Kombinerede nukleotid og Protein ekstraktioner i Caenorhabditis elegans

Ved hjælp af denne protokol til at fjerne variationen mellem stikprøven kan det give indsigt i differentialreguleringen af makromolekyler baseret på uoverensstemmelserne mellem mRNA og proteinniveauerne inden for stikprøven. Brug af den samme prøve til at isolere DNA, RNA, og protein er et forsøg på at reducere variabilitet, forbedre reproducerbarhed, og lette fortolkning. Fordelene omfatter sparet tid og ressourcer på tidspunktet for indsamling af prøver og tværsnitsanalyse af værdifulde og begrænsede prøver.

Til at begynde, frø 1,000 orm æg i en 10 centimeter plade med passende vækstbetingelser. Inkubere ved 20 grader Celsius i 72 timer. Derefter vaskes pladen med 5 milliliter M9-buffer, og overfør 1.000 voksne orme ind i et rør.

Centrifuge ormene ved 1,000 g i et minut, kassér supernatant, og overføre pelleterede orme, med en milliliter M9 buffer, til en 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør. Centrifuge igen ved 845 g i et minut og kassér det meste af supernatanten. Opbevar de pelleterede orme på minus 80 grader Celsius i mere end fire timer.

Fjern derefter enhver supernatant fra den optøede pellet. Tilsæt en milliliter koldt GTCP reagens, bland godt ved pipettering op og ned og læg prøven på is i 10 minutter. Derefter tilsættes 200 mikroliter af kold kloroform.

Rørrys kraftigt i 15 sekunder rystes kraftigt i 15 sekunder, og det efterlades ved stuetemperatur i tre minutter. Dernæst centrifuge røret ved 13, 500 g ved fire grader Celsius i 15 minutter. Med en mikropipette overføres det klare øverste lag til et nyt RNase-frit 1,5 milliliter mikrocentrifugerør.

Overfør det overskyede hvide interfaselag til et nyt rør mærket B2 og overfør det lyserøde lag, fra den resterende pellet, til et nyt rør mærket B og læg begge på is. Det kan være svært at adskille de tre lag. Jeg anbefaler at overføre det overskyede interfaselag til sit eget rør i stedet for at udfælde DNA'et fra dette lag fra det organiske eller lyserøde lag.

For at isolere RNA tilsættes først 500 mikroliter på 100% isopropanol til rør A for at udfælde RNA'et. Derefter inkuberes røret ved stuetemperatur i 10 minutter. Efter inkubation, centrifuge røret ved 13, 500 g ved fire grader Celsius i 10 minutter.

Dernæst kassere supernatant og tilsæt en milliliter 75% ethanol til rør A for at vaske pellet. Centrifuge røret ved 5, 300 g ved fire grader Celsius i fem minutter. Kassér supernatanten og lad pelletluften tørre i fem til 10 minutter.

Tilsæt 50 mikroliter RNase-frit vand for at rekonstituere pellet af RNA og inkubere pellet ved 55 til 60 grader Celsius i 10 minutter for at opløse den. Endelig skal du bruge et spektrofotometer til at måle koncentrationen af det isolerede RNA ved 260 nanometer og til at identificere eventuelle urenheder ved 230 og 280 nanometer. For at isolere DNA'et tilsættes først 300 mikroliter på 100% ethanol til den organiske fase i rør B og til det overskyede hvide lag i rør B2 for at udfælde DNA'et, blandes ved inversion og lade rørene ved stuetemperatur i to til tre minutter.

Derefter centrifuge rør B og B2 ved 376 g ved fire grader Celsius i fem minutter til pellet DNA. Kombiner supernatanten fra rør B og B2 i et nyt to milliliterrør mærket C og lad det blive på is for efterfølgende proteinisolering. Dernæst vaskes DNA-pellet i rør B2 med en milliliter 0,1 molarnatriumcitrat i 10% ethanol i 30 minutter.

Centrifugerør B2 ved 376 g ved fire grader Celsius i fem minutter. Gentag vasketrinnet, og pelleten skal derefter sættes på igen i 1,5 milliliter 75 %ethanol, og den skal efterlades ved stuetemperatur i 20 minutter. Dernæst centrifuge rør B2 ved 376 g ved fire grader Celsius i fem minutter og derefter kassere supernatant og lad pellet tørre i fem til 10 minutter.

Pellet opløses i 150 mikroliter på otte milliliter natriumhydroxid. Derefter centrifuge prøven ved 376 g ved fire grader Celsius i fem minutter. Endelig, med en mikropipette, overføre supernatant, der indeholder DNA til et nyt rør.

