Name: behavioral tracking and neuromast imaging of mexican cavefish
Uploaded: 2019-04-06T14:00:00
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Agradecemos a todos los miembros del laboratorio de Yoshizawa incluyendo N. Cetraro, Simon N., C. Valdez, C. Macapac, J. Choi, Lu L., J. Nguyen, S. Podhorzer, Hernandes H., J. Fong, Kato J. e I. Señor, para el cuidado de peces en los pescados experimentales utilizados en este manuscrito. También agradecemos a los miembros de lab A. Keene incluyendo Masek de P. para entrenar a mi montar cámara IR CCD. Por último, nos gustaría agradecer el Media Lab - Facultad de ciencias sociales - escuela de comunicaciones en la Universidad de Hawai ' i Mānoa su inestimable ayuda para hacer el video, especialmente B. Smith, J. Lam y blanco S. a. Este trabajo fue apoyado por Fundación comunitaria hawaiano (78919 16CON y 18CON 90818) e Instituto Nacional de salud NIGMS (P20GM125508) concede a mi.

Todos los procedimientos se realizan siguiendo las pautas descritas en "Principios de laboratorio Animal Care" (Instituto Nacional de salud publicación nº 85-23, revisada en 1985) y el aprobado por la Universidad de Hawai en Manoa institucional Animal cuidado y uso Protocolo de animales Comité 17-2560-3.
1. Análisis de comportamiento (VAB) de atracción vibración (≤ 10 minutos para el procedimiento de grabación entero)
Nota: Utilice una cámara de infrarrojos ...

