우리는 호중구 세포 외 함정, 또는 NETs를 측정하기 위하여 높은 처리량 분석기를 개발했습니다. NET는 호중구에 의해 드러나는 면역원성 DNA 구조물입니다. NETs는 미생물을 함정에 빠뜨리고 죽일 수 있으며 따라서 중요한 항전염성 메커니즘이지만 자가 면역 질환에서 병원성 역할을합니다.
이 기술을 통해 NET는 3차원 면역 형광 공초점 현미경 검사법에 의해 정량화되어 NET 형성 및 저하를 연구하는 매우 민감하고 높은 처리량 방법을 생성합니다. 이 기술은 우리가 자기 면역 질병을 가진 환자의 NET 대형을 정량화할 수 있게 합니다. ANCA 관련 혈관염 또는 전신 루푸스 홍반성 환자를 위한 Ex vivo NET 형성은 이 분석으로 모니터링될 수 있었다.
또한 NET 형성을 대상으로 하는 잠재적인 치료법은 시험관내에서 이 분석으로 테스트될 수 있습니다. 호중구 고립은 전에이 기술을 수행 한 적이없는 사람들을위한 투쟁이 될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 두 개의 10 밀리리터 EDTA 코딩 튜브에서 건강한 기증자로부터 말초 혈액의 20 밀리리터를 얻을.
멸균 50 밀리리터 튜브와 PBS에 10 밀리리터의 혈액을 최종 총 32.5 밀리리터로 옮기. 10밀리리터 파이펫과 파이펫 컨트롤러를 사용하여 밀도 그라데이션의 14 밀리리터를 차지합니다. 파이펫을 50밀리리터 튜브 바닥에 놓습니다.
그런 다음 파이펫 컨트롤러를 피펫에서 꺼내 모세관 효과에 의해 최대값에 도달할 때까지 밀도 그라데이션이 중력에 의해 흐르도록 합니다. 피펫 위에 엄지 손가락을 놓아 남은 밀도 그라데이션이 누출되는 것을 방지한 다음 튜브에서 파이펫을 제거합니다. 가속이나 브레이크없이 20 분 동안 실온에서 912 배 g에서 튜브를 원심 분리합니다.
말초 혈액 단핵 세포를 포함하는 백색 고리를 주의 깊게 제거하고 PBS 희석 플라즈마를 따랐다. 마지막으로 밀도 그라데이션 레이어를 가능한 한 많이 제거합니다. 다음으로, 냉장고에서 차가운 멸균 증류수 한 병과 10배 농축 PBS플라스크를 냉장고에서 회수합니다.
빠르게 작업하면 펠릿 위에 직접 36 밀리리터의 물을 넣고 한 번 조심스럽게 섞습니다. 시작부터 계산된 20초 후에는 10x PBS의 4밀리리터를 추가하여 동소식 솔루션을 만듭니다. 그리고 다시, 신중하게 한 번 혼합.
튜브를 739배, 섭씨 4도에서 5분간 원심분리합니다. 상체를 버리고 펠릿이 고체되지 않기 때문에 매우 조심해야하며, 이전에 설명한 것처럼 차가운 멸균 증류수와 농축 된 PBS를 추가하는 과정을 신속하게 반복하십시오. 원심분리기는 328배, 섭씨 4도에서 5분간.
신중하게 상체를 제거하고 PBS의 다섯 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단. 호중구를 계산하고 얼음에 보관하십시오. 먼저, 15밀리리터 튜브에서 PBS 의 2밀리리터에서 약 10~2천만 마리의 호중구를 함유한 호중구 현탁액을 만듭니다.
다른 15 밀리리터 튜브에서 2 개의 밀리리터 PBS와 2 마이크로 몰라 적색 형광 세포 링커의 4 개의 마이크로 리터를 혼합하십시오. 적색 형광 세포 링커 용액을 호중구 서스펜션에 부드럽게 추가하고 조심스럽게 섞습니다. 알루미늄 호일에 튜브를 감싸서 빛으로부터 혼합물을 보호하고, 37도에서 정확히 25분 동안 배양하여 적색 형광 세포 링커로 호중구에 라벨을 부착합니다.
실온에서 10%의 열 비활성화 FCS를 함유한 RPMI 1640 배지를 15밀리리터의 최종 부피에 첨가하여 라벨을 비활성화하고 한 번 신중하게 혼합합니다. 이 후에 펠릿이 형성된 후에, 조심스럽게 혼합물을 다시 중단합니다. 5 분 동안 실온에서 328 배 g에서 튜브를 원심 분리합니다.
