Name: inhibition of aspergillus flavus growth and aflatoxin production in transgenic maize expressing the &#945;-amylase inhibitor from lablab purpureus l.
Uploaded: 2019-02-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inhibition of Aspergillus flavus Growth and Aflatoxin Production in Transgenic Maize Expressing the Î±-amylase Inhibitor from Lablab purpureus L. at JoVE.co

Wir danken David Meints, University of Arkansas für seine Hilfe bei der Entwicklung und Analyse von transgenem Mais während der frühen Generationen. Diese Arbeit erhielt die finanzielle Unterstützung des USDA-ARS CRIS-Projekts 6054-42000-025-00D. Erwähnung von Handelsnamen oder kommerzielle Produkte in diesem Artikel wird ausschließlich zum Zweck der Bereitstellung von spezifischen Informationen und bedeutet keine Empfehlung oder Billigung durch das US Department of Agriculture. USDA-ARS gleicher Beschäftigung Gelegenheit (EEO) Politik Mandate Chancengleichheit für alle Personen und verbietet Diskriminierung in allen Aspekten der Agentur Personalpolitik, Methoden und Erfahrungen.

(1) Plasmid Konstrukte und Mais transformation
<ol><li>PCR verstärkt Lablab AILP mithilfe der Primer 5'-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3 'und 5'-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3"einfügen. Die PCR-Bedingungen umfassen einen anfängliche Denaturierung Schritt bei 98 ° C für 30 s (Schritt 1), gefolgt von Denaturierung bei 98 ° C für 10 s (Schritt 2), Glühen bei 55 ° C für 30 s (Schritt 3), Dehnung bei 72 ° C für 20 s (Schritt 4), 31 Zyklen von Schritt 2 zu Schritt 4 , und eine endgültige Dehnung Schri...

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	<li>Ismaiel, A., Papenbrock, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycotoxins:+Producing+fungi+and+mechanisms+of+phytotoxicity.">Mycotoxins: Producing fungi and mechanisms of phytotoxicity.</a> Agriculture. 5 (3), 492-537 (2015).</li><li>Mitchell, N., Bowers, E., Hurburgh, C., Wu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+economic+losses+to+the+USA+corn+industry+from+aflatoxin+contamination.">Potential economic losses to the USA corn industry from aflatoxin contamination.</a> Food Additives &amp; Contaminants: Part A. 33 (3), 540-550 (2016).</li><li>Umesha, S., Manukumar, H. M., Chandrasekhar, B., Shivakumara, P., Shiva Kumar, J., Raghava, S., Avinash, P., Shirin, M., Bharathi, T. R., Rajini, S. B., Nandhini, M., Vinaya Rani, G., Shobha, M., Prakash, H. 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Ertragsverluste bei landwirtschaftlichen Nutzpflanzen durch Erreger und Schädlinge ist ein globales Problem-20. Derzeit, Anwendung von synthetischen Fungiziden und Pestiziden ist das vorherrschende Mittel für steuernde Anlage Krankheitserreger und Schädlinge, aber passives Toxizität von diesen Biochemikalien in Lebens- und Futtermitteln kann ernsthafte Bedrohung für die menschliche und tierische Gesundheit21darstellen. Angesichts der wirtschaftlichen Bedeutung der Mais...

