यह विधि गतिशील जैविक घटना जैसे अक्षुण्ण अरबीडोप्सिस पत्तियों में प्रतिरक्षा के दौरान ब्याज के जीन के स्थानिक विनियमन का जवाब देने में मदद कर सकती है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह हमें कुछ दिनों में मिट्टी उगाए गए अक्षुण्ण पौधे के पत्तों में प्रमोटर गतिविधि की स्थानिक गतिशीलता को पकड़ने की अनुमति देता है। इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए, ऑटोक्लेव मिट्टी के साथ एक प्लास्टिक-सेल प्लग ट्रे भरें।
प्रत्येक कोशिका में एक ट्रांसजेनिक अरबीडोप्सिस बीज बोएं। ट्रे को एक विकास कक्ष में स्थानांतरित करें जो 23 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाता है और दो से तीन सप्ताह तक लगातार सफेद प्रकाश की स्थिति में पौधों को उगाता है। रोगजनक टीका से दो दिन पहले, एनवाईजी माध्यम पर ग्लाइसरोल स्टॉक से एवरर्प्ट2 ले जाने वाले रोगजनक को लकीर दें जिसमें 100 मिलीग्राम प्रति लीटर और कानमाइसिन पर 50 मिलीग्राम प्रति लीटर पर रिफामपिकिन होता है।
48 घंटे तक 28 डिग्री सेल्सियस पर। प्लास्टिक युक्तियों का उपयोग करके, मध्यम की सतह पर दिखाई देने वाली बैक्टीरियल कोशिकाओं को फसल करें। बैक्टीरिया को 10 मिलीमोलर मैग्नीशियम क्लोराइड युक्त प्लास्टिक ट्यूब में स्थानांतरित करें और उन्हें फिर से खर्च करें।
फिर 600 नैनोमीटर पर समाधान के ऑप्टिकल घनत्व को मापें। जीवाणु कोशिकाओं की अंतिम एकाग्रता को 100 मिलियन कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों को प्रति मिलीलीटर समायोजित करें जो आम तौर पर 0.2 के OD600 से मेल खाती है। सबसे पहले, ध्यान से एक सेल प्लग में कटौती जिसमें दो से तीन सप्ताह पुराने पौधे होते हैं जो यह सुनिश्चित करते हैं कि पौधे को नुकसान न पहुंचे।
एक अच्छा संतुलन बनाए रखने के लिए एक खाली सेल प्लग ट्रे में सेल सेट करें। टीका लगाने के लिए एक दिख स्वस्थ पत्ती का चयन करें। यह देखते हुए कि आम तौर पर, पौधे के नीचे से तीसरे, चौथे और पांचवें पत्ते को संभालना आसान होता है।
लंबे समय तक चूक इमेजिंग के लिए टीका लगाने से पहले पौधे को पकड़े मिट्टी को पानी दें। वैकल्पिक रूप से, तनाव-उत्तरदायी प्रमोटरों का विश्लेषण करते समय वाईएफपी सिग्नल की अनुपस्थिति को सत्यापित करने के लिए रोगजनक टीका से पहले फ्लोरेसेंस स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत पत्तियों की जांच करते हैं। इसके बाद, घुसपैठ के दौरान रोगजनक के साथ सीधे संपर्क से बचने के लिए डिस्पोजेबल लेटेक्स दस्ताने पर डाल दिया।
एक मिलीलीटर सुई रहित प्लास्टिक सिरिंज का उपयोग करके, बैक्टीरियल निलंबन के साथ पत्ती के अक्षीय पक्ष को सावधानीपूर्वक घुसपैठ करें। पत्ती के आधे हिस्से पर एक छोटे से हिस्से का टीका PR1 प्रमोटर गतिविधि का एक अच्छा दृश्य सक्षम बनाता है। घुसपैठ की पत्ती पर घुसपैठ क्षेत्र के आसपास के क्षेत्र से किसी भी अतिरिक्त जीवाणु निलंबन को अवशोषित करने के लिए एक नरम कागज तौलिया का प्रयोग करें।
टीका लगाने के तुरंत बाद, प्लास्टिक ट्रे में ग्लास स्लाइड को ठीक करने के लिए सर्जिकल टेप का उपयोग करें ताकि घुसपैठ की पत्ती ग्लास स्लाइड के केंद्र में स्थित हो। सुनिश्चित करें कि टीका पत्ता ब्लेड पूरी तरह से कांच स्लाइड के भीतर फिट है। घुसपैठ की पत्ती के पेटियोल के साथ रिक्त स्थान को फिट करने के लिए डबल-स्तरित प्लास्टिक टेप का एक टुकड़ा दो टुकड़ों में काट लें, और प्रत्येक टुकड़े से एक कोने को काट लें।
ठीक चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करना, पेटील के दोनों ओर टेप के इन टुकड़ों को चिपकाएं ताकि प्रत्येक टुकड़े के कटे हुए कोनों को पत्ती ब्लेड के आधार के साथ संरेखित किया जा सके, जिससे यह सुनिश्चित हो सके कि टेप के टुकड़े पेटियोल या पत्ती ब्लेड को न छुएं। अगले पाठ प्रोटोकॉल के चित्र दो में उल्लिखित डबल स्तरित प्लास्टिक टेप का एक अतिरिक्त टुकड़ा तैयार करें। पेटियोल पर एक पुल बनाने के लिए पहले से पालन किए गए टुकड़ों के शीर्ष पर टेप के इस टुकड़े को चिपकाएं, टेप टुकड़ों के बीच सीधे पेटियोल या पत्ती ब्लेड को पकड़ने के लिए सावधान रहें।
फिर धीरे-धीरे पत्ती ब्लेड की नोक के ऊपर ग्लास स्लाइड पर सर्जिकल टेप का एक छोटा सा टुकड़ा चिपकाएं ताकि यह स्लाइड पर बहुत धीरे से तय हो जाए। केवल टेप के उस हिस्से पर मजबूती से दबाएं जो सीधे ग्लास स्लाइड को छू रहा है। धीरे-धीरे शल्य चिकित्सा टेप का एक और छोटा सा टुकड़ा पेटियोल और प्लास्टिक टेप टुकड़ों की सीमा पर रखें ताकि पेटियोल बहुत धीरे से दोनों ग्लास स्लाइड और प्लास्टिक टेप टुकड़ों पर तय हो जाए, जिससे केवल सर्जिकल टेप के उस हिस्से को मजबूती से संलग्न करना सुनिश्चित हो जो सीधे ग्लास स्लाइड या प्लास्टिक टेप के टुकड़ों को छू रहा है।
पड़ोसी पत्तियों को घुसपैठ के पत्ते से दूर रखने के लिए धीरे-धीरे मिट्टी में 200 माइक्रोलिटर पिपेट टिप्स डालें। सबसे पहले फ्लोरोसेंट स्टीरियोमाइक्रोस्कोप चालू करें। इमेजिंग के लिए स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के उद्देश्य लेंस के तहत अंतरिक्ष में संयंत्र सेट करें।
समय-चूक इमेजिंग के लिए पैरामीटर सेट करें। वाईएफपी सिग्नल की कल्पना करने के लिए पारंपरिक वाईएफपी फ़िल्टर का उपयोग करें। क्लोरोफिल ऑटोफ्लोरेसेंस की कल्पना करने के लिए टेक्सास रेड फ़िल्टर का उपयोग करें ताकि पीसीडी डोमेन वाईएफपी-पॉजिटिव सेल परतों से घिरे एक अंधेरे क्षेत्र के रूप में दिखाई दे।
अगले अतिरिक्त प्रकाश जोखिम चरणों के लिए पारंपरिक epi-उज्ज्वल क्षेत्र सेटअप का उपयोग करें, समय चूक इमेजिंग के अंतराल अवधि के दौरान प्रकाश जोखिम के लिए कार्यक्रम के कदम सुनिश्चित करने के रूप में प्रकाश संयंत्र प्रतिरक्षा पर एक बड़ा प्रभाव पड़ता है । समय चूक इमेजिंग कार्यक्रम चलाते हैं। कई दिनों में दीर्घकालिक अवलोकन के लिए, पौधे को उचित रूप से पानी देने पर विचार करें।
छवि अधिग्रहण के बाद, डेटा सेट से अंतराल में प्रकाश जोखिम के लिए उपयोग किए जाने वाले अतिरिक्त चैनलों को छोड़ें। छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, विभिन्न तरीकों के साथ डेटा का विश्लेषण करें, जैसे कि क्षेत्र-ब्याज विश्लेषण। इस अध्ययन में, इंट्राविटल समय-चूक इमेजिंग के लिए अरबीडोप्सिस पत्तियों के बढ़ते के लिए एक बहुमुखी विधि का प्रदर्शन किया जाता है।
avrRpt2 प्रेरित ईटीआई का उपयोग करके समय-चूक छवि डेटा का एक प्रतिनिधि उदाहरण छवियों की एक श्रृंखला और एक समय-चूक फिल्म के रूप में प्राप्त किया जाता है। avrRpt2 प्रेरित ईटीआई के दौरान pPR1-YPF-NLS का उपयोग कर सफल प्रयोगों में, PR1 प्रमोटर के क्षणिक सक्रियण मनाया जाता है, जैसा कि वाईएफपी से स्पष्ट है कि पीसीडी डोमेन के आसपास की कोशिकाओं की कई परतें व्यक्त की गई हैं। पीसीडी डोमेन के आसपास की कोशिकाओं में PR1 प्रमोटर की सक्रियता आमतौर पर टीका लगभग पांच घंटे बाद शुरू होती है, टीका लगभग 12 घंटे बाद चोटियों और टीका के बाद 40 घंटे तक रहता है।
इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, पाठ में वर्णित समय-चूक की स्थिति को सावधानीपूर्वक स्थापित करने की आवश्यकता होती है। इस प्रक्रिया के बाद, प्रमोटर गतिविधि का विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके मात्रात्मक और गुणात्मक रूप से किया जा सकता है। ये विश्लेषण हमें अरबीडोप्सिस पौधों की जीवित पत्तियों में होने वाली किसी भी जैविक घटना में जीन अभिव्यक्ति की स्थानिक गतिशीलता का पता लगाने में मदद करते हैं।
