. Neuromast størrelse understøtter også denne konklusion. C og D er eksempel billeder af DASPEI farves neuromast af C, en overflade fisk, og D, en hulefisk.Hver fluorescerende prik i billederne er en neuromast, som har taget op DASPEI. Bemærk, den mærkbart større overflod af neuromaste på hulefisk. Vi viste en række adfærdsanalyser for lateral line-baseret adfærd svømning aktivitet og søvn.Dyret tracking system kan også tilpasses til andre adfærd, såsom stereotype gentagne adfærd, sociale interaktioner, og adfærdsmæssige lateralitet.

Research

JoVE Journal

Behavior

Behavioral Phenotyping of Murine Disease Models with the Integrated Behavioral Station (INBEST)

Behavioral Phenotyping of Murine Disease Models with the Integrated Behavioral Station INBEST

Behavioral Fænotype af murine sygdomsmodeller med den integrerede Behavioral Station (INBEST)

Due to rapid advances in genetic engineering, small rodents have become the preferred subjects in many disciplines of biomedical research. In studies of ...

Behavioral Assessment of the Aging Mouse Vestibular System

Behavioral Vurdering af Aging Mouse vestibulære system

Age related decline in balance performance is associated with deteriorating muscle strength, motor coordination and vestibular function. While a number of ...

Performing Behavioral Tasks in Subjects with Intracranial Electrodes

Udførelse Adfærdsmæssige opgaver hos forsøgspersoner med Intrakranielle elektroder

Patients having stereo-electroencephalography (SEEG) electrode, subdural grid or depth electrode implants have a multitude of electrodes implanted in ...

The Rodent Psychomotor Vigilance Test (rPVT): A Method for Assessing Neurobehavioral Performance in Rats and Mice

The Rodent Psychomotor Vigilance Test rPVT: A Method for Assessing Neurobehavioral Performance in Rats and Mice

Den gnaver Psykomotorisk Årvågenhed Test (rPVT): en metode til vurdering neurobehavioral Performance i rotter og mus

The human Psychomotor Vigilance Test (PVT) is a widely used procedure for measuring changes in fatigue and sustained attention. The present article ...

Basic Methods for the Study of Reproductive Ecology of Fish in Aquaria

Grundlæggende metoder til undersøgelse af reproduktiv økologi af fisk i akvarier

Captive-rearing observations are valuable for revealing aspects of fish behavior and ecology when continuous field investigations are impossible. Here, a ...

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

En trådløs, tovejs grænseflade for In Vivo optagelse og Stimulation af neurale aktivitet i frit opfører rotter

In vivo electrophysiology is a powerful technique to investigate the relationship between brain activity and behavior at a millisecond and micrometer ...

An Automated T-maze Based Apparatus and Protocol for Analyzing Delay- and Effort-based Decision Making in  Free Moving Rodents

En automatiseret T-maze baseret apparat og protokollen til at analysere forsinkelse - og indsats-baserede beslutningstagning i gratis flytte gnavere

Many neurological and psychiatric patients demonstrate difficulties and/or deficits in decision making. Rodent models are helpful to produce a deeper ...

Continuous Noninvasive Measuring of Crayfish Cardiac and Behavioral Activities

Kontinuerlig Noninvasive måling af krebs hjerte og adfærdsmæssige aktiviteter

A crayfish is a pivotal aquatic organism that serves both as a practical biological model for behavioral and physiological studies of invertebrates and as ...

Behavioral Approaches to Studying Innate Stress in Zebrafish

Adfærdsmæssige tilgange til at studere medfødte stress i Zebrafish

Responding appropriately to stressful stimuli is essential for survival of an organism. Extensive research has been done on a wide spectrum of ...

Automated Measurements of Sleep and Locomotor Activity in Mexican Cavefish

Automatiserede målinger af søvn og bevægeapparatet aktivitet i mexicansk Cavefish

Across phyla, sleep is characterized by highly conserved behavioral characteristics that include elevated arousal threshold, rebound following sleep ...