Name: preparation and immunostaining of myelinating organotypic cerebellar slice cultures
Uploaded: 2019-03-20T14:00:00
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우리에 대 한 귀중 한 의견 원고 박사 숀 프리먼, 닥터 나탈리 솔-Foulon와 박사 토마스 루 감사합니다. 이 작품 INSERM, ICM, ARSEP 교부 금 R13123DD, ANR R17127DD (광고)에 FRM 친목, SPF20110421435 (광고)에 의해 투자 되었다 (몬태나)를 FDT20170437332. 우리는 icm CELIS 셀 문화 시설 감사합니다. 양의 이미징 플랫폼입니다.

동물을 포함 하는 모든 작업 준수 기관 정책 및 지침 UPMC, INSERM 프랑스 및 유럽 공동체 위원회 지시 86/609/EEC에 의해 설립.
1. 준비 문화 매체와 문화의 삽입 (실습 시간 ≈ 10-15 분)
참고: 흐름 문화 후드 무 균 조건 하에서이 단계를 수행
<ol><li>50%로 구성 된 문화 매체의 40 mL를 준비 공학은, 25% 행 크의 균형 소금 솔루션 (1x), 25% 열 비활성화 말 혈...

<ol>
	<li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+Plasticity+and+Nervous+System+Function.">Myelin Plasticity and Nervous System Function.</a> Annual Review Neuroscience. 41, 61-76 (2018).</li><li>Desmazi&#232;res, A., Sol-Foulon, N., Lubetzki, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+at+the+nodal+and+perinodal+axonal+domains:+a+basis+for+multiple+sclerosis+pathology.">Changes at the nodal and perinodal axonal domains: a basis for multiple sclerosis pathology.</a> Multiple Sclerosis Houndmills Basingstoke England. 18, 133-137 (2012).</li><li>Waxman, S. G., Ritchie, J. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+promotes+oligodendrogenesis+and+adaptive+myelination+in+the+mammalian+brain.">Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain.</a> Science. 344, 1252304 (2014).</li><li>Tomassy, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+profiles+of+myelin+distribution+along+single+axons+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex.">Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Science. 344, 319-324 (2014).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+sensitive+optical+coherence+microscopy+for+brain+imaging.">Polarization sensitive optical coherence microscopy for brain imaging.</a> Optics Letters. 41, 2213-2216 (2016).</li><li>Freudiger, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biomedical+imaging+with+high+sensitivity+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science. 322, 1857-1861 (2008).</li><li>Lim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+Schwann+cell+myelination+by+third+harmonic+generation+microscopy.">Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).</li><li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy.">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).</li><li>Arancibia-Carcamo, I. L., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+node+of+Ranvier+in+CNS+pathology.">The node of Ranvier in CNS pathology.</a> Acta Neuropathologia. (Berlin). 128, 161-175 (2014).</li></ol>

여기, 우리는 전을 생성 하는 프로토콜 세부 vivo 모델 마우스 소 뇌 organotypic 슬라이스 문화에 해당 게시 방법15,,1619 및 후속 myelin 이전에서 적응 이러한 준비의 immunostaining입니다. 이 전략 모두 건강 하 고 병 적인 상태에는 고해상도와 수 초 구성 요소를 시각화 하는 가능성을 제공 합니다.
10 일 된 쥐에서 ?...