<ol>
	<li>Keene, A. C., Yoshizawa, M., McGaugh, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , (2015).</li><li>Mitchell, R. W., Russell, W. H., Elliott, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mexican eyeless characin fishes, genus Astyanax: Environment, distribution, and evolution.Special publications the museum Texas Tech University. (12), (1977).</li><li>Wilkens, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+genetics+of+epigean+and+cave+Astyanax-fasciatus+(Characidae,+Pisces)+-+Support+for+the+neutral+mutation+theory.">Evolution and genetics of epigean and cave Astyanax-fasciatus (Characidae, Pisces) - Support for the neutral mutation theory.</a> Evolutionary Biology. 23, 271-367 (1988).</li><li>Fumey, J., Hinaux, H., Noirot, C., Thermes, C., R&#233;taux, S., Casane, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+late+Pleistocene+origin+of+Astyanax+mexicanus+cavefish.">Evidence for late Pleistocene origin of Astyanax mexicanus cavefish.</a> BMC Evolutionary Biology. 18 (1), 1-19 (2018).</li><li>Yoshizawa, M., Gori&#269;ki, S., Soares, D., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+a+behavioral+shift+mediated+by+superficial+neuromasts+helps+cavefish+find+food+in+darkness.">Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness.</a> Current Biology. 20 (18), 1631-1636 (2010).</li><li>Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyeless+Mexican+cavefish+save+energy+by+eliminating+the+circadian+rhythm+in+metabolism.">Eyeless Mexican cavefish save energy by eliminating the circadian rhythm in metabolism.</a> PloS One. 9 (9), e107877 (2014).</li><li>Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+energetic+cost+of+vision+and+the+evolution+of+eyeless+Mexican+cavefish.">The energetic cost of vision and the evolution of eyeless Mexican cavefish.</a> Science Advances. 1 (8), e1500363 (2015).</li><li>Yoshizawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Evolution+of+a+Series+of+Behavioral+Traits+is+associated+with+Autism-Risk+Genes+in+Cavefish.">The Evolution of a Series of Behavioral Traits is associated with Autism-Risk Genes in Cavefish.</a> BMC Evolutionary Biology. 18 (1), 89 (2018).</li><li>Riddle, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+in+cavefish+as+an+adaptation+to+a+nutrient-limited+environment.">Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment.</a> Nature. 555 (7698), 647-651 (2018).</li><li>Protas, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+cavefish+reveals+molecular+convergence+in+the+evolution+of+albinism.">Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism.</a> Nature Genetics. 38 (1), 107-111 (2006).</li><li>Yoshizawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+genetic+architecture+underlies+the+emergence+of+sleep+loss+and+prey-seeking+behavior+in+the+Mexican+cavefish.">Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish.</a> BMC Biology. 13 (1), 15 (2015).</li><li>Dubou&#233;, E. R., Keene, A. C., Borowsky, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+convergence+on+sleep+loss+in+cavefish+populations.">Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations.</a> Current Biology. 21 (8), 671-676 (2011).</li><li>Fernandes, V. F. L., Macaspac, C., Lu, L., Yoshizawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+developmental+plasticity+and+a+coupling+between+left+mechanosensory+neuromasts+and+an+adaptive+foraging+behavior.">Evolution of the developmental plasticity and a coupling between left mechanosensory neuromasts and an adaptive foraging behavior.</a> Developmental Biology. 441 (2), 262-271 (2018).</li><li>P&#233;rez-Escudero, A., Vicente-Page, J., Hinz, R. C., Arganda, S., de Polavieja, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=idTracker:+tracking+individuals+in+a+group+by+automatic+identification+of+unmarked+animals.">idTracker: tracking individuals in a group by automatic identification of unmarked animals.</a> Nature Methods. 11, 743 (2014).</li><li>Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+ethomics+in+large+groups+of+Drosophila.">High-throughput ethomics in large groups of Drosophila.</a> Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).</li><li>Yoshizawa, M., Jeffery, W. R., Van Netten, S. M., McHenry, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sensitivity+of+lateral+line+receptors+and+their+role+in+the+behavior+of+Mexican+blind+cavefish+(Astyanax+mexicanus).">The sensitivity of lateral line receptors and their role in the behavior of Mexican blind cavefish (Astyanax mexicanus).</a> Journal of Experimental Biology. 217 (6), (2014).</li><li>Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Virtualdub. , (2014).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Cavallari, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blind+circadian+clock+in+cavefish+reveals+that+opsins+mediate+peripheral+clock+photoreception.">A blind circadian clock in cavefish reveals that opsins mediate peripheral clock photoreception.</a> PLoS Biology. 9 (9), e1001142 (2011).</li><li>Swimmer, B., Lang, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Surface Wave Discrimination between Prey and Nonprey by the Back Swimmer Notonecta glauca L. (Hemiptera , Heteroptera ). 6 (3), 233-246 (1980).</li><li>Montgomery, J. C., Macdonald, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sensory Tuning of Lateral Line Receptors in Antarctic Fish to the Movements of Planktonic Prey. 235 (4785), 195-196 (1987).</li><li>Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A., Sung, R. J., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypocretin/orexin+overexpression+induces+an+insomnia-like+phenotype+in+zebrafish.">Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish.</a> The Journal of Neuroscience. 26 (51), 13400-13410 (2006).</li><li>Zhdanova, I. V., Wang, S. Y., Leclair, O. U., Danilova, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+promotes+sleep-like+state+in+zebrafish.">Melatonin promotes sleep-like state in zebrafish.</a> Brain Research. 903 (1-2), 263-268 (2001).</li><li>Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+Spreading+and+Toxicity+of+Prion-like+Proteins+Using+the+Metazoan+Model+Organism+C.+elegans.">Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52321 (2015).</li><li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Object Tracker. , (2000).</li><li>Ferreira, T., Rasband, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Create+Shortcuts.">Create Shortcuts.</a> ImageJ User Guide. , (2012).</li><li>Lochmatter, T., Roduit, P., Cianci, C., Correll, N., Jacot, J., Martinoli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SwisTrack. , (2008).</li></ol>

Estos métodos presentados son de fácil acceso pero pueden ser complicados de realizar debido a la naturaleza de sus orígenes de freeware. Por lo tanto, se recomienda realizar ensayos de prueba y análisis ante cualquier experimentación real.
La tasa de generación de datos puede ser rápida una vez que se establecen el marco experimental y analítico. Una vez establecida, es posible grabamos dos peces en 7 minutos para el ensayo de VAB, 30 peces en 24 h para el ensayo de actividad/sueño y...