Mykotoxinbelastungen durch die Pilz-Gattungen, Aspergillus, Fusarium, Penicilliumund Alternaria ist ein großes Problem der Lebensmittel und Futtermittel angebauten weltweit1,2,3. Unter diesen phytopathogenen Pilzen hat Aspergillus die höchsten negative Auswirkungen auf die Ernte Wert und die Gesundheit von Mensch und Tier. Aspergillus flavus (A. Flavus) ist eine opportunistische Pflanze-Erreger, die infiziert Öl reichen Ernten wie Mais, Baumwollsaat und Erdnuss und produziert die potente Karzinogene, Aflatoxine, sowie zahlreiche giftige sekundäre Pflanzenstoffe (SMs). Mais ist ein wichtiges Nahrungsmittel und Futtermittel weltweit angebaut und ist sehr anfällig für Verunreinigungen durch A. Flavus. Die wirtschaftliche Auswirkungen einer Aflatoxinkontamination auf verliert und Minderwert bei Mais kann so viel wie $ 686,6 Millionen/Jahr in den USA2 mit prognostizierten Veränderungen des globalen Klimas, die Auswirkungen von Aflatoxinen kann dazu führen, dass größere wirtschaftliche Verluste in Mais mit Schätzungen so hoch wie $ 1,68 Milliarden/Jahr in die nahe Zukunft2. Angesichts der wirtschaftlichen und gesundheitlichen Beeinträchtigungen von Aflatoxinen in Mensch und Tier, möglicherweise vor der Ernte Aflatoxin Kontrolle im Mais der effizienteste Weg zur Verhinderung von Aflatoxinkontamination in Lebensmitteln und Futtermitteln.
Die großen vor der Ernte Kontrollansatz für Aflatoxin Widerstand in Mais, der in den letzten Jahrzehnten eingesetzt hat ist in erster Linie durch Züchtung, die eine erhebliche Menge an Zeit4erfordert. Vor kurzem hatte Biocontrol einige Erfolge bei der Reduzierung der Aflatoxin in groß angelegte Feld Anwendungen5,6. Neben Biocontrol hatte Anwendung modernster molekularer Tools wie z. B. "Host induzierte Gen-Silencing" (HIGS) durch RNAi und transgene Ausdruck des Widerstands-assoziierte Proteine einige Erfolge bei der Reduzierung von A. Flavus Wachstum und aflatoxin Produktion in kleinem Maßstab Labor- und Studien. Diese Ansätze werden derzeit neben der Identifizierung von neuen potenziellen A. Flavus gen Zielen für zukünftige Manipulation optimiert.
Neben Gene, die Mykotoxinproduktion als potentielle Ziele von transgenen Kontrollstrategien direkt beteiligt sind, haben Pilze Amylasen gezeigt worden, um eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Pathogenese und Mykotoxin-Erfolgsproduktion in frühen Phasen der Host-Pflanze-Infektion. Ein paar Beispiele Pythium Pleroticum (kausaler Agent Ingwer Rhizom Fäulnis), Fusarium Solani (kausaler Agent der Blumenkohl willst), wo positive Korrelationen zwischen Pathogenität und α-Amylase Expression und Aktivität beobachtet 7,8. Hemmung der α-Amylase-Aktivität durch gen-Knockout oder Knockdown Ansätze wirkt sich negativ auf Pilz Wachstum und Toxin-Produktion. Ein α-Amylase-Ko-Mutante von A. Flavus konnte Aflatoxine wenn auf Stärke Substrat oder entkeimten Maiskörner9gewachsen zu produzieren. In Fusarium Verticillioides , keine α-Amylase Ko-Belastung während der Infektion von Maiskörnern10Fumonisin B1 (Mykotoxine) produzieren. In einer neueren Studie Gilbert Et Al. (2018) gezeigt, dass ein RNAi-basierten Knock down- A. Flavus α-Amylase Ausdrucksformen durch HIGS A. Flavus Wachstum und Aflatoxin Produktion während Maiskorn Infektion11 deutlich reduziert .
Spezifische Inhibitoren der α-Amylase-Aktivität haben auch ähnliche Ergebnisse produziert, wie Down-Regulierung der α-Amylase Ausdruck entnommen. Der erste Bericht über die Rolle der ein α-Amylase-Inhibitor in Pilzresistenz kamen aus der Isolierung und Charakterisierung von einer 14-kDa-Trypsin-α-Amylase-Inhibitor von Maislinien resistent gegen A. Flavus12. Weitere screening von mehreren hundert Pflanzenarten Fakhoury und Woloshuk führten zur Identifizierung eines 36-kDa α-Amylase-Inhibitor-ähnlichen Proteins (AILP) aus den Samen der Hyazinthe Bohnen, Lablab Purpureus L.13. Der Peptidsequenz AILP glich Lektine aus der Familie der Lektine – Arcelin – α-Amylase-Inhibitor berichtet gemeinsam Bohne14,15. Gereinigten AILP wird keine hemmende Aktivität gegenüber Säugetieren Trypsin und weitere in-vitro Charakterisierung zeigte deutliche Hemmung der A. Flavus Wachstum und conidial Keimung13aufweisen. Die Berichte hier eindeutig zeigt α-Amylase kann dienen als Target in der Steuerung Ansätze beschränken, Krankheitserreger oder Schädlinge, die abhängig von Stärke Mobilisierung (durch α-Amylase-Aktivität) und Erwerb der lösliche Zucker als Energiequelle während ihrer Pathogene Interaktion mit Wirtspflanzen.
Alpha-Amylase ist bekannt, dass kritische A. Flavus Pathogenität9,10,11, und angesichts der Bedeutung der AILP als ein potenter Anti-A. Flavus Agent (α-Amylase Hemmung/Antigrowth)13, Wir generierten transgene Maispflanzen mit dem Ausdruck Lablab AILP gen unter der konstitutiven CaMV-35 s-Promoter. Ziel war es zu untersuchen, ob heterologen Expression von dieser α-Amylase-Inhibitor in Mais gegen A. Flavus Pathogenese und Aflatoxin Produktion während Maiskorn Infektion wirksam ist. Unsere Ergebnisse zeigen, dass transgene Maiskörner mit dem Ausdruck AILP deutlich A. Flavus Wachstum und Aflatoxin Produktion während der Kernel-Infektion reduziert.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Caisson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amazing Marine Goop</td>
			<td>Eclectic Products</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch CFX96 Real-Time System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#160;5424 Microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask with stopper, 50 mL</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td>6999-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroQuant Afla</td>
			<td>Romer Labs</td>
			<td>COKFA1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-790-14E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Force Air Oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FQ-Reader</td>
			<td>Romer Labs</td>
			<td>EQFFM3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geno/Grinder 2010</td>
			<td>OPS Diagnostics</td>
			<td>SP 2010-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Innova 44 Incubator Shaker</td>
			<td>Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid Nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Form Griffin Beakers, 100 mL</td>
			<td>DKW Life Sciences</td>
			<td>14000-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for Plants</td>
			<td>Nexttec</td>
			<td>47N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Square BioAssay Dishes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>240835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phire Plant Direct PCR Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F130WH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Vials, 15 ml</td>
			<td>OPS Diagnostics</td>
			<td>PCRV 15-100-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap Cap, 22 mm</td>
			<td>DKW Life Sciences</td>
			<td>242612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrum Plant Total RNA Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>STRN50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Grinding Balls, 3/8&#39;&#39;</td>
			<td>OPS Diagnostics</td>
			<td>GBSS 375-1000-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy 4 Fluorometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V8 juice</td>
			<td>Campbell&#39;s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-820P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wrist-Action Shaker</td>
			<td>Burrell Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inhibition of aspergillus flavus growth and aflatoxin production in transgenic maize expressing the &#945;-amylase inhibitor from lablab purpureus l.