신경 세포는 그것의 환경 및 생성 및 다른 세포에 전기 자극의 전파를 보장 하는 축 삭에서 입력을 받는 somato 수지상 구획을 구성 하는 매우 편광된 세포 이다. 빠른 전파와 정보의 적시 납품은 신경 시스템의 적절 한 작동에 대 한 필수적입니다. 척추 동물, 그것은 myelination axonal 전도 속도1증가 수에 의해 촉진 된다. Myelin 압축된 계층 myelinating 명과 의해 생성 된 플라즈마 멤브레인의 중앙 신경 조직 (CNS)에 즉 oligodendrocytes 및 Schwann 세포는 말 초 신 경계 (PNS)에 의해 형성 된 특수 구조 이다. CNS 그리고 PNS에서 둘 다, axoglial 상호 작용 드라이브 전문된 axonal 도메인의 형성: 노드의 Ranvier와 그들의 주변 도메인, paranodes, 및 juxtaparanodes2. 수 초, 또는 internodes, 전압 개폐 나트륨 채널 (Nav)에서 풍성 하 게 하는 작은 unmyelinated 도메인에 해당 하는 노드의 Ranvier와 대체 절연 axonal 세그먼트. 높은 농도 및 노드의 Ranvier에서 나v 채널의 급속 한 활성화 활동 전위 그리고 myelin 칼 집의 단 열 속성 함께 재생을 허용, 보장의 효율적이 고 빠른 saltatory 유도 따라3축 삭 신경 충 동입니다.
신경 임펄스의 전도 속도 가속에 그것의 역할, myelinating 명과 장기 무결성을 보존 하 고 그것의 생존4,5에 참여, 축 삭에 대사 지원을 합니다. 또한, 그것은 취소 되고있다에서 최근 몇 년 동안 그 myelin는 인생, 따라서 아마도 참가 규정 및 다양 한 신 경계 기능의가 소성을 통해 동적으로 변조. 배포, 숫자, 길이, 및 축 삭을 따라 myelin 덮개의 두께 따라서 다양 한 네트워크6,,78세밀 하 게 조정 하는 소설 방법을 나타낼 수 있습니다. 따라서, myelin의 진화 인수 감각, 모터 및 인지 기능에 대 한 핵심 프로세스 이며 축 삭과 명과 사이 상호 작용의 섭 동은 점점는 발달에 기여로 간주 또는 신경 인수 질병9.
지질 (70%)의 높은 비율의 특정 기능 myelin 구성 특징 되었습니다. 단백질 (30%)에 비해 달리 다른 세포 막10. 그러나, myelin 지질, 달리 myelin 단백질의 대부분은 myelin, myelin 기본적인 단백질 (MBP), proteolipid 단백질 (PLP), 2', 3'-주기적인 뉴클레오티드 3'-포스 (CNP), myelin 연합 당단백질 (MAG)를 포함 하 여 관련 myelin oligodendrocyte 당단백질 (MOG), PMP-22 그리고 P010. Myelin 얼룩 다양 한 조직학 방법 존재 Luxol 빠른 블루11등의 지질 구성, 수단 블랙 B12, 베이커의 산 hematin 방법13로 실버14얼룩에 따라. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 방식을 적절 한 대비와 해상도 개별 섬유를 시각화를 위한 항상 허용 하지 않습니다. 수 초를 감지 하는 양자 택일 접근 immunohistochemistry myelin 단백질에 대 한 감독을 통해 이다. 다양 한 항 체는 높은 특이성으로 myelin 특정 항 원을 대상 고 myelinated 구조를 검출 하기 위하여 정기적으로 사용할 수 있습니다. 항 체 항 원 상호 작용은 1 차 항 체에 대 한 감독 및 적절 한 형광 현미경 검사 법으로 시각 fluorophore 결합 이차 항 체를 사용 하 여 추가 공개 수 있습니다. 여기, 우리는 토론 프로토콜 얼룩 myelin에 ex vivo 소 뇌 조각, 신경 조직 아키텍처의 좋은 보존 수 있는 모델을 설명 합니다. 또한, 조직 및 Purkinje 세포 (소 뇌의 유일한 myelinated 신경)의 크기 그들 electrophysiological 연구 클래식 모델 만들고 그들은 마찬가지로 고정 또는 라이브 이미징 연구를 수행 하기 위해 이상적입니다.
소 뇌 조각 Purkinje 세포 myelination, 비보 (6-7 일 생체 외에서, DIV)15전 1 주일에 의해 주로 달성 하는 과정의 초기 증상에 해당 하는 시간, P9-P10 생쥐에서 생성 됩니다. 또한,이 모델은 적응 demyelinating 질환 다 발성 경화 증 (MS) 등을 조사 하는 광범위 한 demyelination 또는 사용 하는 myelinotoxic 복합 lysophosphatidylcholine (lysolecithin, LPC), 소 뇌 조각에 유도 될 수 있다 어떤은 자발적인 remyelination16,17옵니다. 내 인 성 remyelination 문화 매체에서 LPC 제거 후 2 일에서 그리고 거의 주 게시물 치료 완료.
이 프로토콜의 완성 등 소 뇌 조각 문화 준비 demyelination의 피크에 도달 하는 2 일 뒤 완전히 myelinated 슬라이스를 주, 그들의 전체에 대 한 다른 주에 대 한 반나절 approximatively 3 주 소요 remyelination입니다. 또한, immunohistochemistry 2 일 이내에 완료할 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜 6 쥐 새끼의 표준 쓰레기에 적응 그리고 계획 된 실험에 사용 되는 동물의 수에 적응 시킬 필요가 있다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BME medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>41010026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (10X HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14180046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Horse Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;Streptomycin (10.000 IU/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gey&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9779-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose Solution (45%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8769-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysophosphatidylcholine (LPC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L4129-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol (100% ethanol)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>20821.330</td>
			<td>Cooled at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#174; X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>500622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>EuroMEDEX</td>
			<td>ET330-A</td>
			<td>pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>06-896</td>
			<td>Dilution 1/300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Polyclonal, Chicken)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AB9348</td>
			<td>Dilution 1/150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>NE1019</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma)</td>
			<td>Gift from Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Dilution 1/5 to 1/10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Sodium Channel, Pan Antibody (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8809</td>
			<td>Dilution 1/150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Caspr Antibody (Polyclonal, Rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34151</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Secondary Antibodies conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue chopper</td>
			<td>McIlwain</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14101-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-straight forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved-fine forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11297-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes (60-mm and 100-mm)</td>
			<td>TPP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-, 6-well culture plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell culture inserts (0,4 &#181;m, 30-mm diameter)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>37&#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-end pipette tips</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>134000CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-bore pipette tips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>2079G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe</td>
			<td>Terumo Europe</td>
			<td></td>
			<td>20 or 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filters</td>
			<td>Terumo Europe</td>
			<td></td>
			<td>0.22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>RS France</td>
			<td></td>
			<td>76 x 26 x 1.1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>RS France</td>
			<td></td>
			<td>22 x 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Sciences Tissue Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>5511</td>
			<td></td>
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			<td>Binocular microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
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preparation and immunostaining of myelinating organotypic cerebellar slice cultures