상체를 제거하기 전에 펠릿이 형성되었는지 확인하십시오. 그 후, 실온에서 2%의 FCS를 함유한 무적RPMI 1640 배지 의 5밀리리터에서 펠릿을 다시 중단한다. 그런 다음 호중구를 계산합니다.
페놀 무적RPMI 1640 배지에서 밀리리터당 420, 000 세포의 밀도로 세포 현탁액을 2%FCS를 함유한다. 블랙 96웰, 플랫 하단 플레이트의 각 웰에 90 마이크로 리터에 37, 500 호중구를 추가합니다. 다음으로, 각 우물에서 10%의 농도에 도달하기 위해 삼중판에 선택한 자극의 10 마이크로리터를 추가합니다.
항상 삼중리에 음수 제어를 포함합니다. 30분에서 2시간, 4시간 또는 6시간 동안 원하는 시간 동안 37도의 어둠 속에서 배양합니다. 그런 다음, 5마이크로몰라 불투과성 DNA 염료의 25 마이크로리터를 첨가하여 각 웰에 하나의 마이크로몰라의 최종 농도에 도달하는 데 필요한 불투과성 DNA 염료의 부피를 준비한다.
인큐베이션 시간이 끝나기 15분 전에 각 웰에 5마이크로몰라 불투과성 DNA 염료 25마이크로리터를 추가합니다. 어둠 속에서 섭씨 37도에서 마지막 15 분 동안 인큐베이션을 계속하십시오. 이 후, 매우 신중하게 상체를 제거하고 필요한 경우 저장합니다.
4%의 파라포름알데히드의 마이크로리터 100기를 추가합니다. 접시를 어둠 속에서 유지하고 즉시 다음 섹션으로 진행합니다. 설정을 구성한 후 Z 시리즈를 선택합니다.
10을 단계 수로 선택합니다. 단계 크기로 3 마이크로미터를 선택합니다. 면역 형광 공초점 현미경에 플레이트를 로드합니다.
실행 탭을 클릭합니다. 플레이트 이름과 설명을 입력하고 저장 위치를 선택합니다. 획득해야 하는 우물을 선택합니다.
텍사스 레드 및 FITC의 노출 시간을 선택합니다. 그런 다음 획득 판을 클릭하고 획득을 시작하면 플레이트당 약 1 시간이 소요됩니다. 이 후 분석 매크로를 선택합니다.
그런 다음 w1을 선택하고 임계값을 선택합니다. 다음으로 원하는 픽셀 값을 선택합니다. 그리고 마지막으로 두 번째 이미지 J 창에서 w2를 선택하고 원하는 픽셀 값으로 임계값을 선택합니다.
스프레드시트 파일에 대한 대상을 선택하고 분석을 실행하고 나중에 로그 파일을 저장합니다. 여기에 제시된 고도로 민감한 광범위하게 적용 가능한 분석법으로, 다른 자극에 대한 호중구 세포 외 트랩의 전 생체 유도 평가를 위한 호중구 세포 외 트랩 형성의 반자동 정량화를 위한 것이다. NET 형성은 각 우물의 초점 평면에서 시작되는 3마이크로미터 거리로 10Z 스택을 통해 스테인드 외세포 DNA를 정량화하여 3차원 방식으로 정량화된다.
누적 면적을 측정하면 분석의 감도가 증가합니다. 이미지된 스테인드 호중구의 총 면적은 각 우물의 초점 평면에서만 정량화되어 있으며, 이는 Pearson 상관계수0.99로 각각의 총 호중구 수와 크게 상관관계가 있다. 호중구에서 NET 형성의 대표적인 결과는 심상 호중구당 10Z 스택을 통해 누적 염색된 세포외 DNA 영역으로 표현된다.
그런 다음 스냅샷은 순 정량화 분석기에서 가져옵니다. AAV 자극호중구에서 자극되지 않은 호중구와 NETs의 대표적인 이미지는 적색의 형광 표지 호중구와 녹색의 염색된 세포외 DNA로 여기에 표시됩니다. 호중구는 주의하여 처리되어야 하며, PKH 라벨링은 프로토콜에 따라 정확하게 수행되어야 합니다.
이 분석체는 NET의 형태학, 운동 학 및 구성을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 건강과 질병에 있는 NET를 공부하는 가능성을 제공하는 또 다른 방법입니다. 트라이판 블루, PKH 및 PFA는 장갑으로 처리해야하며 직접 호흡해서는 안됩니다.