Aflatoxinkontamination in Nahrungs-und Futtermitteln ist eine große Herausforderung weltweit. Aflatoxine, produziert durch den Pilz Aspergillus Flavus (A. Flavus) sind potente Karzinogene, die Ernte Wert in Mais und andere Öl reiche Ernten wie Erdnuss neben posieren ernsthafte Bedrohung für die menschliche und tierische Gesundheit erheblich reduzieren. Unterschiedliche Ansätze, einschließlich der klassischen Züchtung, transgene Ausdruck von Widerstand verbunden sind Proteine und RNA-Interferenz (RNAi)-basierten Host-induzierte Gen-silencing von kritischen A. Flavus gen Ziele werden ausgewertet, um zu erhöhen Aflatoxin Widerstand in anfälligen Pflanzen. Frühere Studien haben gezeigt, dass eine wichtige Rolle in der Pathogenese und Aflatoxin Produktion A. Flavus , schlägt dieses Gen/Enzym α-Amylase ist ein potenzielles Ziel, A. Flavus Wachstum und Aflatoxin-Produktion zu reduzieren. In diesem Zusammenhang wurde die aktuelle Studie durchgeführt, um heterologen Expression (unter Kontrolle der konstitutiven CaMV 35 s -Promoter) eines Lablab Purpureus L. α-Amylase-Inhibitor-ähnlichen Proteins (AILP) im Mais gegen A. Flavusbewerten. AILP ist ein 36-kDa-Protein, das ist ein kompetitiver Inhibitor des Enzyms A. Flavus α-Amylase und gehört zur Familie der Lektine – Arcelin – α-Amylase-Inhibitor Protein gemeinsam Bohne. In-vitro-Studien vor der aktuellen Arbeit hatte die Rolle des AILP bei der Hemmung von A. Flavus α-Amylase-Aktivität und Pilzwachstum gezeigt. Pilzwachstum und Aflatoxin-Produktion in Reife Kerne wurden mit GFP exprimierenden A. Flavus Belastung in Echtzeit überwacht. Dieser Kernel screening Assay (KSA) ist sehr einfach einzurichten und bietet zuverlässige und reproduzierbare Daten auf Infektion und das Ausmaß der Ausbreitung, die quantifiziert werden konnte zur Beurteilung von Genetik und transgenen Linien. Die Fluoreszenz von den Strapazen der GFP ist eng korreliert, pilzartige Wachstum und durch Verlängerung, es ist gut für Aflatoxin-Werte korrelierten.  Das Ziel der aktuellen Arbeit war, dieses Vorwissen in ein kommerziell wichtigen Getreide wie Mais, Aflatoxin Widerstand erhöhen zu implementieren. Unsere Ergebnisse zeigen eine Ermäßigung von 35 % – 72 % A. Flavus Anstieg AILP exprimierenden transgener Maiskörner, die wiederum in einer 62 bis 88 % Verringerung Aflatoxin übersetzt.