신 경계에서 수 초 이며 glial myelinating에 의해 생성 된 복잡 한 막 구조 세포, 어떤 ensheathes 축 삭 빠른 전기 전도 용이 하 게. Myelin 변경 어디 기능적인 적자와 관련 된 다양 한 신경 질환에 표시 되었습니다. 여기, 우리는 전직에 대 한 자세한 설명을 제공 vivo 모델 마우스 organotypic 소 뇌 조각, 여러 주 및 추가 표시 myelin를 시각화를 위한 문화에서 유지 될 수 있는 구성 된.

Organotypic 소 뇌 조각 PLP GFP 유전자 변형 마우스 (그림 2B), 뿐만 아니라 Purkinje 세포 얼룩 함께 P9-P10 C57black6 야생-타입 (WT) (그림 2A)에서 얻은 대표 myelin immunostainings의 예. 소 뇌 조각 백색 질에서 미는 folia의 주변으로 조각의 영역 트랙과 myelination Purkinje 세포의 주로 6 ~ 7 후 달성 팀 7 DIV에서 전체 demyelination의 유도 LPC 치료 (<strong cl...

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Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

준비 및 Immunostaining Myelinating Organotypic 소 뇌 조각 문화

여기 우리 organotypic 슬라이스 문화 마우스 소 뇌 및 myelination와 중앙 신 경계에 remyelination의 메커니즘을 조사 적합 immunohistochemistry에 의해 얼룩 myelin 칼 집에서 준비 하는 방법을 제시.

