Name: tissue preparation and immunostaining of mouse craniofacial tissues and undecalcified bone
Uploaded: 2019-05-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dai National Institutes of Health (da R01DE020843 a Y.M.), dall'International FOP Association (Y.M.) e da una sovvenzione della National Natural Science Foundation of China (da 31500788 a J.Y.).

Tutti gli esperimenti sui topi sono stati condotti in conformità con le linee guida dell'Università del Michigan che riguardano la cura umana e l'uso degli animali nella ricerca. Tutte le procedure sugli animali utilizzate in questo studio sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Michigan (Protocollo #PRO00007715).
1. Preparazione dei tessuti
<ol><li>
Preparazione dei tessuti embrionali
	<ol>
<li>Preparare un piatto...

<ol>
	<li>Trinh, L. e. A., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+cell+and+molecular+dynamics+of+craniofacial+development:+challenges+and+new+opportunities+in+imaging+developmental+tissue+patterning.">Imaging the cell and molecular dynamics of craniofacial development: challenges and new opportunities in imaging developmental tissue patterning.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 599-629 (2015).</li><li>Marcucio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facial+morphogenesis:+physical+and+molecular+interactions+between+the+brain+and+the+face.">Facial morphogenesis: physical and molecular interactions between the brain and the face.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 299-320 (2015).</li><li>Graf, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+mechanisms+in+development+and+disease:+BMP+signaling+in+craniofacial+development.">Common mechanisms in development and disease: BMP signaling in craniofacial development.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 27, 129-139 (2016).</li><li>Snider, T. N., Mishina, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranial+neural+crest+cell+contribution+to+craniofacial+formation,+pathology,+and+future+directions+in+tissue+engineering.">Cranial neural crest cell contribution to craniofacial formation, pathology, and future directions in tissue engineering.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 102 (3), 324-332 (2014).</li><li>Mishina, Y., Snider, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cell+signaling+pathways+critical+to+cranial+bone+development+and+pathology.">Neural crest cell signaling pathways critical to cranial bone development and pathology.</a> Experimental Cell Research. 325 (2), 138-147 (2014).</li><li>Van Hecke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+Immunohistochemical+Staining+Today:+Choices+to+Make,+Challenges+to+Take.">Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take.</a> Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).</li><li>Xiao, C., Dan-Bi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+staining+immunohistochemistry.">Double staining immunohistochemistry.</a> North American Journal of Medical Sciences. 2 (5), 241-245 (2010).</li><li>Zongli, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immunofluorescence+and+immunohistochemical+staining+with+anti-insulin+antibodies+on+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+pancreatic+tissue+microarray+sections.">Comparison of immunofluorescence and immunohistochemical staining with anti-insulin antibodies on formalin-fixed paraffin-embedded human pancreatic tissue microarray sections.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 10 (3), 3671-3676 (2017).</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+dissection+and+immunofluorescence+of+the+adult+mouse+cochlea.">Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).</li><li>Dun, X. P., Parkinson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunostaining+on+mouse+sciatic+nerves+to+visualize+events+of+peripheral+nerve+regeneration.">Whole mount immunostaining on mouse sciatic nerves to visualize events of peripheral nerve regeneration.</a> Methods in Molecular Biology. 1739, 339-348 (2018).</li><li>Akkiraju, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Improved+Immunostaining+and+Imaging+Methodology+to+Determine+Cell+and+Protein+Distributions+within+the+Bone+Environment.">An Improved Immunostaining and Imaging Methodology to Determine Cell and Protein Distributions within the Bone Environment.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 64 (3), 168-178 (2016).</li><li>Gonz&#225;lez-Ch&#225;vez, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+different+decalcifying+protocols+on+Osteopontin+and+Osteocalcin+immunostaining+in+whole+bone+specimens+of+arthritis+rat+model+by+confocal+immunofluorescence.">Assessment of different decalcifying protocols on Osteopontin and Osteocalcin immunostaining in whole bone specimens of arthritis rat model by confocal immunofluorescence.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 6 (10), 1972-1983 (2013).</li><li>Kapelsohn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Methods+for+Cutting,+Mounting,+and+Staining+Tissue+for+Neural+Histology.">Improved Methods for Cutting, Mounting, and Staining Tissue for Neural Histology.</a> Protocol Exchange. , (2015).</li><li>Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+embryonic+development+in+a+serum-free+whole+embryo+culture+system.">Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e50803 (2014).</li><li>Shi, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+techniques:+current+perspectives.">Antigen retrieval techniques: current perspectives.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 49 (8), 931-937 (2001).</li><li>Adell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+on+paraffin-embedded+planarian+tissue+sections.">Immunohistochemistry on paraffin-embedded planarian tissue sections.</a> Methods in Molecular Biology. 1774, 367-378 (2018).</li><li>Griffioen, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gelatin+embedding+to+preserve+lesion-damaged+hypothalami+and+intracerebroventricular+grafts+for+vibratome+slicing+and+immunocytochemistry.">Gelatin embedding to preserve lesion-damaged hypothalami and intracerebroventricular grafts for vibratome slicing and immunocytochemistry.</a> Journal of Neuroscience Methods. 43, 43-47 (1992).</li><li>Sarkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+demonstration+of+Fluoro-Turquoise+conjugated+gelatin+for+visualizing+brain+vasculature+and+endothelial+cells+and+their+characterization+in+normal+and+kainic+acid+exposed+animals.">In situ demonstration of Fluoro-Turquoise conjugated gelatin for visualizing brain vasculature and endothelial cells and their characterization in normal and kainic acid exposed animals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 219 (2), 276-284 (2013).</li><li>Oorschot, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+flat&#8208;embedding+method+to+prepare+ultrathin+cryosections+from+cultured+cells+in+their+in+situ+orientation.">A novel flat&#8208;embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 50, 1067-1080 (2002).</li></ol>

