Name: direct injection of a lentiviral vector highlights multiple motor pathways in the rat spinal cord
Uploaded: 2019-03-15T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord at JoVE.com

この作品は、国立神経疾患と脳卒中 R01 R01NS103481 からの助成金によって賄われていたし、シュリナーズ病院小児科研究 SHC 84051 SHC 86000 と国防総省 (SC140089)。

以下の手術と動物のケア手順のすべては、ケアおよび使用委員会のテンプル大学によって承認されています。
1. 術前準備
<ol><li>ウイルス注入ナノリットル インジェクター用に設計された 3.5 ナノリットル ガラス毛細管ピペットを使用して手術前に数日の引っ張られたガラス針を準備します。針の 2 つのテンプレートを作成するための製造元の指示に従って二段針引き?...

脳や脊髄の神経細胞の遺伝子操作はハイライト感覚、運動と傷害27,28,後神経管の再生可能性を探索する蛍光トレースを介して自律神経経路に務めています。29,30,31,32,33. 直接脊髄への逆行性可搬型ウイルスのベクトルの...

ウイルスのベクトル、欠陥遺伝子の活性を上昇させる重要な成長タンパク質を補うまたは構造とのシナプス接続をハイライト マーカー蛋白質を製造するために細胞に遺伝物質を導入することが重要な生物学的ツール彼らの目標です。蛍光トレースと主要な運動経路を強調するためにラットの脊髄に非常に効率的な逆行性輸送レンチウイルスベクターの直接注入について説明します。 このメソッドは、神経細胞の多様な集団に興味の蛋白質を導入する軸索の再生と再生の研究に非常に適しても、沈黙ニューロン機能マッピング研究1,2のために使用されています。
脊髄運動経路の解剖学的な詳細の多くを BDA とフッ素金3,4,5,6,7など古典的なトレーサーと直噴研究を通して解明しました。,8しますこれらのトレーサーのゴールド スタンダードであるが、損傷した軸索によって吸収など特定の欠点がありますまたは注射を周囲白質の通路の軸索サイト9,10,11。.これは経路接続が誤って解釈する可能性があります、破損または切断された軸索によって色素の吸収が後の分析12中に繊維を再生のためと誤解されるおそれ再生研究の欠点があります。
レンチウイルスベクターは遺伝子療法の研究で人気のある神経集団13,14,15,16,17,18 で安定した、長期的な表現を提供するよう ,19。ただし、従来パッケージ レンチウイルスベクター逆行性輸送に限られていることができるし、した場合の免疫応答を引き起こす可能性があります生体内で4,20,21。HiRet と呼ばれる高効率の逆行輸送ベクトルは逆行輸送22,23を向上させるハイブリッド ベクトルを作成する狂犬病ウイルス糖蛋白質のウイルスのエンベロープを変更することにより加藤らによって生産されています。
逆行のトレースは、その細胞の軸索によってとらし、細胞体に輸送することができますターゲット ニューロンのシナプスの空間にベクトルを紹介します。HiRet の成功の輸送は、マウスや霊長類23,24の脳に神経シナプスと運動ニューロン22に筋肉から実証されています。このプロトコルは、腰椎脊髄、脳幹ニューロンと脊髄固有のニューロンのシナプス終末を具体的にターゲットへの注入を示します。PNs では、多くの異なる脊髄経路から接続を受信し、脊髄と脳幹の神経細胞の多様な人口を対象とするこのように利用できます。本研究ではラベル付きニューロン回路を支配する運動ニューロン プール後肢運動機能に関連を表します。堅牢なラベリングは、脊髄と脳幹、アーバーの樹状突起と軸索端末の忠実度の高い詳細などに見られます。またメソッドを使いましたこの頸髄内先行研究で脊髄固有および脳幹の網様体脊髄経路25にラベルを付ける。
このプロトコルは、ラットの腰部脊髄へのウイルスのベクトルの注入を示します。映画 1に見られるように、最後の肋骨にある L1 椎体を識別することによって切開は対象します。これは L1 L4 脊髄を通して筋肉を公開する 3-4 cm の切開の尾のランドマークとして使用されます。T11 T13 脊椎骨の背側面の laminectomies が実行され、ベベルガラス針は 0.8 mm 下げた 1.5 mm の正中線から外側を指示されるウイルスを注入する灰白質に深く。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>#10 Scalpel Blades</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-9801-10</td>
			<td>For use with the scalpel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309659</td>
			<td>For anesthetic IP injection, potential anesthetic booster shots, and antibiotic injections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mL Syringes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309604</td>
			<td>For injecting saline into the animal, post-surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.0 Chromic Catgut Suture</td>
			<td>DemeTECH</td>
			<td>NN374-16</td>
			<td>To re-bind muscle during closing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48000 Micropipette Beveler</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>32416</td>
			<td>Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% Iodine Solution</td>
			<td>Purdue Products L.P.</td>
			<td>L01020-08</td>
			<td>For use in sterilzation of the surgical site.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation, and surgeon&#39;s hands during surgery, as well as all other minor maintainances of sterility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthetic (Ketamine/Xylazine Solution)</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>240048</td>
			<td>For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic (Cefazolin)</td>
			<td>West-Ward Pharmaceuticals</td>
			<td>NPC 0143-9924-90</td>
			<td>To be injected subcutaneously to prevent infection post-surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Sterilizer</td>
			<td>CellPoint</td>
			<td>5-1450</td>
			<td>To heat sterilize surgical instruments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonewax</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>19009-00</td>
			<td>To seal up bone in the case of bone bleeding.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cauterizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18010-00</td>
			<td>To seal any arteries or veins severed during surgery to prevent excessive blood loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Scale</td>
			<td>Okaus</td>
			<td>REV.005</td>
			<td>For weighing the animal during surgical preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible Needle Attachment</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF34G-5</td>
			<td>For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>H68079</td>
			<td>To seal up bone in the case of bone bleeding.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary Tubes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>4878</td>
			<td>For pulled glass needles - should be designed for nanoliter injectors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair Clippers</td>
			<td>Oster</td>
