Name: direct injection of a lentiviral vector highlights multiple motor pathways in the rat spinal cord
Uploaded: 2019-03-15T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord at JoVE.com

Ce travail a été financé par une subvention de la National Institute of Neurological Disorders and Stroke R01 R01NS103481 et l’hôpital Shriners pour Pediatric Research accorde SHC 84051 et SHC 86000 et le ministère de la défense (SC140089).

Toutes les procédures de soins chirurgicaux et animaux suivants ont été approuvés par la protection des animaux et utilisation Committee de la Temple University.
1. pré-chirurgicale préparations
<ol><li>Préparer le verre tiré aiguilles pour injection virale quelques jours avant une intervention chirurgicale à l’aide de 3,5 nanolitres verre pipettes capillaires conçus pour injecteurs nanolitre. Tirez chaque pipette sur un extracteur d’aiguille en deux étapes selon les instructi...

La manipulation génétique des neurones dans le cerveau et la moelle épinière a servi à point culminant sensoriel, motrices et voies autonomes par l’intermédiaire de traçage fluorescente et d’explorer le potentiel de repousse des voies neuronales après blessure27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , <sup class="xref"...

Vecteurs viraux sont des outils biologiques importants qui peuvent introduire le matériel génétique dans les cellules afin de compenser les gènes défectueux, protéines de croissance important de réguler positivement ou fabriquer des protéines de marqueur qui mettent en valeur la structure et les connexions synaptiques de leurs cibles. Cet article se concentre sur l’injection directe d’un vecteur lentiviral marqués transportable très efficace dans la moelle épinière de rat afin de faire ressortir les grandes voies motrices avec traçage fluorescente.  Cette méthode est aussi très appropriée pour des études de régénération et repousse axonales d’introduire des protéines d’intérêt dans les diverses populations de neurones et a été utilisée pour faire taire les neurones pour cartographie fonctionnelle études1,2.
Nombreux détails anatomiques des voies motrices la colonne vertébrale ont été élucidées par des études de l’injection directe à traceurs classiques tels que BDA et fluoro-or3,4,5,6,7 , 8. ces traceurs sont considérées comme l’étalon-or mais peuvent avoir certains inconvénients tels que l’absorption par les axones endommagés, ou axones dans passage de la substance blanche entourant une injection site9,10,11 . Cela pourrait conduire à des interprétations erronées de la connectivité de la voie et peut être un inconvénient dans les études de régénération où absorption du colorant par des axones endommagés ou dissociées pourrait être confondu avec pour régénérer les fibres au cours de l’analyse ultérieure12.
Vecteurs lentiviraux sont populaires dans les études de thérapie génique, puisqu’elles fournissent une expression stable et à long terme dans les populations neuronales13,14,15,16,17,18 ,,19. Cependant, traditionnellement emballés vecteurs lentiviraux peut avoir limité transport rétrograde et peuvent déclencher la réponse du système immunitaire lorsqu’il est utilisé en vivo4,20,,21. Un vecteur de transport rétrograde très efficace appelé HiRet a été produit par Kato et al. en modifiant l’enveloppe virale avec une glycoprotéine de virus de la rage pour créer un vecteur hybride qui améliore le transport rétrograde22,23.
Traçage rétrograde introduit un vecteur dans l’espace synaptique d’un neurone cible, lui permettant d’être absorbés par l’axone de la cellule et transportés vers le corps cellulaire. Transport avec succès des HiRet a été démontrée de synapses neuronales dans le cerveau des souris et des primates23,24 et du muscle dans les motoneurones22. Ce protocole montre l’injection dans la moelle lombaire, en ciblant spécifiquement les terminaux synaptiques de propriospinales interneurones et des neurones du tronc cérébral. PNs recevoir des connexions de plusieurs différentes voies spinales et peuvent donc être utilisés pour cibler une population diverse de neurones de la moelle épinière et du tronc cérébral. Neurones marqués dans cette étude représentent des circuits qui innervent les motoneurones piscines relatives à la fonction motrice du membre postérieur. Étiquetage robuste est vu dans la moelle épinière et le tronc cérébral, y compris des détails de haute fidélité de tonnelles dendritiques et terminaisons axonales. Nous avons aussi utilisé cette méthode dans les études précédentes au sein de la moelle épinière cervicale d’étiqueter propriospinales et tronc cérébral de voies réticulospinales25.
Ce protocole montre l’injection d’un vecteur viral dans la moelle épinière lombaire d’un rat. Comme on le voit dans le film 1, l’incision est ciblée en identifiant la vertèbre L1 située à la dernière côte. Cela est utilisé comme un point de repère caudale pour une incision de 3-4 cm qui expose la musculature sur la moelle épinière L1-L4. Laminectomies des aspects dorsales des vertèbres T11-T13 sont effectués et une aiguille de verre biseauté est réalisée 0,8 mm latéral de la ligne médiane et abaissé de 1,5 mm profondément dans la matière grise pour injecter le virus.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>#10 Scalpel Blades</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-9801-10</td>
			<td>For use with the scalpel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309659</td>
			<td>For anesthetic IP injection, potential anesthetic booster shots, and antibiotic injections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mL Syringes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309604</td>
			<td>For injecting saline into the animal, post-surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.0 Chromic Catgut Suture</td>
			<td>DemeTECH</td>
			<td>NN374-16</td>
			<td>To re-bind muscle during closing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48000 Micropipette Beveler</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>32416</td>
			<td>Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% Iodine Solution</td>
			<td>Purdue Products L.P.</td>
			<td>L01020-08</td>
			<td>For use in sterilzation of the surgical site.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation, and surgeon&#39;s hands during surgery, as well as all other minor maintainances of sterility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthetic (Ketamine/Xylazine Solution)</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>240048</td>