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

이 방법은 세포 및 tissular 수준에서 myelination 및 재마일레네이션의 기본 메커니즘을 연구 할 수 있습니다. 이 기술은 기본 문화와 생체 내 접근 방식 사이의 교차로에 있습니다. 조직 아키텍처를 보존하는 주요 이점을 가진 빠르고 접근 가능한 모델입니다.절차를 시연하는 것은 멜리나 테티노트, 박사 후 연구원과 레미 론자노, 내 실험실에서 박사 과정 학생이 될 것입니다. 시작하려면 작은 가위를 포라멘 매그넘에 부드럽게 삽입하고 측면을 향해 측면 절개를 한 다음 머리 두개골 주위를 모두 잘라 두개골을 잘라 두개골을 잘라냅니다. 두개골의 등대 부분을 회수하려면 미세하고 직선적인 집게를 사용하여 두개골의 등대 부분을 조심스럽게 들어 올립니다.그런 다음 복부 두개골과 뇌 사이의 집게를 조심스럽게 소개합니다. 부드럽게 뇌를 뒤집어 작은 가위로 시차 및 삼차 신경을 잘라냅니다. 다음으로, 두개골의 머리 또는 등쪽 부분을 얼음 차가운 해부 배지를 함유한 60mm 세포 배양 접시 바로 위에 거꾸로 돌려 뇌가 중력에 의해 떨어질 수 있도록 돕습니다.미세 한 집게를 사용 하 여, 등쪽 측면을 향하고 복 근 면 누워 뇌를 지향. 쌍안경 현미경의 밑에, 선뇌 측에 두뇌를 고정하기 위하여 미세하고 직선 적인 집게를 이용하십시오. 그런 다음 뒷뇌를 뇌의 나머지 부분과 분리합니다.소뇌 아래소뇌를 잘라 서 뇌의 나머지 부분에서 소뇌를 분리. 소뇌가 고립되면, 조심스럽게 수막을 찢어 잘, 직선 집게를 사용합니다. 미세하고 구부러진 집게로 소뇌를 부드럽게 잡고 등쪽을 플라스틱 플랫폼에 올려 헬기 면도날과 수직으로 놓습니다.다음으로, 멸균, 얇은 끝 파이펫 팁이 1 밀리리터 파이펫에 부착되어 소뇌부 주변의 해부 매체에 대한 액세스를 흡인시합니다. 그런 다음, 티슈 헬기로 소뇌의 300 마이크로 미터 두께의 처진 부분을 슬라이스합니다. 다음으로, 얇게 썬 소뇌에 해부 매체 한 방울을 부드럽게 넣습니다.그런 다음, 넓은 멧돼지 파이펫 팁이 1 밀리리터 파이펫에 부착되어 슬라이스 된 소뇌를 천천히 흡기하고 얼음 차가운 해부 매체를 포함하는 60mm 세포 배양 접시로 다시 옮춥습니다. 다음으로, 두 개의 미세한 직선 집게를 사용하여 개별 조각을 분리합니다. 그런 다음, 넓은 멧돼지 파이펫 팁이 1 밀리리터 파이펫에 부착된 후, 버미에서 선택한 최대 4개의 슬라이스와 6개의 웰 플레이트의 하나의 배양 삽입에 일부 해부 배지를 전달합니다.얇은 끝 파이펫 팁을 사용하여 슬라이스 주위의 해부 매체에 대한 액세스를 제거합니다. 탈근의 경우, 시험관내 6일 후 배양 삽입물 아래에 있는 모든 배양 배지를 제거하고 밀리리터 LPC당 0.5밀리그램을 함유한 미리 따뜻하고 신선한 배양 배지의 웰당 1밀리리터로 교체하십시오. 이산화탄소 환경의 섭씨 37도에서 15~17시간 동안 배양합니다.인큐베이션 후, 사전 데운 배양 배지 1밀리리터를 함유한 25밀리리터 페트리 접시에 넣음으로써 인서트를 세척합니다. 그런 다음, 신선한, 미리 데운 배양 매체를 포함하는 새로운 6 개의 우물 접시에 배양 삽입을 즉시 전송합니다. 면역 히스토케를 시작하려면 먼저 집게를 사용하여 배양 삽입을 들어 올리고 그 아래에 배양 배지를 제거하십시오.그런 다음, 소뇌 슬라이스를 해결하기 위해 멤브레인 인서츠에 1x PBS, ph 7.4에 4 %의 PFA의 2 밀리리터를 추가합니다. 30분 후, 매 세척할 때마다 1x PBS 2밀리리터로 슬라이스를 세 번 씻습니다. 다음으로, 쌍안경 현미경의 밑에, 25x에서 30 배율을 사용하여, 메스 또는 브러쉬를 사용하여 멤브레인서 삽입에서 조각을 부드럽게 분리합니다.그런 다음 브러시를 사용하여 부동 조각을 4개의 웰 플레이트의 우물로 옮기고, 항체 소비를 제한하는 1x PBS를 함유한다. 그런 다음, 각 우물에서 PBS를 흡인하고 15 ~20 분 동안 영하 20도에서 미리 냉각 된 100 % 에탄올에서 슬라이스를 배양합니다. 인큐베이션 후 100% 에탄올을 흡인하고 1배 PBS로 슬라이스를 간략하게 씻어낸다.그런 다음, 각 세척 할 때마다 10 분 동안 1 x PBS로 실온에서 두 번 씻습니다. 비특이적 항체 고정 부위를 차단하기 위해 PBS를 흡습하고 1x PBS, 5%NGS 및 0.3%비 이온 세제를 실내 온도에서 30~45분 동안 포함하는 용액으로 슬라이스를 배양한다. 