El tetra mexicano, Astyanax mexicanus (Teleostei: Characidae), es único entre los peces por tener dos morfos alternativas radicalmente distintas - un morph vidente, de superficie y un ciego, cavernas morph consta de varios distintos las poblaciones1. Aunque diferentes en morfología y fisiología, son interfértiles todavía2,3. Estos morfos distintas parecen que han evolucionado rápidamente (~ 20.000 años)4, que los hace un sistema modelo ideal para el estudio de rápida adaptación. Cavefish es conocidos por tener una serie de divergentes características morfológicas y conductuales como aumento de densidad de brotes del gusto, aumento del número de mechanosensors, sintonizada a una frecuencia particular de un estímulo vibratorio, hiperactividad, conducta de forrajeo y falta de sueño. Muchos de estos comportamientos probablemente evolucionados simultáneamente, algunos de los cuales se han sugerido para ser ventajoso en la oscuridad de las cuevas para forrajeo5 y conservación de la energía en entornos oscuros y escasos alimentos6,7.
En muchos sistemas del modelo evolutivo, es difícil adquirir conocimientos integrados en cambio cómo animal de morfología y comportamiento en respuesta al medio ambiente porque la mayoría de las especies se distribuye en un gradiente continuo en entornos complejos. Sin embargo, el contraste entre la cueva y morph superficial Astyanax que evolucionaron en ambientes delineados por un ecotono agudo altamente contrastantes ha llevado a Astyanax emerge como un excelente modelo para entender la evolución animal. Esto hace posible conectar más fácilmente los genes y procesos de desarrollo con características adaptativas y selección en el medio ambiente. Además, recientes investigaciones biomédicas de estos rasgos en Astyanax ha demostrado que estos rasgos pueden paralelo humano síntomas8,9,10. Por ejemplo, pérdida de sociabilidad y de sueño y aumento de la hiperactividad, comportamiento repetitivo y niveles de cortisol son similares a lo que se observa en los seres humanos con autismo espectro desorden8.
Para abordar la compleja coevolución de muchos comportamientos y rasgos morfológicos, es conveniente analizar a muchos de ellos para destacar las vías genéticas y moleculares subyacentes. Se presentan adjunto los métodos para caracterizar el grado de fenotipos conductuales cueva-tipo de superficie, cueva y híbrido morfos de Astyanax. Los comportamientos focales analizados para caracterizar el fenotipo son cueva adaptada alimentación comportamiento (vibración atracción, denominada en lo sucesivo VAB) y sueño hiperactividad duración11,12. También es un método imagenológico para el sistema sensorial asociado con VAB13. Recientemente, muchos programas de seguimiento de código abierto para ejecutar ensayos de comportamiento se han convertido en disponibles14,15. Éstos trabajan muy bien para videos cortos, de menos de 10 minutos de duración. Sin embargo, se convierte en problemática si el video es más largo debido a tiempo de seguimiento de computación intensos. Software disponible comercialmente capaz puede ser caro. Los métodos presentados principalmente usan freeware y por lo tanto se consideran métodos rentables y de alto rendimiento. También se incluyen resultados representativos basan en estos métodos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:600px;" width="600">
	<tbody>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:221px;">4-Di-1-ASP (4-(4-(dimethylaminostyryl)-1-methylpyridinium iodide)</td>
			<td style="width:85px;">MilliporeSigma</td>
			<td style="width:123px;">D3418</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:221px;">880 nm wave length black light</td>
			<td style="width:85px;">Advanced Illumination</td>
			<td style="width:123px;">BL41192-880</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">avfs</td>
			<td style="width:85px;">freeware</td>
			<td style="width:123px;">Version 1.0.0.6</td>
			<td style="width:171px;">http://turtlewar.org/avfs/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Avisynth</td>
			<td style="width:85px;">freeware</td>
			<td style="width:123px;">Version 2.6.0</td>
			<td style="width:171px;">http://avisynth.nl/index.php/Main_Page</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Cygwin</td>
			<td style="width:85px;">freeware</td>
			<td style="width:123px;">Version 2.11.0</td>
			<td style="width:171px;">https://www.cygwin.com/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Cylindrical assay chamber (Pyrex 325 ml glass dish)</td>
			<td style="width:85px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">3140-100</td>
			<td style="width:171px;">10 cm diameter 5 cm high</td>
		</tr>
		<tr height="187">
			<td height="187" style="height:187px;width:221px;">Ethovision XT</td>
			<td style="width:85px;">Noldus Information&#160; Technology, Wageningen, The Netherlands</td>
			<td style="width:123px;">Version 14</td>
			<td style="width:171px;">https://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:221px;">Fish Aquarium Cylinder Soft Sponge Stone Water Filter, Black</td>
			<td style="width:85px;">Jardin (through Amazon.com)</td>
			<td style="width:123px;">NA</td>
			<td style="width:171px;">Sponge filter for Sleep/hyperactivity recording system</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:221px;">Grade A Brine shrimp eggs</td>
			<td style="width:85px;">Brine shrimp direct</td>
			<td style="width:123px;">BSEA16Z</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">ImageJ</td>
			<td style="width:85px;">freeware</td>
			<td style="width:123px;">Version 1.52e</td>
			<td style="width:171px;">https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:221px;">macro 1.8/12.5-75mm C-mount zoom lens</td>
			<td style="width:85px;">Toyo</td>
			<td style="width:123px;">NA</td>
			<td style="width:171px;">Attach to USB webcam by using c-mount, which is printed in 3-D printer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Neutral Regulator</td>
			<td style="width:85px;">Seachem</td>
			<td style="width:123px;">NA</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:221px;">Optical cast plastic IR long-pass filter</td>
			<td style="width:85px;">Edmund optics</td>
			<td style="width:123px;">43-948</td>
			<td style="width:171px;">Cut into a small piece to fit in the CCD of USB webcam</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:221px;">pfmap</td>
			<td style="width:85px;">freeware</td>
			<td style="width:123px;">Build 178</td>
			<td style="width:171px;">http://pismotec.com/download/ (at &#8220;Download Archive&#8221; link at the bottom)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Reef Crystals Reef Salt</td>
			<td style="width:85px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:123px;">RC15-10</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">SwisTrack</td>
			<td style="width:85px;">freeware</td>
			<td style="width:123px;">Version 4</td>
			<td style="width:171px;">https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">USB webcam (LifeCam Studio 1080p HD Webcam)</td>
			<td style="width:85px;">Microsoft</td>
			<td style="width:123px;">Q2F-00013</td>
			<td style="width:171px;">Cut 2-2.5 cm of the front</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:221px;">WinAutomation</td>
			<td style="width:85px;">freeware</td>
			<td style="width:123px;">Version 8</td>
			<td style="width:171px;">https://www.winautomation.com/ (free stand-alone app for this procedure)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Windows operating system</td>
			<td style="width:85px;">Microsoft</td>
			<td style="width:123px;">7, 8 or 10</td>
			<td style="width:171px;">https://www.microsoft.com/en-us/windows</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">x264vfw</td>
			<td style="width:85px;">freeware</td>
			<td style="width:123px;">NA</td>
			<td style="width:171px;">https://sourceforge.net/projects/x264vfw/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