			<td>For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic (Cefazolin)</td>
			<td>West-Ward Pharmaceuticals</td>
			<td>NPC 0143-9924-90</td>
			<td>To be injected subcutaneously to prevent infection post-surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Sterilizer</td>
			<td>CellPoint</td>
			<td>5-1450</td>
			<td>To heat sterilize surgical instruments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonewax</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>19009-00</td>
			<td>To seal up bone in the case of bone bleeding.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cauterizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18010-00</td>
			<td>To seal any arteries or veins severed during surgery to prevent excessive blood loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Scale</td>
			<td>Okaus</td>
			<td>REV.005</td>
			<td>For weighing the animal during surgical preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible Needle Attachment</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF34G-5</td>
			<td>For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>H68079</td>
			<td>To seal up bone in the case of bone bleeding.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary Tubes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>4878</td>
			<td>For pulled glass needles - should be designed for nanoliter injectors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair Clippers</td>
			<td>Oster</td>
			<td>111038-060-000</td>
			<td>For clearing the surgical site of hair.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostats</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-7231</td>
			<td>For general use in surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34155</td>
			<td>For general use in surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium Point Curved Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5136</td>
			<td>For general use in surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator with a Vernier Scale</td>
			<td>Kanetec</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For precise targeting during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5621</td>
			<td>For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope with Light and Vernier Scale Ocular</td>
			<td>Leitz Wetzlar</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroSyringe Pump Controller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>62403</td>
			<td>To control the rate of injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoliter 2000 Pump Head Injector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500150</td>
			<td>To load and inject virus in a controlled fashion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td>To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalamic Ointment</td>
			<td>Dechra Veterinary Products</td>
			<td>RAC 0119</td>
			<td>To protect the animal&#39;s eyes during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>To assist with loading virus into the nanoinjector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needles (25G x 5/8)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305122</td>
			<td>For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Tooth Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5152</td>
			<td>For griping spinous processes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Oil</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6510</td>
			<td>To hold open the surgical wound.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rimadyl Tablets</td>
			<td>Bio Serv</td>
			<td>MP275-050</td>
			<td>For pain management post-surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeurs</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-8300</td>
			<td>To remove muscle from the spinal column during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade Handle</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-9843</td>
			<td>To slice open skin and fat pad of animal model during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5980</td>
			<td>For general use in surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steal Wound Clips</td>
			<td>CellPoint</td>
			<td>201-1000</td>
			<td>To bind the skin of the surgical wound during closing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staple Removing Forceps</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS750347</td>
			<td>To remove the staples, should they be applied incorrectly.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cloth</td>
			<td>Phenix Research Products</td>
			<td>BP-989</td>
			<td>To provide a sterile surface for the operation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cotton-Tipped Applicators</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>806-WC</td>
			<td>To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>2146</td>
			<td>To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Saline</td>
			<td>Baxter Healthcare Corporation</td>
			<td>281324</td>
			<td>For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Gloves</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Heating Pad</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For maintaining the body temperature of the animal model during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Microscope</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For enhanced visualization of the surgical wound.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Stapler</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS750546</td>
			<td>To apply the staples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T/Pump Heat Therapy Water Pump</td>
			<td>Gaymar</td>
			<td>TP500C</td>
			<td>To pump warm water into the water convection warming pad.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Convection Warming Pad</td>
			<td>Baxter Healthcare Corporation</td>
			<td>L1K018</td>
			<td>For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighted Hooks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To hold open the surgical wound.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct injection of a lentiviral vector highlights multiple motor pathways in the rat spinal cord