Qui forniamo un protocollo dettagliato per la preparazione della testa del topo e dei tessuti ossei non decalcoldatificati, e la criosezione per l'immunostaining della proliferazione cellulare, della morte cellulare e dei marcatori di segnalazione BMP. Inoltre, indettagliamo la strategia per ottenere dati quantitativi dalle immagini immunofluorescenti. Tali metodi possono essere applicabili anche ad altri tessuti con modifiche appropriate.
Le condizioni per la preparazione dei tessuti variano ...

Il viso è una parte fondamentale dell'identità umana ed è composto da diversi tipi di tessuti, come epitelio, muscoli, ossa, cartilagine, denti. Tali tessuti derivano da tutti e tre gli strati germinali: ectoderma, endoderma e mesoderma1,2. Per un corretto modello e lo sviluppo di tessuti craniofacciali, la proliferazione cellulare, la morte e la differenziazione devono essere altamente coordinati e regolati da percorsi di segnalazione specifici, come wnt, Fgf, Hh e Bmp percorsi3,4 ,5. Difetti nella proliferazione, nella sopravvivenza o nella differenziazione delle cellule porteranno a malformazioni craniofacciali, che sono tra i difetti congeniti di nascita congeniti più frequenti. I topi transgenici sono strumenti utili per studiare i meccanismi della morfogenesi craniofacciale e della patogenesi1,2,3,4,5. Comprendere i cambiamenti nelle strutture craniofacciali durante lo sviluppo e la patogenesi aiuterà a chiarire i principi chiave dello sviluppo e i meccanismi delle malformazioni craniofacciali1,2,3 ,4,5.
La colorazione di tessuti interi montati o sezionato con anticorpi specifici è una tecnica inestimabile per determinare la distribuzione spaziale delle proteine di interesse 6. Formalmente, l'immunostaining tissutale può basarsi sull'immunosofia (IHC) o sull'immunofluorescenza (IF). Rispetto al prodotto di reazione opaco generato con un substrato cromogenico come 3,3'-Diaminobenzidina (DAB) dall'IHC, IF comporta l'uso di coniugati fluorescenti visibili dalla microscopia a fluorescenza. Pertanto, IF può distinguere chiaramente le cellule positive dal rumore di fondo e consente alle immagini di essere analizzate quantitativamente e migliorate in modo semplice da software come ImageJ e Adobe Photoshop7,8. L'intero approccio di colorazione del supporto funziona su piccoli blocchi di tessuto (meno di 5 mm di spessore), che possono fornire informazioni tridimensionali sulla posizione di proteine / antigeni senza la necessità di ricostruzione dalle sezioni9,10 . Tuttavia, rispetto alle sezioni tissutali, l'immunostaining di montaggio completo richiede molto tempo e richiede grandi volumi di soluzioni anticorpali. Non tutti gli anticorpi sono compatibili con l'approccio di base di montaggio completo. Inoltre, la penetrazione incompleta degli anticorpi comporterà macchie irregolari o macchie false negative. Qui ci concentreremo sul rilevamento dell'immunofluorescenza di proteine/antigeni sui tessuti sezionato. Per i tessuti duri (ad esempio, testa, dente, osso lungo), la deposizione di calcio durante lo sviluppo/patogenesi rende il campione difficile da sezionere e facilmente sciacquato durante il trattamento immunostaining11,12. La maggior parte dei protocolli attualmente disponibili decalcificano i tessuti duri prima dell'incorporamento per rendere più facile la sezionamento, che richiede molto tempo e può distruggere morfologia e antigeni di campioni se gestiti in modo improprio11,12. Per superare i problemi, abbiamo ottimizzato un approccio per la criosezione dei tessuti duri senza decalcificazione, portando a una migliore visualizzazione della loro morfologia e distribuzione delle proteine di segnalazione.
Il protocollo qui descritto viene utilizzato per determinare i cambiamenti morfometrici e istologici nei tessuti craniofacciali dei topi transgenici BMP. In particolare, il protocollo comprende (1) la raccolta e la dissezione dei tessuti della testa, (2) la sezione e l'immunostaining dei marcatori sperimentali (Ki67, pSmad1/5/9) insieme alla colorazione TUNEL, (3) l'imaging delle sezioni utilizzando il microscopio a fluorescenza e infine (4) l'analisi e la quantificazione dei risultati. Il protocollo per preparare e criosezione tessuti duri senza decalcificazione è anche descritto13. Questi metodi sono ottimizzati per i tessuti craniofacciali. Sono applicabili anche ad altri tessuti di varie età di campioni con modifiche appropriate.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:752px;" width="752">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Adhesive tape</td>