behavioral tracking and neuromast imaging of mexican cavefish

Animales cavernícolas han evolucionado una serie de rasgos morfológicos y de comportamiento para adaptarse a sus entornos permanentemente oscuros y escaso de alimentos. Entre estos rasgos, comportamiento de alimentación es una de las ventanas útiles en ventajas funcionales de la evolución del rasgo de comportamiento. Aquí se presentan métodos actualizados para el análisis de comportamiento de atracción de vibraciones (VAB: un comportamiento de forrajeo adaptativo) y proyección de imagen de mechanosensors asociado de adaptado de cueva tetra, Astyanax mexicanus. Además, se presentan métodos para el rastreo de alto rendimiento de una serie de comportamientos cavefish adicional incluyendo hiperactividad y pérdida de sueño. Cavefish también muestra asociality, conducta repetitiva y mayor ansiedad. Por lo tanto, cavefish sirve como un modelo animal para comportamientos evolucionados. Estos métodos utilizan scripts software libre y a medida que se pueden aplicar a otros tipos de comportamiento. Estos métodos proporcionan alternativas prácticas y rentables de software de seguimiento disponibles en el mercado.

Los resultados presentados en este documento son ejemplos representativos de lo que puede ser adquirido con los métodos presentados. Por lo tanto, resultados pueden diferir ligeramente de los presentados aquí para peces superficie dependiendo de las condiciones experimentales y cavefish.
Comportamiento de atracción de vibraciones
Resultados represen...

