En høj overførselshastighed analyse til at vurdere og kvantificere neutrofile ekstracellulære fælde dannelse

Vi udviklede en høj-throughput assay at måle neutrofil ekstracellulære fælder, eller NETs. NETs er immunogene DNA-strukturer, der er eksponeret af neutrofiler. NETs kan fælde og dræbe mikroorganismer og er derfor en vigtig anti-infektiøs mekanisme, men de spiller også en patogen rolle i autoimmune sygdomme.

Med denne teknik kvantificeres NET'er ved hjælp af tredimensionel immunofluorescenskonfokal mikroskopi, hvilket resulterer i en meget følsom og høj gennemløbsmetode til undersøgelse af NET-dannelse og nedbrydning. Denne teknik gør det muligt for os at kvantificere NET dannelse af patienter med autoimmune sygdomme. Ex vivo NET-dannelse af patienter med ANCA-associeret vaskulitis eller systemisk lupus erythematosis kunne overvåges med denne analyse.

Desuden kan potentielle terapeutiske mål rettet mod NET-formation testes med denne analyse in vitro. Neutrofil isolation kunne være en kamp for folk, der aldrig har udført denne teknik før. For at begynde denne procedure, få 20 milliliter perifert blod fra en sund donor i to 10-milliliter EDTA-kodede rør.

10 milliliter blod overføres i et sterilt 50-milliliterrør og PBS til et endeligt samlet volumen på 32,5 milliliter. Brug en 10-milliliter pipette og pipette controller, tage op 14 milliliter af densitet gradient. Sæt pipetten på bunden af 50-milliliterrøret.

Tag derefter pipetteregulatoren af pipetten, så tætheden gradienten kan flyde ud af tyngdekraften, indtil det maksimale er nået af kapillær effekt. Placer en tommelfinger oven på pipetten for at forhindre, at den resterende tæthedsgradient lækker ud, og fjern derefter pipetten fra røret. Centrifuge røret ved 912 gange g ved stuetemperatur i 20 minutter uden acceleration eller bremse.

Fjern forsigtigt den hvide ring, der indeholder de perifere blodmonnuclear celler først, fulgte PBS-fortyndet plasma. Endelig fjerne tætheden gradient lag så meget som muligt. Dernæst hentes en flaske koldt sterilt destilleret vand og en kolbe med 10x koncentreret PBS fra et køleskab.

Arbejde hurtigt, tilsæt 36 milliliter af vandet direkte på toppen af pellet og omhyggeligt blandes én gang. Efter 20 sekunder tælles fra starten, tilsæt fire milliliter 10x PBS for at lave en isotonisk opløsning. Og igen, bland en gang omhyggeligt.

Centrifuge røret ved 739 gange g og ved fire grader Celsius i fem minutter. Kassér supernatanten, og sørg for at være yderst forsigtig, da pellet ikke er fast, og gentag hurtigt processen med at tilsætte det kolde sterile destilleret vand og koncentreret PBS som tidligere beskrevet. Centrifuge ved 328 gange g og fire grader Celsius i fem minutter.

Fjern forsigtigt supernatanten, og pellets skal igen i fem milliliter PBS. Tæl neutrofilerne og hold dem på is. Først foretages en neutrofil suspension indeholdende ca. 10 til 20 millioner neutrofiler i to milliliter PBS i et 15-milliliterrør.

I et andet 15-milliliterrør blandes to milliliter PBS med fire mikroliter af to mikromolarrød lysstofrør. Tilsæt forsigtigt den røde fluorescerende cellelinkeropløsning til neutrofilaffjedringen og bland forsigtigt. Wrap røret i aluminiumsfolie for at beskytte blandingen mod lys, og inkubere i præcis 25 minutter ved 37 grader Celsius at mærke neutrofiler med den røde fluorescerende celle linker.

Mærkningenaktiveres ved at tilsætte RPMI 1640-medium, der indeholder 10 % varmeaktiveret FCS ved stuetemperatur, til et endeligt volumen på 15 milliliter og blandes forsigtigt. Hvis der efter dette en pellet har dannet, omhyggeligt re-suspendere blandingen. Centrifuge røret ved 328 gange g ved stuetemperatur i fem minutter.