			<td style="width:171px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">#39475214</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Coverslips</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Brand</td>
			<td style="width:119px;">12-545-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Cryostat</td>
			<td style="width:171px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">CM1850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">EDTA</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:171px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Gelatin</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">In Situ&#160;Cell Death Detection Kit</td>
			<td style="width:171px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">S7165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Brand</td>
			<td style="width:119px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">OCT Compound</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6148&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Polyethylene glycol&#160;tert-octylphenyl ether</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td style="width:167px;">Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM2542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Rabbit anti-Ki67 antibody</td>
			<td style="width:171px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:119px;">9129</td>
			<td>Lot#:3; RRID:AB_2687446</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Rabbit anti-pSmad1/5/9 antibody</td>
			<td style="width:171px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:119px;">13820</td>
			<td>Lot#:3; RRID:AB_2493181</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Sodium citrate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">1613859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Sucrose</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Tris</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue preparation and immunostaining of mouse craniofacial tissues and undecalcified bone

L'immunostaining dei tessuti fornisce un rilevamento altamente specifico e affidabile delle proteine di interesse all'interno di un determinato tessuto. Qui descriviamo un protocollo completo e semplice per rilevare l'espressione proteica durante la morfogenesi/patogenesi craniofacciale usando come esempi i tessuti craniofacciali dei topi. Il protocollo consiste nella preparazione e criosezione dei tessuti, nell'immunofluorescenza indiretta, nell'acquisizione di immagini e nella quantificazione. Inoltre, viene descritto un metodo per la preparazione e la criosezione dei tessuti duri non decalcolati per l'immunostaining, usando come esempi tessuti craniofacciali e ossa lunghe. Questi metodi sono fondamentali per determinare l'espressione proteica e i cambiamenti morfologici/anatomici in vari tessuti durante la morfogenesi craniofacciale/patogenesi. Sono applicabili anche ad altri tessuti con modifiche appropriate. La conoscenza dell'istologia e dell'alta qualità delle sezioni è fondamentale per trarre conclusioni scientifiche da risultati sperimentali. Le potenziali limitazioni di questa metodologia includono, ma non si limitano alla specificità degli anticorpi e alle difficoltà di quantificazione, che sono discusse anche qui.

Sezioni di tessuto craniofacciale embrionale Seguendo i passi precedenti, le teste sono state sezionate dal controllo (P0-Cre) o mutanti (Bmpr1a attivata in modo conto interno negli embrioni della cresta neurale, P0-Cre; caBmpr1a) embrionali al giorno embrionale (E) 16.5 o 18.5. Dopo il fissaggio nel 4% Di PFA per 4 h, i campioni sono stati incorporati nello Strumento di personalizzazione di Office e criosezione coronalmente. Le sezioni risultanti son...