Mais-Transformation und molekulare Screening von transgenen Pflanzen
Unreife Embryonen Hi-II-Maislinien verwandelten sich mit Agrobacterium Tumefaciens EHA101 Stamm, enthält die letzte Pflanze Ziel Vektor mit dem Ausdruck der Lablab Purpureus AILP gen unter der Kontrolle des CaMV- 35 s Promotor. Fünf unabhängig transformierte Maislinien wurden an die T6-Generation für nach...

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Inhibition of Aspergillus flavus Growth and Aflatoxin Production in Transgenic Maize Expressing the &#945;-amylase Inhibitor from Lablab purpureus L.

Hier präsentieren wir ein Protokoll um Aspergillus Flavus Wachstum und Aflatoxin in Maiskörner mit dem Ausdruck einer antimykotischen Proteins zu analysieren.  Mit GFP exprimierenden A. Flavus Belastung überwacht wir die Infektion und die Ausbreitung des Pilzes in Reife Kerne in Echtzeit. Der Test ist schnell, zuverlässig und reproduzierbar.

Hemmung der Aspergillus Flavus Wachstum und Aflatoxin in transgenen Mais mit dem Ausdruck der α-Amylase-Inhibitor von Lablab Purpureus L.

Aflatoxin contamination in food and feed crops is a major challenge worldwide. Aflatoxins, produced by the fungus Aspergillus flavus (A. flavus) are ...