Introduction des protéines d’intérêt dans les cellules du système nerveux est difficile en raison des barrières biologiques innées qui limitent l’accès à la plupart des molécules. Injection directement dans le tissu médullaire permet de contourner ces obstacles, donnant accès à des corps cellulaires ou synapses où les molécules peuvent être incorporés. Combinant la technologie vecteur viral avec cette méthode permet l’introduction de gènes cibles dans le tissu nerveux dans le but de la thérapie génique ou traçage des voies. Ici, un virus conçu pour le transport rétrograde très efficace (HiRet) est introduit au niveau des synapses des interneurones propriospinales (PNs) pour encourager le transport spécifique de neurones de la moelle épinière et les noyaux du tronc cérébral. Ciblage PNs tire parti des nombreuses connexions qu’ils reçoivent de voies motrices telles que les tracts rubrospinaux et réticulospinales, ainsi que leur interconnexion avec les autres dans l’ensemble des segments de la moelle épinière. Représentant suivi à l’aide du vecteur HiRet constitutivement actif protéine fluorescente verte (GFP) montre haute fidélité détails de corps cellulaires, les axones et les arbres dendritiques dans PNs thoraciques et dans les neurones réticulospinales dans la formation réticulée pontique. HiRet intègre bien dans les voies du tronc cérébral et PNs, mais montre l’intégration dépendant âge dans les neurones du faisceau pyramidal. En résumé, l’injection de la moelle épinière à l’aide de vecteurs viraux est une méthode appropriée pour l’introduction de protéines d’intérêt dans les neurones des secteurs ciblés.

Transport du vecteur viral et injection réussie devraient aboutir à la transduction d’une population robuste de neurones unilatérales dans la moelle épinière et dans certains noyaux du tronc cérébral. Figure 1 montre un étiquetage stéréotypée des neurones et des axones dans la moelle épinière thoracique et dans la formation réticulée pontine du tronc cérébral après l’injection quatre semaines. Expression importante de la GFP est vu dans les neurones ...

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Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord

Ce protocole montre l’injection d’un vecteur viral marqués transportable dans les tissus de la moelle épinière de rat. Le vecteur est absorbé au niveau de la synapse et transporté vers le corps cellulaire des neurones de la cible. Ce modèle convient pour un traçage rétrograde des voies importantes de la colonne vertébrale ou ciblage des cellules pour des applications de la thérapie génique.

Injection directe d’un vecteur Lentiviral met en évidence plusieurs voies motrices de la moelle épinière de Rat

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. ...

