好中球細胞外トラップ(NET)を測定するためのハイスループットアッセイを開発しました。NETは、好中球によって暴露される免疫原性DNA構造である。NETは微生物を捕捉して殺すことができるため、重要な抗感染メカニズムですが、自己免疫疾患においても病原性の役割を果たしています。
この技術により、NETsは3次元免疫蛍光共焦点顕微鏡で定量化され、高感度で高スループットの方法でNETの形成と分解を研究します。この技術により、自己免疫疾患患者のNET形成を定量化することができます。ANCA関連血管炎または全身性エリフェマトーシスを有する患者のex vivo NET形成は、このアッセイで監視することができた。
さらに、NET形成を標的とする潜在的な治療薬は、このアッセイin vitroで試験することができる。好中球の孤立は、これまでにこの技術を行ったことがない人々のための闘争である可能性があります。この手順を開始するには、2つの10ミリリットルEDTAコードチューブで健康なドナーから末梢血20ミリリットルを得る。
無菌50ミリリットルチューブとPBS中の血液10ミリリットルを最終的な総容量32.5ミリリットルに移す。10ミリリットルのピペットとピペットコントローラを使用して、14ミリリットルの密度勾配を取ります。ピペットを50ミリリットルチューブの底に置きます。
次に、ピペットコントローラをピペットから取り出し、キャピラリー効果によって最大に達するまで重力によって密度勾配が流出することを可能にする。ピペットの上に親指を置いて、残りの密度勾配が漏れないようにし、チューブからピペットを取り除きます。加速度やブレーキなしで20分間室温で912回gのチューブを遠心分離します。
末梢血単核細胞を含む白い環を最初に慎重に取り出し、PBS希釈血漿に続いた。最後に、密度勾配レイヤーをできるだけ削除します。次に、冷たい滅菌蒸留水のボトルと10倍の濃縮PBSのフラスコを冷蔵庫から取り出します。
迅速に作業, ペレットの上に直接水の36ミリリットルを追加し、慎重に一度混合.最初から20秒数えた後、10倍PBSの4ミリリットルを加えて等張溶液を作ります。そして再び、慎重に一度混ぜる。
チューブを739倍g、摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を捨てて、ペレットが固まっていないため、極めて注意を払い、前述のように冷たい滅菌蒸留水と濃縮PBSを添加する処理を速やかに繰り返す。328倍gで遠心分離機、5分間摂氏4度。
上清を慎重に取り除き、PBSの5ミリリットルでペレットを再懸濁します。好中球を数え、氷の上に保管してください。まず、15ミリリットルのチューブにPBSの2ミリリットルに約10〜2000万個の好中球を含む好中球懸濁液を作ります。
別の15ミリリットルのチューブで、2マイクロモル赤蛍光細胞リンカーの4マイクロリットルと2ミリリットルのPBSを混合します。赤蛍光セルリンカー溶液を好中球懸濁液にそっと加え、慎重に混ぜます。チューブをアルミニウム箔で包んで混合物を光から保護し、摂氏37度で正確に25分間インキュベートし、赤蛍光細胞リンカーで好中球にラベルを付けます。
室温で10%熱不活化FCSを含むRPMI 1640培地を最終体積15ミリリットルに添加してラベルを不活性化し、1回慎重に混合します。この後ペレットが形成された場合は、慎重に混合物を再中断します。室温で5分間328回gのチューブを遠心分離する。
上清を取り除く前に、ペレットが形成されていることを確認してください。この後、ペレットを室温で2%FCSを含む赤色フリーRPMI 1640培地の5ミリリットルで再懸濁した。次に、好中球を数えます。
2%FCSを含むフェノールレッドフリーRPMI 1640培地中で、1ミリリットル当たり420,000細胞の密度で細胞懸濁液を作る。黒い96ウェル、フラットボトムプレートの各ウェルに90マイクロリットルで37,500好中球を追加します。次に、選択した刺激の10マイクロリットルを3重に加えて、各ウェルに10%の濃度に達する。
常に三重に負のコントロールを含めます。30分から2、4、または6時間の範囲で、所望の時間のために摂氏37度で暗闇の中でインキュベート。次に、5マイクロモル不透過性DNA色素の25マイクロリットルを添加するために必要な不透過性DNA色素の体積を調製し、各ウェルに1マイクロモルの最終濃度に達する。
インキュベーション時間の終了の15分前に、各ウェルに5マイクロモル不透過性DNA染料25マイクロリットルを加える。暗闇の中で摂氏37度で最後の15分間インキュベーションを続けます。この後、上清を非常に慎重に取り出し、必要に応じて保管してください。
4%パラホルムアルデヒドの100マイクロリットルを加えます。プレートを暗闇の中に保管し、すぐに次のセクションに進みます。設定を構成したら、[Z シリーズ]を選択します。
ステップ数として 10 を選択します。ステップサイズとして3マイクロメートルを選択します。プレートを免疫蛍光共焦点顕微鏡に積み込みます。
[実行] タブをクリックします。プレートの名前と説明を入力し、保管場所を選択します。取得する必要がある井戸を選択します。
テキサスレッドとFITCの露出時間を選択します。その後、プレートを取得をクリックし、プレートあたり約1時間かかる取得を開始します。この後で、マクロの分析を選択します。
次に、w1 を選択し、しきい値を選択します。次に、目的のピクセル値を選択します。最後に、2 番目の Image J ウィンドウで、w2 を選択し、希望のピクセル値を持つしきい値を選択します。
スプレッドシート ファイルの保存先を選択し、分析を実行し、ログ ファイルを保存します。ここで提示される高感度の広く適用可能なアッセイは、異なる刺激で好中球外細胞トラップのex vivo誘導の評価のための好中球外細胞トラップ形成の半自動化定量のための分析です。NET形成は、各ウェルの焦点面から始まる3マイクロメートルの距離で、10個のZスタック上の染色された細胞外DNAを定量化することによって三次元的に定量化される。
累積面積を測定することにより、アッセイの感度が高くなる。画像化された染色好中球の全面積は、各ウェルの焦点面でのみ定量化され、ピアソン相関係数0.99の各ウェルの全好中球数と有意に相関する。好中球におけるNET形成の定量の代表的な結果は、画像中性好中球あたり10個のZスタックにわたる累積染色された細胞外DNA領域として表される。
その後、正味定量アッセイのスナップショットが撮影されます。AAV刺激好中球中球中の非刺激性好中球およびNETの代表的な画像は、緑色の蛍光標識好中球と染色された細胞外DNAでここに示されている。好中球は注意して処理されるべきであり、PKHの標識はプロトコルに従って正確に行われるべきである。
このアッセイは、NETの形態、運動学、および組成を研究するために使用することができます。この技術は、健康と病気におけるNETを研究する可能性を提供するもう一つの方法です。トリパンブルー、PKH、PFAは手袋で取り扱い、直接呼吸しないでください。