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Behavioral Tracking and Neuromast Imaging of Mexican Cavefish

Seguimiento conductual y Neuromast proyección de imagen de mexicana Cavefish

Aquí, presentamos métodos para estudio de alto rendimiento de una serie de cavefish mexicano comportamientos y la coloración vital de un sistema de mechanosensory. Estos métodos utilizan scripts software libre y a medida, ofreciendo un método práctico y rentable para los estudios de comportamientos.

Cave-dwelling animals have evolved a series of morphological and behavioral traits to adapt to their perpetually dark and food-sparse environments. Among ...

Cavefish está criando como un fantástico mural animal para entender la evolución y los procesos biomédicos. Ahora estamos llevando a cabo una investigación biomédica utilizando estos rasgos como un paralelismo de los síntomas humanos. Aquí vamos a mostrar la batería del ensayo de comportamientos y el sistema de análisis que se puede utilizar tanto para estudios evolutivos como biomédicos.Para ensayar la vibración atrae y el comportamiento, se inserta una varilla de vidrio vibratoria en un recipiente de vidrio que contiene un pez en la oscuridad. Los peces se aclimatan cuatro días antes del ensayo en agua acondicionada con un ciclo oscuro de 12, 12. El día anterior al día del ensayo después de tres días de aclimatación, reemplace el agua en la cámara de ensayo con agua fresca condicionada.El día del ensayo, los peces se ven privados de alimentos hasta después de que se complete el ensayo, porque el cese cambiará su respuesta a las vibraciones. Prepare el aparato emisor de vibraciones ajustando a 40 Hertz. Establezca los parámetros de grabación adecuados, las condiciones de stock y el archivo de destino.Coloque el cilindro de ensayo en el escenario de grabación, iluminado con retroiluminación infrarroja en una habitación oscura, y permita que los peces se aclimaten durante tres minutos después de ser colocados en el escenario. Después de la aclimatación de tres minutos en la oscuridad, graba tres minutos y 30 segundos de video. Al inicio de la grabación, inserte la varilla de vidrio vibratoria de 7,5 milímetros de diámetro en la columna de agua, aproximadamente 5 centímetros de profundidad.Evite hacer ruido o vibraciones mientras coloca la varilla de vidrio vibratoria en el agua, ya que los peces pueden detectar ruidos y vibraciones menores. Asegúrese de finalizar este procedimiento dentro de los 30 segundos posteriores a iniciar la grabación de vídeo para asegurarse de que se graban más de tres minutos de comportamiento. Ejecute el archivo por lotes haciendo doble clic en avs_creator.murciélago para convertir el vídeo AVI comprimido en formato legible para ImageJ. La macro se puede cargar simplemente arrastrando y soltando en un shell gráfico de la interfaz de usuario. Esta macro habilitará ciertas teclas de acceso rápido para el siguiente análisis.En el directorio de trabajo, cree una nueva carpeta y asígnela Process_ImageJ. Esta carpeta se utilizará automáticamente para almacenar archivos de salida del siguiente análisis. Haga clic con el botón derecho en el archivo de vídeo AVS que desea analizar y seleccione montaje rápido.Después de montar el archivo AVS como una unidad externa, abra el archivo AVI en ImageJ. Para establecer la escala de la medida de distancia, seleccione el diámetro de la cámara de ensayo dibujando una línea recta a través de la cámara utilizando la herramienta de selección de línea recta y, a continuación, establezca la escala haciendo clic en analizar, establecer la función de escala. Para nuestro caso, ingresamos 9,4 centímetros.Marque la casilla de radio del global para estandarizar la escala a través de todo el análisis de video siguiente. Copie el área de la cámara de ensayo utilizando la herramienta de selección ovalada y, a continuación, haga clic con el botón derecho y seleccione duplicado de imagen. En este momento, especifique el rango de fotogramas que desea conservar para su análisis posterior.Despeje fuera de la cámara de ensayo y convierta la imagen en una imagen binaria pulsando la tecla de acceso rápido siete en la barra de números. Después de que el fondo se borre, se le pedirá que agregue un punto negro en el centro para indicar la posición de la varilla de vidrio vibratoria utilizando la herramienta de selección ovalada ya establecida en negro con la función de relleno. Haga clic en Aceptar y la macro le pedirá que pase al ajuste de umbral.Ajuste el umbral para que el pez pueda ser visto a lo largo de todo el clip de vídeo, luego seleccione aplicar. Ejecute el complemento Tracker pulsando la tecla de acceso rápido ocho en la barra de números. Establezca el tamaño mínimo de píxel en 100, cuando se le solicite.Este proceso generará la distancia entre la varilla de vidrio vibratoria y el pez por fotograma durante los tres minutos del vídeo binario. Para guardar el archivo de seguimiento, pulse la tecla de acceso rápido nueve en la barra de números. Esto exportará automáticamente una pila binaria de imágenes de todo el vídeo y un archivo XLS con coordenadas y datos de distancia, en caso de que sea necesario volver a analizar.Esto también cerrará todos los archivos asociados con el video actual. Los archivos generados ahora se pueden analizar más en función de la pregunta de investigación específica. Aclimatar cinco peces experimentales durante cuatro días o más en cada cámara de un acuario de grabación de acrílico de 10 litros de diseño personalizado lleno de agua acondicionada.Cada