Før du fjerner supernatant, sikre, at en pellet har dannet. Derefter skal pelleten igen suspenderes i fem milliliter rødfrit RPMI 1640-medium, der indeholder 2%FCS ved stuetemperatur. Så tæl neutrofilerne.

Lav en celle suspension på en massevis af 420, 000 celler pr milliliter i phenol rød-fri RPMI 1640 medium, der indeholder 2% FCS. Tilføj 37, 500 neutrofiler i 90 mikroliter til hver brønd af en sort 96-godt, flad bund plade. Dernæst tilsættes 10 mikroliter af den valgte stimulus i tre eksemplarer for at nå en koncentration på 10% i hver brønd.

Medtag altid en negativ kontrol i tre eksemplarer. Inkubere i mørke ved 37 grader Celsius for den ønskede tid, der spænder fra 30 minutter til to, fire eller seks timer. Derefter forberede mængden af uigennemtrængelig DNA farvestof er nødvendig for at tilføje 25 mikroliter af fem-mikromolar uigennemtrængelig DNA farvestof for at nå en endelig koncentration af en mikromolar i hver brønd.

15 minutter før slutningen af inkubationstiden tilsættes 25 mikroliter af fem mikromolære uigennemtrængelige DNA-farvestof til hver brønd. Fortsæt inkubationen i de sidste 15 minutter ved 37 grader Celsius i mørke. Efter dette, fjerne supernatant meget omhyggeligt og opbevares, hvis det er nødvendigt.

Tilsæt 100 mikroliter af 4% paraformaldehyd. Hold pladen i mørke, og gå straks videre til næste afsnit. Når du har konfigureret indstillingerne, skal du vælge Z-serien.

Vælg 10 som antal trin. Vælg tre mikrometer som trinstørrelse. Læg pladen i det immunfluorescenskonfokale mikroskop.

Klik på fanen Kør. Udfyld pladenavnet og beskrivelsen, og vælg lagerplaceringen. Vælg de brønde, der skal erhverves.

Vælg eksponeringstiden for Texas Red og FITC. Klik derefter på Hent plade og start anskaffelsen, som vil tage cirka en time pr. plade. Derefter skal du vælge Analysemakro.

Vælg derefter w1, og vælg tærskelværdien. Vælg derefter den ønskede pixelværdi. Og endelig, i et andet Billede J vindue, skal du vælge w2, og vælg tærskelværdien med den ønskede pixel værdi.

Vælg en destination til regnearksfilen, kør analysen, og gem logfilen bagefter. Præsenteret her er en meget følsom bredt anvendelig assay for semi-automatiseret kvantificering af neutrofil ekstracellulære fælde dannelse til evaluering af ex vivo induktion af neutrofil ekstracellulære fælder på forskellige stimuli. NET-formation kvantificeres på en tredimensionel måde ved at kvantificere farves ekstracellulære DNA over 10 Z-stakke med tre mikrometerafstand, der starter ved brændplanet i hver brønd.

Ved at måle det kumulative område øges analysens følsomhed. Det samlede areal af afbildede neutrofiler kvantificeres kun i brændplanet i hver brønd, som korrelerer betydeligt med det samlede neutrofiltal i hver brønd med en Pearson-korrelationskoefficient på 0,99. Det repræsentative resultat af kvantificeringen af NET-formationen i neutrofiler udtrykkes som kumulativt ekstracellulært DNA-område over 10 Z-stacks pr. afbildet neutrofil.

Der tages derefter snapshots af nettotvantificeringsanalysen. Repræsentative billeder af ustimulerede neutrofiler og af NETs i AAV-stimulerede neutrofiler vises her med fluorescerende-mærkede neutrofiler i rødt og det farvede ekstracellulære DNA i grøn. Neutrofiler skal håndteres med forsigtighed, og PKH-mærkningen skal udføres nøjagtigt i henhold til protokollen.

Denne analyse kan bruges til at studere morfologi, kinetik, og sammensætningen af NETs. Denne teknik er en anden metode, der giver mulighed for at studere NETs i sundhed og sygdom. Trypan blue, PKH og PFA skal håndteres med handsker og må ikke indåndes direkte.