			<td>111038-060-000</td>
			<td>For clearing the surgical site of hair.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostats</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-7231</td>
			<td>For general use in surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34155</td>
			<td>For general use in surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium Point Curved Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5136</td>
			<td>For general use in surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator with a Vernier Scale</td>
			<td>Kanetec</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For precise targeting during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5621</td>
			<td>For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope with Light and Vernier Scale Ocular</td>
			<td>Leitz Wetzlar</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroSyringe Pump Controller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>62403</td>
			<td>To control the rate of injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoliter 2000 Pump Head Injector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500150</td>
			<td>To load and inject virus in a controlled fashion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td>To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalamic Ointment</td>
			<td>Dechra Veterinary Products</td>
			<td>RAC 0119</td>
			<td>To protect the animal&#39;s eyes during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>To assist with loading virus into the nanoinjector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needles (25G x 5/8)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305122</td>
			<td>For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Tooth Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5152</td>
			<td>For griping spinous processes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Oil</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6510</td>
			<td>To hold open the surgical wound.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rimadyl Tablets</td>
			<td>Bio Serv</td>
			<td>MP275-050</td>
			<td>For pain management post-surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeurs</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-8300</td>
			<td>To remove muscle from the spinal column during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade Handle</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-9843</td>
			<td>To slice open skin and fat pad of animal model during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5980</td>
			<td>For general use in surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steal Wound Clips</td>
			<td>CellPoint</td>
			<td>201-1000</td>
			<td>To bind the skin of the surgical wound during closing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staple Removing Forceps</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS750347</td>
			<td>To remove the staples, should they be applied incorrectly.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cloth</td>
			<td>Phenix Research Products</td>
			<td>BP-989</td>
			<td>To provide a sterile surface for the operation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cotton-Tipped Applicators</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>806-WC</td>
			<td>To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>2146</td>
			<td>To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Saline</td>
			<td>Baxter Healthcare Corporation</td>
			<td>281324</td>
			<td>For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Gloves</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Heating Pad</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For maintaining the body temperature of the animal model during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Microscope</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For enhanced visualization of the surgical wound.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Stapler</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS750546</td>
			<td>To apply the staples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T/Pump Heat Therapy Water Pump</td>
			<td>Gaymar</td>
			<td>TP500C</td>
			<td>To pump warm water into the water convection warming pad.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Convection Warming Pad</td>
			<td>Baxter Healthcare Corporation</td>
			<td>L1K018</td>
			<td>For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighted Hooks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To hold open the surgical wound.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct injection of a lentiviral vector highlights multiple motor pathways in the rat spinal cord

