En høy gjennomstrømming analysen vurdere og kvantifisere nøytrofile ekstracellulære felle formasjon

Vi utviklet en høy gjennomstrømningsanalyse for å måle nøytrofile ekstracellulære feller, eller NETs. NETs er immunogene DNA-strukturer som eksponeres av nøytrofiler. NETs kan fange og drepe mikroorganismer og er derfor en viktig anti-smittsom mekanisme, men de spiller også en patogen rolle i autoimmune sykdommer.

Med denne teknikken kvantifiseres NETs av tredimensjonal immunofluorescence confocal mikroskopi som resulterer i en svært følsom og høy gjennomstrømningsmetode for å studere NET-dannelse og nedbrytning. Denne teknikken gjør det mulig for oss å kvantifisere NET-dannelse av pasienter med autoimmune sykdommer. Ex vivo NET dannelse av pasienter med ANCA-assosiert vaskulitt eller systemisk lupus erythematose kan overvåkes med denne analysen.

I tillegg kan potensielle terapeutiske midler rettet mot NET-formasjon testes med denne analysen in vitro. Nøytrofil isolasjon kan være en kamp for folk som aldri har utført denne teknikken før. For å begynne denne prosedyren, få 20 milliliter perifert blod fra en sunn donor i to 10-milliliter EDTA-kodede rør.

Overfør 10 milliliter blod i et sterilt 50-milliliter rør og PBS til et endelig totalt volum 32,5 milliliter. Bruk en 10-milliliter pipette og pipettekontroller, ta opp 14 milliliter tetthetsgradient. Plasser pipetten på bunnen av 50-milliliter røret.

Deretter tar du pipettekontrolleren av pipetten, slik at tetthetsgradienten kan strømme ut av tyngdekraften til maksimumet nås med kapillæreffekt. Plasser en tommel oppå pipetten for å hindre at den gjenværende tetthetsgradienten lekker ut, og fjern deretter pipetten fra røret. Sentrifuger røret ved 912 ganger g ved romtemperatur i 20 minutter uten akselerasjon eller brems.

Fjern forsiktig den hvite ringen som inneholder de perifere blodmononukleære cellene først, etterfulgte PBS-fortynnet plasma. Til slutt fjerner du tetthetsgradientlaget så mye som mulig. Deretter henter du en flaske kaldt sterilt destillert vann og en flaske 10x konsentrert PBS fra kjøleskap.

Arbeid raskt, tilsett 36 milliliter vann direkte oppå pelleten og bland forsiktig en gang. Etter 20 sekunder talt fra starten, legg til fire milliliter 10x PBS for å lage en eotonisk løsning. Og igjen, bland en gang nøye.

Sentrifuger røret på 739 ganger g og ved fire grader Celsius i fem minutter. Kast det overnaturlige, sørg for å være ekstremt forsiktig da pelleten ikke er fast, og gjenta raskt prosessen med å tilsette det kalde sterile destillerte vannet og konsentrert PBS som tidligere beskrevet. Sentrifuge på 328 ganger g og fire grader Celsius i fem minutter.

Fjern forsiktig supernatanten og suspender pelleten forsiktig i fem milliliter PBS. Tell nøytrofile og hold dem på is. Først, lage en nøytrofil suspensjon som inneholder ca 10 til 20 millioner nøytrofiler i to milliliter PBS i en 15-milliliter rør.

I et annet 15-milliliter rør blander du to milliliter PBS med fire mikroliter to mikrorør med to mikromolar rød fluorescerende cellekobling. Tilsett forsiktig den røde fluorescerende cellekoblingsløsningen til nøytrofilopphengen og bland forsiktig. Pakk røret i aluminiumsfolie for å beskytte blandingen mot lys, og inkuber i nøyaktig 25 minutter ved 37 grader Celsius for å merke nøytrofile med den røde fluorescerende cellekoblingen.

Inaktiver merkingen ved å legge til RPMI 1640 medium som inneholder 10% varme inaktivert FCS ved romtemperatur til et endelig volum på 15 milliliter og bland en gang forsiktig. Hvis en pellet etter dette har dannet seg, må du forsiktig suspendere blandingen. Sentrifuger røret ved 328 ganger g ved romtemperatur i fem minutter.