cámara individual está separada con tablero de acrílico negro. Cada tanque debe estar cubierto para evitar que los peces salten a otra cámara. Ajuste el temporizador de alimentación programable para encender automáticamente la luz LED blanca durante 12 horas y apagar durante 12 horas todos los días durante el período de aclimatación.Esto ententrará el ritmo circadiano de los peces si el pez es susceptible al entrenamiento. Con el fin de proporcionar una luz blanca más difusa, utilizamos una placa acrílica blanca plana opaca de dimensiones similares al tanque de 10 litros como un difusor para pasar la luz a través de cada tanque. Durante este período, proporcionar una vez al día la alimentación con camarones de salmuera vivos y proporcionar aireación a través de filtro de esponja en cada acuario.Tenga en cuenta que asegúrese de que los peces se alimentan en tiempo constante. Por ejemplo, una vez al día por la mañana. El día anterior al día del ensayo, tres días o más de la aclimatación, reemplace el agua de la cámara de ensayo por agua fresca acondicionada.Establezca la grabación de los parámetros en el software VirtualDub. El vídeo se grabará en 15 fotogramas por segundo en el tiempo de exposición fijo. El vídeo se comprime en el códec X264VFW para lograr aproximadamente 700 veces la compresión.El día de la grabación, alimente a cada pez con camarones de salmuera vivos. Retire todo el filtro de esponja y comience a grabar. Encienda la luz infrarroja en la etapa de grabación.Al observar la imagen en vivo de VirtualDub en la pantalla, ajuste la posición de cada acuario para asegurarse de que se enfrentan a la cámara USB correctamente. Comience la grabación las 24 horas por la mañana. Por ejemplo, la hora de inicio es 9 a.m.y la hora de finalización es 9 a.m al día siguiente. Comience a capturar el vídeo y asegure la ubicación para evitar perturbaciones.De vez en cuando, compruebe si la grabación se está ejecutando. Después de la grabación de 24 horas, asegúrese de que el vídeo se ha guardado correctamente. Transfiera el vídeo a la estación de trabajo del PC para realizar un seguimiento del comportamiento del pez.Después de transferir el vídeo a la carpeta adecuada, haga rápidamente una comprobación de calidad del vídeo para asegurarse de que es de buena calidad. Esto incluye mirar la iluminación, comprobar si hay un pez en cada sección, y si hay algún movimiento extraño que puede causar un mal seguimiento. Desde aquí, el software gratuito SwisTrack se utiliza para el seguimiento de animales.La ventaja de este software es que el software puede rastrear múltiples animales a la vez y restar la imagen de fondo mediante el uso de un marco arbitrario que identificamos. Las desventajas son que el seguimiento puede saltar entre arenas que contienen un pez diferente. La imagen de fondo puede no ser adecuada para los fotogramas posteriores, y SwisTrack asigna aleatoriamente ID de seguimiento a peces individuales, por lo tanto, es necesario recuperar la identificación de peces trazando la posición física media de cada pez.Para superar estos problemas, se utilizan tres enfoques. El uso de máscaras binarias, una para el seguimiento de arenas pares, y otra para el seguimiento de arenas impares. El uso de Win-automation para actualizar automáticamente las imágenes de fondo cada tres minutos y el uso de scripts Perl para reconstruir los IDs de peces.El primer paso del análisis es hacer las máscaras binarias para arenas pares e impares. Después de comprobar la calidad del vídeo, elija un fotograma representativo en un software de edición de vídeo y utilícelo para crear dos máscaras binarias, una para par y otra para arenas impares. El propósito de estas máscaras binarias es evitar el seguimiento erróneo entre las arenas adyacentes.Después de crear máscaras binarias, abra los archivos de parámetros SwisTrack que determinan las rutas de acceso y los parámetros del archivo para el proceso de seguimiento. Prepare un archivo de parámetros en cada una de las carpetas de archivos pares e impares para el seguimiento de vídeo. En este archivo, escriba la ruta de acceso a las ubicaciones de archivo de los archivos de vídeo y máscara.Después de preparar los archivos de parámetros, abra el archivo ejecutable Win-automation que restablece automáticamente el fondo cada tres minutos. Con este archivo ejecutable, SwisTrack se ejecutará automáticamente y, a continuación, abrirá el archivo de parámetros en cada carpeta par o impar de este software de seguimiento. Ejecute el software de seguimiento para realizar un seguimiento del movimiento de los peces.Dentro de los primeros 9.000 fotogramas de seguimiento, asegúrese de que los peces están siendo rastreados correctamente mirando el componente de seguimiento del vecino más cercano. Después de establecer el seguimiento, vuelva a la pestaña del componente de resta de fondo adaptable y presione la tecla de acceso rápido R en el teclado para ejecutar Win-automation para una resta de fondo adaptable continua. Después de unas cinco horas, se generan archivos de texto para cada pez, que contienen coordenadas X e Y para cada fotograma del vídeo.Para continuar con el análisis, asigne los tres archivos de script De Perl a la carpeta que incluye carpetas pares e impares. Para convertir la longitud en píxeles a centímetros, es necesario conocer la proporción de centímetro a píxel. Escriba esta proporción en la ubicación adecuada del archivo de script de Perl denominado 1.fillupGaps.pl.Ejecute 1.fillupGaps. pl Perl script utilizando un emulador de