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Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Preparazione dei tessuti e immunostaining dei tessuti craniofacciali del topo e dell'osso non decalcolato

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per rilevare e quantificare i livelli di proteine durante la morfogenesi/patogenesi craniofacciale immunostaining usando come esempi i tessuti craniofacciali dei topi. Inoltre, descriviamo un metodo per la preparazione e la criosezione dei tessuti duri non decalcolati dai giovani topi per l'immunostaining.

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Qui presentiamo il nostro semplice protocollo per il rilevamento dell'immunofluorescenza sulle proteine su materiali sesati. Questo metodo non richiede il recupero dell'antigene. Useremo teste di topo, compresi i tessuti duri non calcificati.Il principale vantaggio di questa tecnica è saltare il recupero dell'antigene e la decalcificazione dei tessuti duri. Questi portano a una buona qualità dei risultati di immunosottenzione. Questo metodo consente inoltre di risparmiare tempo e manodopera.Questo metodo è applicabile anche ad altri tessuti con opportune modifiche. Per creare belle sezioni da tessuti non calcificati, sezionare ulteriormente il tessuto bersaglio per tagliare ulteriormente i tessuti circostanti e, se necessario, trattare i campioni con 10%EDTA a quattro gradi Celsius per due giorni prima della crioprotezione. La dimostrazione visiva fornisce una spiegazione dettagliata e chiara della procedura di questo metodo.Per iniziare, preparare un piatto da 10 centimetri e diversi piatti da 3,5 centimetri contenenti PBS e un piatto di coltura da 12 po 'contenente due millilitri del 4% di PFA in PBS in ogni pozzo per ogni topo incinta e metterli tutti sul ghiaccio. Per sezionare embrioni da topi gravidi, afferrare la pelle sotto il centro del ventre di un topo eutanasiato con le forcep, tagliare solo la pelle e quindi tirare delicatamente la pelle per separarla dalla parete muscolare addominale sottostante. Seguendo la stessa linea dell'incisione cutanea, tagliare nella cavità addominale.Rimuovere l'utero contenente una stringa di embrioni. Quindi, rimuovere gli embrioni tagliando delicatamente la parete uterina, che rimuoverà i tessuti extraembrionici come il sacco vitellino e l'amnione. Tagliare e isolare la testa da ogni embrione, e con le forcep trasferire ogni testa in un pozzo separato di una piastra da 12 po 'contenente il 4%PFA.Incubare a quattro gradi Celsius per quattro ore da riparare. Risciacquare le teste in PBS a quattro gradi Celsius con tremori delicati per 12 ore. Per crioproteggere le teste, trasferirle utilizzando le forcep in una nuova piastra da 12 pompoli contenente due millilitri di saccarosio al 30% in PBS.Incubare con delicata agitazione a quattro gradi Celsius fino a quando le teste affondano sul fondo del piatto. Per incorporare le teste crioprotetti, trasferirle in uno stampo contenente composto ottimale per la temperatura di taglio ed equilibrare per diversi minuti. Utilizzando le forcep, regolate la posizione e la direzione dei campioni in modo che il lato rifilato dei campioni sia verso la parte inferiore dello stampo di incorporamento.Quindi, posizionare lo stampo sul ghiaccio secco per congelare e conservare in un sacchetto di plastica a meno 80 gradi Celsius fino a quando non è pronto per la criosezione. Per il tessuto postnatale, dopo aver rimosso la pelle e i tessuti adiposi di un topo eutanasiato di tre settimane o tre mesi, tagliare e isolare la testa e rimuovere la mattidibile. Quindi, fissare e crioproteggere la testa come fatto con le teste dell'embrione.Incorporare in gelatina all'8% in modo simile alle teste degli embrioni negli OCT e tenere i criomoldi in un sacchetto di plastica a meno 80 gradi Celsius fino alla criosezione. Impostare la temperatura del criostato appropriata. Posizionare i campioni nella camera criostatica per circa 30 minuti per equilibrare alla temperatura del criostato.Rimuovere il blocco con il campione dal Cryomold e montarlo con una goccia oct sul mandrino del campione e congelarlo, assicurandosi di mantenere il lato rifilato del campione più lontano dal mandrino e rivolto verso