Les vecteurs viraux peuvent introduire du matériel génétique dans les cellules pour compenser les gènes défectueux, pour réguler les protéines de croissance importantes, ou pour fabriquer des marqueurs qui peuvent tracer des circuits neuronaux. L’introduction de vecteurs viraux dans le système nerveux est difficile en raison des barrières biologiques innées. L’injection directe dans le tissu médullaire contourne ces barrières, permettant l’accès aux corps cellulaires ou aux synapses.Il peut être difficile de cibler correctement les niveaux rachidiens de L1 à L4. Il est important d’utiliser des repères pour vérifier la cible et n’oubliez pas que ces segments s’alignent vers les vertèbres T11 à T13. Le jour de la procédure, branchez l’injecteur dans la micro-pompe et placez la micro-pompe dans un micromanipulateur à l’échelle vernier.Utilisez une seringue avec une aiguille flexible pour charger soigneusement un colorant coloré dans l’une des aiguilles en verre et insérer l’aiguille en verre dans l’injecteur. Ensuite, confirmez que l’aiguille est ensemencée correctement dans les rondelles, et que le bouchon de l’injecteur est vissé sur serré, et que l’aiguille injecteur d’acier est prolongée d’environ trois quarts de la longueur de l’aiguille en verre. Avant de commencer l’intervention, décongeler au moins un microlitre, plus un petit volume de virus supplémentaire par injection provenant de l’entreposage du congélateur, et confirmer un manque de réponse de pincement des pieds chez un rat anesthésié.Raser le long de la ligne médiane dorsale des hanches à l’angle inférieur de l’omoplate de l’animal, en tirant la peau tendue pour un rasage plus facile et plus précis, et désinfecter la peau exposée avec séquentielle 5% iode et 70% gommages à l’éthanol. Appliquer de l’onguent ophtalmique sur les deux yeux. Placez ensuite l’animal sur un tissu stérile et placez de la gaze sous la vessie pour recueillir l’urine.Pour identifier l’emplacement de l’incision cutanée, appuyez doucement sur les doigts à la dernière côte pour localiser la vertèbre L1. En utilisant cette vertèbre comme point de repère et en tenant la peau tendue par la propagation douce tout en appuyant fermement avec le scalpel, utilisez une lame chirurgicale numéro 10 pour faire une incision écorchée de trois à quatre centimètres se terminant juste inférieur à L1 pour exposer le muscle. Utilisez des forceps et des ciseaux pour ressentir les processus épineux.Faire de petites coupes rostrales pour permettre à l’espace de saisir solidement sur un processus supérieur avec des forceps de dent de rat. Et faire deux longues coupures profondes aussi près que possible des processus. Après avoir sécurisé les muscles lauraux en place, effacer le muscle autour des processus pour déterminer la forme de leurs têtes.Visualisez ensuite les formes des têtes des processus épineux afin d’identifier le site de laminectomie. Les processus T11 et T12 et T13 seront le site de la laminectomie. Une fois que la zone cible a été correctement identifiée, écartez doucement les vertèbres pour révéler les ligaments intervertébraux, et utilisez des rongeurs pour prendre de petites morsures des processus épineux et de l’aspect dorsal des vertèbres.Dégagez l’os loin de la ligne médiane afin que le vaisseau sanguin de ligne médiane puisse être observé, laissant une fenêtre qui révèle clairement le tissu médullaire et est exempte de débris. Attachez ensuite les forceps stabilisateurs aux processus épineux rostral et caudal à la fenêtre de laminectomie pour fixer l’animal dans un support spinal. Et soulever l’abdomen de l’animal pour nier l’effet des mouvements respiratoires.Pour charger le virus dans l’injecteur, pipette environ cinq microlitres du stock décongelé sur un morceau de Parafilm, et de positionner les aiguilles de verre de sorte que la pointe est à l’intérieur de la goutte. Utilisez la micro-pompe pour retirer jusqu’à quatre microlitres de virus à un taux de 20 à 100 nanolitres par seconde, et réglez le contrôleur à injecter avant de libérer une petite quantité de virus de la pointe de l’aiguille pour s’assurer qu’il n’est pas bloqué. Essuyez tout excès de virus avec un lingette de laboratoire et placez les micromanipulateurs de sorte que l’échelle vernier soit visible.Placez l’aiguille au milieu de la moelle épinière et utilisez l’écaille vernier sur le micromanipulateur pour diriger l’aiguille latéralement de 0,8 millimètre. Ensuite, abaissez l’aiguille à l’accord rachidien jusqu’à ce qu’elle soit en retrait, mais pas perforant, le dura, et utilisez un mouvement de torsion rapide pour percer le dura avec l’aiguille jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille a coulé à une profondeur de 1,5 millimètres. Une fois l’aiguille en place, programmez l’injecteur pour délivrer le virus à un taux de 400 nanolitres par minute, et confirmez que le virus pénètre dans la moelle épinière en observant la progression du front de teinture.Une fois l’injection terminée, laissez l’aiguille reposer dans la moelle épinière pendant deux à cinq minutes pour faciliter la diffusion du virus, avant de retirer lentement l’aiguille pour le positionner au prochain site d’injection. Après la dernière injection, retirer l’animal du porte-rachidien pour permettre l’ablation de tous les dispositifs utilisés pour propager le muscle latéral. Ensuite, fermez le muscle avec une suture de catgut chromique de 4,0 et agrafez la peau avec des pinces à plaies de neuf millimètres.Quatre semaines après une injection réussie, l’expression significative de GFP est observée dans les neurones dans la matière grise de la moelle épinière thoracique sur le côté, ipsilateral à l’injection. Dans la matière blanche, l’expression GFP est observée dans les axones du cordon ipsilateral, en particulier dans les zones typiques des axones propriospinaux. Un grossissement plus élevé des neurones de la matière grise révèle un exemple d’expression typique du signal dans les corps cellulaires neuronaux et les dendrites.L’expression de GFP dans les neurones peut également être observée dans les noyaux de tronc cérébral, tels que dans la formation réticulaire de pontine. Les facteurs clés pour une procédure réussie d’injection de moelle épinière sont le ciblage vertébral correct et s’assurant que le virus entre dans le tissu Si une lésion rostrale de moelle épinière est exécutée avant cette procédure, l’injection directe peut être employée pour tracer des neurones qui rétablissent des connexions autour de la blessure.

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