Unix para Windows. En primer lugar, utilice el comando CD para desplazarse al directorio de trabajo actual y, a continuación, escriba Perl 1.fillupGaps.pl para ejecutar el script Perl. Los otros dos scripts se llamarán automáticamente en orden secuencial. Estos tres scripts asignan cada archivo de seguimiento a cada sección del acuario, y por lo tanto se pueden utilizar para analizar el comportamiento de cada pez.Consulte con el archivo de texto denominado Summary_Sleep que se genera después de ejecutar los scripts para comprobar dos veces que el número de fotogramas eliminados del análisis es aceptablemente bajo. Falta menos del 15% de las tramas se considera aceptable. Copie y pegue los datos de seguimiento en un archivo de hoja de cálculo con una macro interna.Esta macro reestructurará los datos analizados en varios niveles de proceso de paso, como el promedio de duración del sueño y la suma de la distancia de natación. Con el fin de manchar la línea lateral de los peces, disolver la solución de caldo DASPEI en agua acondicionada para una concentración final de cinco microgramos por mililitro, luego sumergir el pescado en la solución a temperatura ambiente en un ambiente oscuro durante 45 minutos. Después de 45 minutos, recuperar el pescado de la solución DASPEI y sumergirlo en agua acondicionada con MES triple dos.Una vez que el pescado está profundamente anestesiado, montar el pescado en un plato de Petri y observarlo bajo un microscopio eficiente. Asegúrese de tomar una serie estadística para incluir todos los planes de los peces en el foco y compilar todo en una sola imagen. Para el análisis de imágenes, agregue una nueva carpeta titulada Process_ImageJ y el archivo de macro a la carpeta que contiene las imágenes que se van a analizar.Abra el software ImageJ y, a continuación, abra la macro arrastrando el archivo de macro a ImageJ. Ejecute macro haciendo clic en macros, ejecute macro. Si la imagen no se abre automáticamente, haga clic en macro, recogida de archivos.Macro recogerá automáticamente un archivo de imagen para analizarlo. Para la cuantificación neuromast muestra la región de interés haciendo clic en el polígono dos, y dibuje el área en la imagen. Ocho, cinco a la región duplicada de interés.Utilice la herramienta de pintura para eliminar o agregar cualquier punto que sea extra o que falte de la imagen anterior y luego ocho, seis. Una vez que aparezcan ocho, seis, dos nuevas ventanas. Una ventana que muestra un esquema de puntos neuromast numerados y una ventana con una tabla con neuromast total cuantificado.Pulsa siete para guardar ambos archivos. Una vez que haga clic en Aceptar, esos archivos se almacenan y se abrirá un nuevo archivo de imagen para su posterior análisis. Consolidar el recuento de neuromasta mediante la ejecución de macro.Los siguientes resultados son resultados representativos de lo que se puede esperar para ambos morfos de peces en condiciones controladas. Estas cuatro figuras muestran resultados representativos de los ensayos de comportamiento de atracción de vibraciones. A y B son vistas superiores de la ruta de natación de A, un pez de superficie, y B un pez cueva.Las líneas rojas son los rastros de las coordenadas generadas por el seguimiento de ImageJ a lo largo de tres minutos de grabación. C y D muestran una comparación de los resultados de C, un pez de superficie, y D, un pez cueva, extraído por la macro de hoja de cálculo de los archivos TXT. El eje Y es el número contado de veces que el pez se acercó a la barra vibratoria.Cada punto representa una observación experimental durante el ensayo conductual de un pez. Tenga en cuenta que los peces de superficie no muestran un aumento en los enfoques en cualquier frecuencia, mientras que los peces cavernícolas muestran un máximo de atracción alrededor de 35 a 40 hercios. Estas dos figuras muestran resultados representativos de los ensayos de comportamiento del sueño extraídos por las macros de hoja de cálculo de los archivos TXT.A y B muestran dos de las métricas resumidas automáticamente por el archivo de macro. La Figura A muestra la distancia de natación durante el día y la noche para peces de superficie y peces cavernosos, mientras que B muestra la duración del sueño para ambos morfos. En este caso, el pez cueva mostró hiperactividad y menos sueño en comparación con los peces de superficie.Estas cifras muestran los resultados del análisis de imágenes DASPEI extraído por la macro de hoja de cálculo de los archivos TXT. A y B demuestran la relación entre el número de neuromast frente al comportamiento de atracción de vibraciones y el tamaño del neuromast frente al comportamiento en peces cavernosos, peces de superficie y progenie de F1. Cada punto representa cada pez.Tenga en cuenta que el número de neuromasta está correlacionado positivamente con el comportamiento de atracción de vibraciones, lo que sugiere que el neuromast puede regular este comportamiento. El tamaño del neuromast también apoya esta conclusión. C y D son imágenes de ejemplo del neuromast teñido DASPEI de C, un pez superficial, y D, un pez cueva.Cada punto fluorescente en las imágenes es un neuromasta, que ha tomado DASPEI. Tenga en cuenta, la abundancia notablemente mayor de neuromastos en el pez cueva. Mostramos una serie de análisis de comportamiento para la actividad de natación basada en líneas laterales y el sueño.El sistema de seguimiento animal también se puede adaptar a otros comportamientos, como comportamientos estereotípicos repetitivos, interacciones sociales y lateralidad conductual.