다음으로, 차단 용액에 희석된 1차 항체를 추가하고 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 슬라이스를 배양한다.하룻밤 동안 인큐베이션 후, 매 세척 할 때마다 10 분 동안 1 x PBS로 슬라이스를 세 번 씻으시다. 그런 다음 차단 용액에 희석된 이차 항체를 1~500희석 비율로 추가하고 3시간 동안 어둠 속에서 실온에서 슬라이스를 배양한다. 이차 항체와 인큐베이션 후, 매 세척할 때마다 10분 동안 어둠 속에서 1x PBS로 슬라이스를 세 번 씻는다.다음으로 쌍안경 현미경으로 슬라이드에 1x PBS의 100 마이크로리터를 놓고 브러시로 조각을 PBS로 옮기고 슬라이드에 평평하게 놓습니다. PBS에 대한 액세스를 제거합니다. 마지막으로, 유리 커버 슬립에 직접 장착 매체의 한 방울을 놓고 부드럽게 조각을 커버.골린 면역스테인링은 9일에서 10C57 블랙 6마리의 중성마우스로부터 얻은 조직형 소뇌슬라이스에서 11일 간 관찰되었으며, 전압 문이 있는 나트륨 채널에 농축된 로나비의 노드를 통해 11일 간 관찰되었으며, 편집증적 악소글리아 접합 도메인에 의해 측면이 있다. PLP-GFP 형질전환 마우스에 대해 동일한 결과가 관찰되었다. 파켄기 세포의 양수는 대부분 문화에서 1 주일 후에 달성된다.LPC 치료는 완전히 자발적으로 재myelinate 완전히 6 일 사후 탈근을 골라 진화 슬라이스를 demyelinates. 이 절차는 최대 25분이 소요됩니다. 그것은 정말 가장 중요한 포인트입니다.Organotypic 슬라이스 배양은 myelination 역학의 라이브 이미징 연구에 적합합니다. 그것은 또한 약물 선별 실험을 대상으로 사용할 수 있습니다. 이 기술은 근생 및 재분화 프로세스를 연구하기 쉬운 정량적 접근 방식을 허용합니다.실험자는 동물 복지, 과도하고 날카로운 신비에 적용되는 기본 안전 절차를 따라야합니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

의 연결을 부상을 검사에 대한 Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화 모델

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

연구

신경과학

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

슬라이스 준비, Organotypic 조직 Culturing과 Suprachiasmatic 핵의 시계 유전자 활동의 루시페라제 녹음

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic 소뇌 문화 : Apoptotic 도전과 감지

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

네크로 텍스의 Organotypic 슬라이스 준비에서 전체 셀 녹음

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

포스트 - 나탈 Murine 조직의 공동 문화를 Myelinating 풍부한 Oligodendrocyte 문화와 Oligodendrocyte / 신경 세포의 유도

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

배아 복부 Midbrain의 Organotypic 슬라이스 문화 : Dopaminergic의 연결을 개발 연구하는 시스템 체외에서</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Organotypic 슬라이스 문화의 Purkinje 세포 수지상의 형태학의 분석

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Organotypic 슬라이스는 문화 희소 돌기 아교 세포 역학 및 수초화을 공부하기

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

에서 신경 혈관 리모델링의 분석 Entorhino - 해마 Organotypic 슬라이스 문화

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...