Hier präsentieren wir einen einfachen Kernel-Screening-Test, um Aspergillus flavus Wachstum und Aflatoxin-Produktion in Maiskernen zu analysieren, die ein antimykotisches Protein exdrücken. Mit einem grünen fluoreszierenden Protein, das aspergillus flavus Stamm exdrückt, überwachen wir die Infektion und Ausbreitung des Pilzes in reifen Kernen in Echtzeit. Dieser einfache Test bietet ein zuverlässiges Mittel zur Bewertung der Fähigkeit des Maiskerns, aspergillus flavus Infektion und Aflatoxin-Produktion zu widerstehen.Die Ergebnisse dieses Labor-Assays, der unter kontrollierten Bedingungen an ausgereiften Kernen durchgeführt wird, korrelieren gut mit den Ergebnissen einer Infektion unter Feldbedingungen. Demonstriert wird das Verfahren von Dr.Rajtilak Majumdar, einem Postdoc aus unserem Labor, zusammen mit Christine Sickler und David Ambrosio, Bio-Technikern auch aus unserem Labor. Zu Beginn kleben Sie 20 zwei mm Fangkappen in eine Petrischale, um KSA-Kappen zu erstellen.Lassen Sie den Kleber für 48 Stunden trocknen, bevor Sie die Kappen verwenden. In einem biologischen Sicherheitsschrank sprühen Sie eine quadratische Bioassayschale mit 70% Ethanol in Wasser. Lassen Sie die Schalenluft trocknen.Steriles Chromatographiepapier in das trockene Fach geben. Neun der KSA-Kappen mit 70% Ethanol besprühen und an der Luft trocknen lassen. Dann legen Sie die Kappen auf das Bioassay-Tablett.Wählen Sie für jede getestete transgene Maislinie 20 unbeschädigte Kerne aus und legen Sie sie in ein 50 ml Zentrifugenrohr. Wählen Sie mit einem Tisch-Stereomikroskop nur unbeschädigte Kerne für den Test aus. Beschädigte Kerne sind anfälliger für Aspergillus-Angriffe und produzieren mehr Aflatoxin, wodurch die Ergebnisse verzerrt werden und nicht die wahren antimykotischen oder antimikrobiellen Eigenschaften der Sorte darstellen.Fügen Sie 70% Ethanol in jede Röhre. Lassen Sie die Kerne vier Minuten lang sterilisieren und gelegentlich sanft schütteln. Danach das Ethanol vorsichtig abgießen und die Kerne in sterilem entionisiertem Wasser dreimal sanft abspülen.Erhalten Sie eine sechstägige Kultur von Aspergillus flavus Fleck 70 aus, die GFP ausdrückt, die auf V8-Medium angebaut werden. 20 ml steriles 0,02%Triton X-100 in entionisiertem Wasser hinzufügen. Und verwenden Sie eine sterile Schleife, um die Sporen abzukratzen.Pipette aus dem Inokulum und übertragen Sie es in ein 300 ml steriles Becherglas. Bereiten Sie eine fünffache Verdünnung mit 0,02%Triton X-100 vor und verwenden Sie ein Hämozytometer, um eine Sporenzahl durchzuführen. Bei Bedarf erneut verdünnen, um 100 ml mit einer Konzentration von vier Millionen Sporen pro ml zu erhalten.Gießen Sie das Inokulum in ein leeres Becherglas. Die Kerne in einen sterilen 300 ml Becher mit Rührstange geben und drei Minuten rühren. Mit Zangen übertragen Sie die Kerne auf die Bioassay-Schale und stellen sicher, dass nur ein Kernel in jede Kappe platziert wird.Fügen Sie 30 ml entionisiertes Wasser auf den Boden jedes Bioassay-Tabletts. Und sieben Tage lang bei 31 Grad Celsius brüten. Nach sieben Tagen Impfung mit A.flavus, fotografieren Sie vier Kerne, die für mikroskopische Analyse und Fotografie bestimmt wurden.Verwenden Sie dann ein Weichgewebe und entionisiertes Wasser, um das Äußere der Kerne zu reinigen. Führen Sie Längsschnitte von Kernen durch und fotografieren Sie sofort unter dem Fluoreszenzmikroskop. Um die Kerne für die Analyse vorzubereiten, reinigen Sie die Außenseite der verbleibenden Kerne mit einem Weichgewebe und entionisiertem Wasser.Legen Sie vier Kerne, die einen Rep bilden, in eine 15 ml Schraubverschluss-Polycarbonat-Durchstechflasche mit zwei Edelstahlkugeln. Die Fläschchen sofort in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei 80 Grad Celsius lagern, bis sie mit der weiteren Verarbeitung und Analyse fertig sind. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie die Kerne aus dem Gefrierschrank und verwenden Sie einen Homogenisator, um sie drei Minuten lang bei 1500 Umdrehungen pro Minute zu mahlen.Verwenden Sie die gleichen Bodenmaterialien für die GFP-Analyse, die Aflatoxin-Bestimmung und die molekulare Analyse, so dass alle Werte repräsentativ für die Proben sind. Während mindestens drei Replikationen empfohlen werden, ist mehr immer besser, abhängig von der Verfügbarkeit von qualitativ hochwertigen Kerneln. In dieser Studie werden unreife Embryonen von Mais-HI-II-Linien mit dem Agrobacterium tumefaciens EHA101-Stamm transformiert, der den endgültigen Pflanzenzielvektor enthält, der das Lablab purpureus AILP-Gen unter der Kontrolle des 35S-Promotors aus dem Blumenkohl-Mosaikvirus ausdrückt.Die PCR-Verstärkung des Ziel-AILP-Gens zeigte ein 548 bp Amplikon, das nur in den transgenen Maislinien beobachtet wurde. Das AILP-Gen zeigte Expression in den transgenen Linien, während in den Kontrollpflanzen keine AILP-Expression beobachtet wurde. Keimsporen im Frühstadium sind 20 Stunden lang rohen Blattextrakten aus jungen transgenen Maispflanzen ausgesetzt.Die hohe Gesamtlänge von Sporen, die transgenen Blattextrakten ausgesetzt sind, zeigen eine Reduktion von 58 bis 80 % im Vergleich zur Negativkontrolle. Der verwendete A.flavus-Stamm enthält einen GFP-Reporter, der die Überwachung und Quantifizierung des Pilzwachstums in Echtzeit ermöglicht. In transgenen AILP-Kernen wird eine signifikante Reduktion der GFP-Fluoreszenz im Vergleich zur isogenen Negativkontrolle beobachtet.Bei den AILP-Linien vier und fünf, 69 % bzw. 72 % ist ein deutlicher Rückgang des Pilzwachstums zu verzeichnen. Die anderen Zeilen zeigen eine Reduktion von 35 bis 60% im Vergleich zu den Kontrollkernen. In den AILP-Kernen wurde eine Reduktion des Aflatoxingehalts um 62 bis 88 % im Vergleich zur Kontrolle beobachtet.Linie 4 hat mit 486 ng pro g den niedrigsten Aflatoxingehalt, gefolgt von anderen Zeilen, die in den Kernen einen Gehalt zwischen 640 und 1498 ng pro g hatten. Nach diesem Verfahren können zusätzliche Methoden durchgeführt werden, wie z. B. die Verwendung eines Fluorometers zur Quantifizierung von GFP und als Pilzwachstum. Immunbasierte kommerzielle Kits oder HPLC oder EPLC können verwendet werden, um Aflatoxin-Quantifizierung durchzuführen.Die Verfügbarkeit von KSA bietet eine schnelle und einfache Möglichkeit, die Beständigkeit gegen Aflatoxinkontamination zu bestimmen. Die verschiedenen Maiszuchtlinien lassen sich mit dieser Technik schnell beurteilen. Während der Kernel-Screening-Test nicht gefährlich ist, sollte der Bediener sich vor der Exposition gegenüber Aspergillus flavus Sporen schützen, geeignete Schutzausrüstung verwenden.