Research

JoVE Journal

Behavior

Behavioral Phenotyping of Murine Disease Models with the Integrated Behavioral Station (INBEST)

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Comportamiento Fenotipificación de modelos murinos de enfermedades con la Estación Integrada Comportamiento (InBest)

Due to rapid advances in genetic engineering, small rodents have become the preferred subjects in many disciplines of biomedical research. In studies of ...

Investigación

Comportamiento

Behavioral Assessment of the Aging Mouse Vestibular System

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Age related decline in balance performance is associated with deteriorating muscle strength, motor coordination and vestibular function. While a number of ...

Performing Behavioral Tasks in Subjects with Intracranial Electrodes

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Patients having stereo-electroencephalography (SEEG) electrode, subdural grid or depth electrode implants have a multitude of electrodes implanted in ...

The Rodent Psychomotor Vigilance Test (rPVT): A Method for Assessing Neurobehavioral Performance in Rats and Mice

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La prueba de roedores psicomotor Vigilancia (rPVT): Un método para evaluar el rendimiento neuroconductual en ratas y ratones

The human Psychomotor Vigilance Test (PVT) is a widely used procedure for measuring changes in fatigue and sustained attention. The present article ...

Basic Methods for the Study of Reproductive Ecology of Fish in Aquaria

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A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

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