神経系の細胞に興味の蛋白質を導入は、生来の生物学的障壁ほとんど分子へのアクセスを制限するために挑戦です。脊髄組織に直接注射を細胞体へのアクセスを提供する、これらの障壁を無視またはシナプス分子を組み込むことができます。この方法とウイルスベクター技術を組み合わせることで標的遺伝子の遺伝子治療や管トレースを目的として神経組織への導入はします。ここで脊髄固有のニューロン脊髄と脳幹の核のニューロンへの特定輸送を促進する (PNs) のシナプスに非常に効率的な逆行性輸送 (HiRet) 用に設計されたウイルスを導入します。PNs をターゲットに核および網様体脊髄路として脊髄セグメントを通して互いの相互接続などの運動経路から受け取った多数の接続の活用します。代表的なトレース HiRet ベクトルを用いた恒常活性緑色蛍光タンパク質 (GFP) 細胞体、軸索と胸部の PNs と橋の網様体網様体脊髄ニューロン樹状突起のアーバーの忠実度の高い詳細を表示します。HiRet 脳幹経路と PNs に組み込まれていますが、年齢依存の皮質脊髄路ニューロンの統合を示しています。要約すると、ウイルスのベクトルを使用して脊髄注射は興味の蛋白質の標的器官の細胞への導入に適した方法です。

成功した注入およびウイルスのベクトルのトランスポートは、一方的なニューロン脊髄および特定の脳幹の核の堅牢な人口の伝達になります。ニューロンと脊髄、投与 4 週間後で脳幹の橋の網様体は軸索のステレオタイプ的なラベリングを図 1に示します。重要な GFP 発現は、注入 (図 1 a、ボックス領域) と同側の側胸部脊髄の灰白質のニュー...

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Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord

このプロトコルは、ラット脊髄組織への逆行性可搬型ウイルスのベクトルの注入を示します。ベクトルはシナプスでとらし、ターゲット ニューロンの細胞体に運ばれます。このモデルは、重要な脊髄経路またはターゲット細胞遺伝子治療用の逆行のトレースに適しています。

レンチ ウイルスのベクトルの直噴ハイライト ラット脊髄における複数の運動経路

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. ...