Brug et spektrofotometer til at måle koncentrationen af det isolerede DNA ved 260 nanometer og til at identificere eventuelle urenheder ved 230 og 280 nanometer. For at udfælde proteinet tilsættes først op til 1,5 milliliter 100% isopropanol til det lyserøde supernatant i rør C, blandes ved at vende flere gange og inkubere ved stuetemperatur i 10 minutter. Derefter centrifuge rør C ved 13, 500 g ved fire grader Celsius i 10 minutter.

Supernatanten kasseres, og pellets vaskes med to milliliter 0,3 molar guanidinhydrochlorid i 95%ethanol i 20 minutter ved stuetemperatur. Centrifuge røret igen ved 5, 300 g ved fire grader Celsius i fem minutter og gentag vasketrinnet som før. Overfør proteinpellet til et nyt 1,5 milliliterrør mærket C2 og tilsæt op til 1,5 milliliter 95% ethanol, vortex, og lad det sidde ved stuetemperatur i 20 minutter.

Centrifuge røret ved 5, 300 g ved fire grader Celsius i fem minutter. Kassér supernatanten og lad pellet tørre ved stuetemperatur i 10 minutter. Derefter opløse pellet i 300 mikroliter af 5% SDS ved 50 grader Celsius i 60 minutter.

Endelig centrifuge røret ved 13, 500 g ved 17 grader Celsius i 10 minutter. Og overfør supernatanten, der indeholder proteinet, til et nyt rør. Sådan udføres en kvantitativ omvendt transskription PCR.

Brug først et nanogram af det isolerede RNA til at forberede cDNA ved omvendt transskription. For at gøre en bestand plade af cDNA, tilsættes 100 mikroliter af en til 100 fortyndinger af hver cDNA prøve til individuelle brønde af en 96 brønd plade, omfatter passende kontroller, såsom vand-only brønde og serielt fortyndet prøver, at etablere primer effektivitet for hvert gen. For at lave en master mix for hvert sæt primere, tilføje op til syv mikroliter vand, en DNA-intercalating cyanid farvestof, og fem mikro-molar hver af fremad og tilbage primere.

Tilføj syv mikroliter af master mix til de relevante brønde af en RT-qPCR plade. Derefter tilsættes tre mikroliter af cDNA fra lagerpladen og køre pladen ved hjælp af en RT-qPCR protokol egnet til primere, der anvendes. RT-qPCR analyse af isolerede mRNA'er fra fire uafhængige prøver af tre ormestammer blev udført for at bekræfte de mål, der blev identificeret ved RNA seq-analyse.

F07C4.12 genet blev upregulated i begge analyser i spise-2 orme, men dens opregulering i rsks-1 orme blev ikke opdaget af RT-qPCR assay. Også, RNA seq opdaget udtryksændringer af mrp-1 i spise-2 og rsks-1 orme blev bekræftet via RT-qPCR. Upregulering eller ned-regulering af organelle markør gener i mutant orme blev også opdaget ved RT-qPCR analyse.

Sammenligning af GTCp versus RIPA-udvundet protein i orme adskilt af SDS side og farves med coomassie blå viste en lignende kvalitet med bedre opløsning af større proteiner til GTCp-udvundet proteiner. Western blot analyse viste lignende proteinniveauer i de fleste tilfælde;men, proteiner større end 75 kilodalton viste lavere niveauer i RIPA-udvundet protein. Sammenligningen mellem mål mRNA og proteinniveauer fra fire individuelle prøver af tre ormestammer viste en lav variation af mRNA-niveauerne med større variation på proteinniveau.

I forbindelse med DNA-isolering er udbyttet stærkt afhængig af færdighederne til at genvinde det overskyede interfaselag fra det organiske eller lyserøde lag. For at forbedre opløseligheden af proteiner fra pellet øge mængden af resolubilization buffer eller tilføje andre rengøringsmidler udover SDS kan være nødvendigt. Ved hjælp af denne metode kan hjælpe korrekt identificere tilfælde, hvor oversættelse af mRNA til protein ikke er corelative og kan føre til dybere undersøgelse af post-transskriptionelle og post-translationelle reguleringsmekanismer under forskellige betingelser.

I vores laboratorium er denne protokol blevet brugt til at bevare værdifulde og tidsbegrænsede kerneprøver. Desuden kan jeg forestille mig, at dette ville være en nyttig protokol at vedtage inden for døgnrytmeområdet. GCTP-reagenset og opløsningsmidler, der anvendes i RNA-isolationen, er farer og bør anvendes med forsigtighed.