Research

JoVE Journal

Environment

Inhibition of Aspergillus flavus Growth and Aflatoxin Production in Transgenic Maize Expressing the &#945;-amylase Inhibitor from Lablab purpureus L.

Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

Massenproduktion von gentechnisch veränderten Aedes aegypti für Feldfreisetzungen in Brasilien

New techniques and methods are being sought to try to win the battle against mosquitoes. Recent advances in molecular techniques have led to the ...

Forschung

Umwelt

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Bestimmung mikrobieller extrazelluläre Enzymaktivität in Wasser, Böden und Sedimente mit hohem Durchsatz Mikrotiterplatten-Assays

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

Optimieren Rauchgas Einstellungen, um Mikroalgen in Photobioreaktoren Wachstum über Computer-Simulationen fördern

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

Methods for Facilitating Microbial Growth on Pulp Mill Waste Streams and Characterization of the Biodegradation Potential of Cultured Microbes

The kraft process is applied to wood chips for separation of lignin from the polysaccharides within lignocellulose for pulp that will produce a high ...

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

RNAi-vermittelten Kontrolle der Aflatoxine in Peanut: Methode, um Mykotoxinproduktion und Transgenexpression in der Erdnuss-Analyse /<em&gt; Aspergillus</em&gt; Pathosystem

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Extraktion und Analyse von Microbial Phospholipidfettsäuren in Böden

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

A Gusseted Thermogradient Table to Control Soil Temperatures for Evaluating Plant Growth and Monitoring Soil Processes

Ein Gusseted Thermogradient Tabelle zur Bekämpfung von Bodentemperaturen für das Pflanzenwachstum Beurteilung und Überwachung von Bodenprozessen

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a ...

Production and Measurement of Organic Particulate Matter in the Harvard Environmental Chamber

Herstellung und Messung von organischen Partikeln in der Harvard-Klimakammer

The production and the evolution of atmospheric organic particulate matter (PM) are insufficiently understood for accurate simulations of atmospheric ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Die Pflanze-Infektion-Test: Spray und Wunde-vermittelten Inokulation mit Pflanzen Pathogen Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize (Zea mays L.)

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize Zea mays L.

Hochdurchsatz-Microscale Protokoll für die Analyse der Verarbeitungsparameter und ernährungsphysiologischen Eigenschaften in Mais (Zea Mays L.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole ...