Denne metoden kan bidra til å svare på spatiotemporal regulering av et gen av interesse under dynamisk biologisk hendelse som immunitet i intakte arabidopsis blader. Den største fordelen med denne teknikken er at den tillater oss å fange den spatiotemporale dynamikken i promotoraktiviteten i jorddyrket intakte planteblader over få dager. For å begynne denne prosedyren, fyll en plastcellepluggbrett med autoklavet jord.
Så en transgen arabidopsis frø inn i hver celle. Overfør brettet til et vekstrom som vedlikeholdes ved 23 grader celsius og dyrke plantene under kontinuerlige hvite lysforhold i to til tre uker. To dager før patogeninokulasjon, strek patogenet bærer avrRpt2 fra en glyserol lager på NYG medium som inneholder rifampicin på 100 milligram per liter og kanamycin på 50 milligram per liter.
Inkuber ved 28 grader Celsius i 48 timer. Ved hjelp av plastspisser høster du bakteriecellene som vises på overflaten av mediet. Overfør bakteriene til et plastrør som inneholder 10 milliMolar magnesiumklorid og resuspend dem.
Mål deretter den optiske tettheten av løsningen ved 600 nanometer. Juster den endelige konsentrasjonen av bakterielle celler til 100 millioner kolonidanneenheter per milliliter som normalt tilsvarer en OD600 på 0,2. Først må du forsiktig kutte ut en celleplugg som inneholder en to til tre uker gammel plante, og pass på at du ikke skader anlegget.
Angi cellen i en tom cellepluggskuff for å opprettholde en god balanse. Velg et synlig sunt blad for inokulasjon. Å legge til at generelt er den tredje, fjerde og femte blader fra bunnen av planten lett å håndtere.
Vann jorda som holder planten før inokulasjon for langsiktig tidsforløp. Eventuelt, når du analyserer stressresponsive promotorer, undersøker bladene under et fluorescensstereomicroscope før patogen inokulasjon for å verifisere fraværet av YFP-signal. Deretter tar du på engangs latexhansker for å unngå direkte kontakt med patogenet under infiltrasjon.
Bruk en en milliliter nålløs plastsprøyte, infiltrer forsiktig den abaksiale siden av bladet med bakteriell suspensjon. Inokulasjon av en liten del på den ene halvdelen av bladet muliggjør en god visualisering av PR1-promoteraktiviteten. Bruk et mykt papirhåndkle til å absorbere overflødig bakteriell suspensjon fra området rundt det infiltrerte området på det infiltrerte bladet.
Umiddelbart etter inokulasjon, bruk kirurgisk tape for å fikse et glasssklie til plastbrettet slik at det infiltrerte bladet ligger i midten av glasslysbildet. Kontroller at det vaksinerte bladbladet er fullstendig montert i glasssklien. Skjær et stykke tolags plasttape i to stykker for å passe plassene langs petiolet til det infiltrerte bladet, og kutt et hjørne av hvert stykke.
Bruk et par fine pinsett, fest disse tapebitene på hver side av petiole slik at de kuttede hjørnene på hvert stykke samsvarer med bunnen av bladbladet, og pass på at tapebitene ikke berører petiole eller bladbladet. Deretter forbereder du et ekstra stykke tolags plasttape som beskrevet i figur to av tekstprotokollen. Hold dette stykke tape på toppen av de tidligere tilholdde bitene for å danne en bro over petiole, vær forsiktig med å ikke fange petiole eller bladbladet direkte mellom tapebitene.
Deretter stikker du forsiktig et lite stykke kirurgisk tape på glasset lysbildet over spissen av bladbladet slik at den festes veldig mykt på lysbildet. Trykk ned godt på den delen av båndet som berører glasslysbildet direkte. Legg forsiktig et annet lite stykke kirurgisk tape på grensen til petiole og plasttape stykker slik at petiole er veldig mykt festet på både glass lysbilde og plast tape stykker, sørg for å bare fast feste den delen av kirurgisk tape som er direkte berøre glass lysbilde eller plast tape stykker.
Sett 200 mikroliterpipettespisser forsiktig inn i jorden for å holde nabobladene forsiktig vekk fra det infiltrerte bladet. Slå først på det fluorescerende stereomikroskopet. Sett anlegget i rommet under objektivobjektiven til stereomikroskopet for avbildning.
Definer parameterne for bildebehandling av tidsforløp. Bruk det konvensjonelle YFP-filteret til å visualisere YFP-signalet. Bruk Texas Red-filteret til å visualisere klorofyll autofluorescence slik at PCD-domenet er synlig som et mørkt område omgitt av YFP-positive cellelag.
Deretter bruker du det konvensjonelle epi-lyse feltoppsettet for ytterligere lyseksponeringstrinn, og sørg for å programmere trinn for lyseksponering i intervallperioden for tidsforløpsbilde, da lys har stor innvirkning på planteimmuniteten. Kjør bildeprogrammet for tidsforløp. For langsiktig observasjon over flere dager, bør du vurdere å vanne anlegget på riktig måte.
Etter bildeinnhenting utelater du ekstra kanaler som brukes til lyseksponering i intervallene fra datasettet. Bruk bildeanalyseprogramvare til å analysere dataene med ulike metoder, for eksempel interesseområdeanalyse. I denne studien er en allsidig metode demonstrert for montering av arabidopsis blader for intravital time-lapse imaging.
Et representativt eksempel på tidsforløp av bildedata ved hjelp av avrRpt2 indusert ETI oppnås som både en serie bilder og som en time-lapse film. I vellykkede eksperimenter ved hjelp av pPR1-YPF-NLS under avrRpt2 indusert ETI, observeres forbigående aktivering av PR1-promotoren, som tydelig fra YFP som uttrykker foci og flere lag med celler rundt PCD-domenet. Aktiveringen av PR1-promotoren i celler rundt PCD-domenet starter vanligvis omtrent fem timer etter inokulasjon, topper på ca 12 timer etter inokulasjon og varer opptil 40 timer etter inokulasjon.
Når du prøver denne prosedyren, må tidsforløpsforholdene etableres nøye som beskrevet i teksten. Etter denne prosedyren kan promoteraktiviteten analyseres kvantitativt og kvalitativt ved hjelp av analyseprogramvare. Disse analysene hjelper oss med å utforske den spatiotemporale dynamikken i genuttrykk i enhver biologisk hendelse som forekommer i levende blader av arabidopsisplanter.