ウイルスベクターは、欠陥遺伝子を補うために細胞に遺伝物質を導入したり、重要な成長タンパク質をアップリデンスしたり、神経回路を追跡できるマーカーを製造することができます。神経系にウイルスベクターを導入することは、生来の生物学的障壁のために困難です。脊髄組織への直接注入はこれらの障壁をバイパスし、細胞体またはシナプスへのアクセスを可能にする。L1からL4脊髄レベルを正しく標的にすることは困難です。ランドマークを使用してターゲットを検証し、これらのセグメントが T11 から T13 の椎骨にラインすることを覚えておくことが重要です。手順の日に、マイクロポンプにインジェクターを差し込み、マイクロポンプをバーニアスケールのマイクロマニピュレーターに入れる。柔軟な針で注射器を使用して、色付きの染料をガラスの針の1つに慎重にロードし、ガラス針を注入器に挿入します。次に、針がワッシャーに正しく播種されていること、および注入器キャップがしっかりとねじ込まれ、スチールインジェクター針がガラス針の長さの約4分の3を延長していることを確認します。処置を開始する前に、少なくとも1マイクロリットル、および冷凍庫貯蔵からの注射あたりの少量の余分なウイルスを解凍し、麻酔下のラットにおけるつま先ピンチの応答の欠如を確認する。腰から動物の肩甲骨の下角まで、後方の正中線に沿って剃り、より簡単かつ正確な剃剃りのために皮膚を引っ張り、露出した皮膚をシーケンシャルな5%ヨウ素と70%エタノールスクラブで消毒します。両眼に眼軟膏を塗布する。その後、動物を無菌の布の上に置き、膀胱の下にガーゼを置いて尿を採取します。皮膚切開部位を特定するには、最後の肋骨で指を軽く押してL1椎骨を見つけます。この椎骨をランドマークとして使用し、メスでしっかりと押しながら穏やかに広げて皮膚を張り、数10の外科用ブレードを使用して、筋肉を露出させるためにL1に劣る3〜4センチメートルの皮付き切開を行います。スピンスプロセスを感じるために鉗子とはさみを使用してください。小さなロストラルカットを行い、ラット歯の鉗子で上のプロセスにしっかりとつかむ余地を確保します。そして、可能な限りプロセスに近い2つの長い、深いカットを行います。所定の位置に横筋を固定した後, 彼らの頭の形状を決定するプロセスの周りの筋肉をクリア.次に、ラミネクトミー部位を特定するために、棘の頭部の形状を可視化する。T11と結合T12およびT13プロセスは、ラミテクトミーの部位となる。標的領域が正しく特定されたら、椎骨を穏やかに広げて椎間靭帯を明らかにし、回転器を使用して脊椎のプロセスと脊椎の背側の側面を小さく噛みます。正中血管が観察されるように、正中線から骨を取り除き、脊髄組織をはっきりと明らかにし、破片のない窓を残します。次に、安定した鉗子を亜染色体に固定し、静脈切除窓に尾状を固定し、動物を脊椎ホルダーに固定します。そして、呼吸の動きの効果を否定するために動物の腹部を上げます。ウイルスをインジェクターにロードするには、解凍したストックの約5マイクロリットルをパラフィルムにピペットし、先端がドロップ内になるようにガラス針を配置します。マイクロポンプを使用して、毎秒20〜100ナノリットルの速度で最大4マイクロリットルのウイルスを取り出し、それがブロックされていないことを確認するために針先から少量のウイルスを放出する前に注入するようにコントローラを設定します。実験室のワイプで余分なウイルスを拭き取り、バーニアスケールが見えるようにマイクロマニピュレータを配置します。針を脊髄の正中線に置き、マイクロマニピュレーターのバーニアスケールを使用して針を横方向に0.8ミリメートル向けます。その後、針を脊髄に下げて、穿刺しない硬膜を穿刺し、針の先端が1.5ミリメートルの深さまで沈むまで、針で硬膜を穿刺するために素早くねじった動きを使用します。針が所定の位置に入ったら、インジェクターをプログラムして毎分400ナノリットルの速度でウイルスを送達し、ウイルスが色素前線の進行を観察して脊髄に入っていることを確認します。注射が終了したら、針を脊髄で2〜5分間休ませてウイルスの拡散を容易にし、次の注射部位でゆっくりと針を引き出す。最後の注射の後、脊髄のホルダーから動物を取り除き、横筋を広げるために使用されるあらゆる装置を除去することを可能にする。その後、4.0クロミックキャットグ縫合で筋肉を閉じ、9ミリメートルの巻きクリップで皮膚をホチキス止めします。注射に成功してから4週間後、側の胸部脊髄の灰色物質内のニューロンに有意なGFP発現が観察され、注射に対するイプシラショナルである。白質では、特にプロプリオ脊髄軸索に典型的な領域において、イプシラショナルコードの軸索にGFP発現が認められる。灰色物質ニューロンの高倍率は、ニューロン細胞体および樹状突起における典型的なシグナル発現の例を明らかにする。ニューロンにおけるGFP発現は、ポンチン網状形成中などの脳幹核においても観察することができる。脊髄注射術の成功の重要な要因は、正しい椎体標的化であり、ウイルスが組織に入っていることを保証するこの手順の前にrostral脊髄損傷が行われた場合、直接注射を使用して、傷害の周りの接続を再確立するニューロンを追跡することができる。

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