l'operatore. Caricare il mandrino montato su blocco sul supporto dell'oggetto cryostat. Regolare il supporto della lama in modo che l'angolo della lama sia da tre a cinque gradi rispetto al campione.Raccogliere sezioni di 10 micrometri su vetrini del microscopio rivestiti. Lasciare le sezioni a temperatura ambiente fino a completa asciugatura, quindi conservarle a meno 80 gradi Celsius. Per iniziare con la colorazione, eseguire le diapositive da meno 80 gradi Celsius e mantenerle a temperatura ambiente per un'ora per asciugare all'aria le sezioni.Risciacquare le diapositive nello 0,1%PBST tre volte per cinque minuti ciascuna per lavare lo Strumento di personalizzazione di Office e permeabilizzare le sezioni. Aggiungere 200 microlitri di soluzione di blocco a ogni diapositiva e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi, rimuovere la soluzione di blocco senza risciacquare la diapositiva.Aggiungere 100 microlitri di anticorpi primari diluiti in soluzione di blocco ad ogni diapositiva e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius. Risciacquare le diapositive con PBS tre volte per 10 minuti ciascuna a temperatura ambiente. Aggiungere 100 microlitri di anticorpi secondari diluiti in soluzione di blocco e incubare per un'ora a temperatura ambiente, protetti dalla luce.Risciacquare in PBS tre volte per 10 minuti ciascuno a temperatura ambiente, ancora protetto dalla luce. Per montare le diapositive, aggiungere due gocce di supporto anti dissolvenza con DAPI su ogni diapositiva, coprire con un coverslip e memorizzare a quattro gradi Celsius fino a quando non è pronto per l'immagine. Le ossa frontali degli embrioni di controllo erano positive per pSmad1/5/9, fattori di segnalazione BMP a valle, e Ki67, un marcatore di proliferazione cellulare.Negli embrioni mutanti BMPR1A specifici della cresta neurale, attivati in modo costitutivo, tuttavia, i livelli di pSmad1/5/9 sono stati aumentati mentre i livelli di Ki67 sono diminuiti. Inoltre, nelle ossa frontali degli embrioni mutanti sono state osservate più cellule apoptotiche di quelle degli embrioni di controllo. Le criosezioni coronali delle teste incorporate nella gelatina mostrano chiaramente il segnale GFP e il segnale RFP da una cassetta tdTomato nell'osso nasale e nei tessuti nasali, dimostrando che la gelatina non interferisce con i segnali fluorescenti.Quando queste sezioni sono state immunososteniate per SOX9 o Osterix ed E11/Podoplanina, sono state ottenute sezioni di buona qualità dalla maggior parte dei tessuti duri di tre settimane. D'altra parte, con campioni di tre mesi, sezioni di buona qualità sono state ottenute solo in alcuni dei tessuti duri, compresi i compartimenti trabecolari del femore, i tessuti nasali e il cranio, compresa la sutura nasale-premascella e le ossa circostanti della testa. Le cellule SOX9-positive sono state rilevate specificamente nei condrociti della piastra di crescita e dell'articolazione del femore e del setto nasale.Nell'incisivo di tre settimane fa, SOX9 è stato rilevato nelle cellule mesenchimali. I risultati della doppia colorazione di Osterix ed E11 mostrano che Osterix è stato rilevato negli osteoblasti, mentre L'E11 è stato rilevato negli osteociti delle ossa del femore e della testa. Nell'incisivo di tre settimane, Osterix era positivo negli odontoblasti, mentre l'E11 era positivo nelle cellule mesenchimali follicolari.Non sovrafissare i campioni con il 4%PFA. Per il sessificazione di tessuti duri non calcificati in gelatina, la temperatura migliore è inferiore a 25 gradi Celsius e inferiore. Seguendo questa procedura, i livelli di fluorescenza possono essere quantificati come descritto nel nostro protocollo.Tali misurazioni forniranno dati informativi per mostrare la differenza del livello relativo di proteine tra i diversi gruppi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada alla colorazione doppia o tripla per ottenere modelli di co-espressione di diverse proteine. Il 4% di PFA è pericoloso.Può causare allergie cutanee, gravi danni agli occhi, danni agli organi o cancro. Si prega di utilizzare dispositivi di protezione individuale e lavare accuratamente la pelle dopo la manipolazione.

Research

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