Før du fjerner supernatant, sørg for at en pellet har dannet seg. Etter dette, re-suspendere pellet i fem milliliter av rødfri RPMI 1640 medium som inneholder 2% FCS ved romtemperatur. Deretter teller nøytrofiler.

Lag en celle suspensjon med en tetthet på 420, 000 celler per milliliter i fenol rødfri RPMI 1640 medium som inneholder 2% FCS. Tilsett 37 500 nøytrofiler i 90 mikroliter til hver brønn av en svart 96-brønns, flat bunnplate. Deretter legger du til 10 mikroliter av den valgte stimulansen i triplikate for å nå en konsentrasjon på 10% i hver brønn.

Ta alltid med en negativ kontroll i triplicate. Inkuber i mørket ved 37 grader Celsius for ønsket tid, alt fra 30 minutter til to, fire eller seks timer. Deretter klargjør volumet av ugjennomtrengelig DNA-fargestoff som trengs for å legge til 25 mikroliter av fem mikromos ugjennomtrengelig DNA-fargestoff for å nå en endelig konsentrasjon av en mikromos i hver brønn.

15 minutter før slutten av inkubasjonstiden, tilsett 25 mikroliter av fem mikromos ugjennomtrengelig DNA-fargestoff til hver brønn. Fortsett inkubasjonen for de siste 15 minuttene ved 37 grader Celsius i mørket. Etter dette fjerner du supernatanten veldig nøye og lagrer om nødvendig.

Legg til 100 mikroliter med 4% paraformaldehyd. Hold platen i mørket, og gå straks videre til neste avsnitt. Når du har konfigurert innstillingene, velger du Z-serien.

Velg 10 som antall trinn. Velg tre mikrometer som trinnstørrelse. Legg platen inn i immunofluorescence confocal mikroskop.

Klikk på Kjør-fanen. Fyll ut platenavnet og beskrivelsen, og velg lagringsstedet. Velg brønnene som må anskaffes.

Velg eksponeringstiden for Texas Red og FITC. Deretter klikker du på Acquire Plate og starter oppkjøpet, noe som vil ta omtrent en time per plate. Etter dette velger du Analysemakro.

Velg deretter w1, og velg terskelverdien. Deretter velger du ønsket pikselverdi. Og til slutt, i et annet Bilde J-vindu, velg w2, og velg terskelverdien med ønsket pikselverdi.

Velg et mål for regnearkfilen, kjør analysen og lagre loggfilen etterpå. Presentert her er en svært følsom bredt anvendelig analyse for halvautomatisk kvantifisering av nøytrofil ekstracellulær felledannelse for evaluering av ex vivo induksjon av nøytrofile ekstracellulære feller på forskjellige stimuli. NET-formasjon kvantifiseres på en tredimensjonal måte ved å kvantifisere farget ekstracellulært DNA over 10 Z-stabler med tre mikrometeravstand som starter ved fokalplanet i hver brønn.

Ved å måle det kumulative området øker følsomheten til analysen. Det totale arealet av fargede nøytrofiler avbildet kvantifiseres bare i fokalplanet i hver brønn som korrelerer betydelig med det totale nøytrofiltallet i hver brønn med en Pearson korrelasjonskoeffisient på 0,99. Det representative resultatet av kvantifisering av NET-dannelse i nøytrofiler uttrykkes som kumulativt farget ekstracellulært DNA-område over 10 Z-stabler per avbildet nøytrofil.

Øyeblikksbilder blir deretter tatt av netto kvantifiseringsanalysen. Representative bilder av uforstimulerte nøytrofiler og NETs i AAV-stimulerte nøytrofiler er vist her med fluorescerende-merkede nøytrofiler i rødt og farget ekstracellulært DNA i grønt. Nøytrofiler bør håndteres med forsiktighet, og PKH-merkingen bør utføres nøyaktig i henhold til protokollen.

Denne analysen kan brukes til å studere morfologi, kinetikk og sammensetning av NETs. Denne teknikken er en annen metode som gir mulighet til å studere NETs i helse og sykdom. Trypan blå, PKH og PFA bør håndteres med hansker og bør ikke pustes inn direkte.