Name: combined nucleotide and protein extractions in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-03-17T14:00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

L.R.L. werd gefinancierd door subsidies van de NIH/NIA (R00 AG042494 en R01 AG051810), een Glenn Foundation for Medical Research Award voor onderzoek naar biologische mechanismen van veroudering en een Junior Faculty subsidie van de Amerikaanse Federatie voor veroudering onderzoek. De auteurs bedank Anita Kumar en Shi Quan Wong voor hun nuttige feedback in het schrijven van dit manuscript.

Opmerking: Elke stap van de neerslag macromolecule wordt uitgevoerd achtereenvolgens, gevolgd door wast gedaan gelijktijdig; het is echter raadzaam om te voltooien van het RNA-isolement eerst als het is intrinsiek onstabiel.
1. sample collectie
<ol><li>Beënt 1.000 worm eieren per 10 cm plaat met passende groei voorwaarden19. Incubeer bij 20 ° C gedurende 72 uur. Opmerking: Bleekmiddel ei-bevattende volwassenen om te verzamelen van eieren zoals eerder beschreven19.</li>
	<li>Wassen van de plaat met circa 5 mL M9 buffer en verzamel 1.000 volwassen wormen in een buis. Opmerking: M9 buffer is samengesteld uit 35 mM natriumfosfaat dibasische, natriumchloride 102 mM, 22 mM kalium fosfaat monobasisch en 1 mM magnesiumsulfaat in steriel water19.</li>
	<li>Centrifugeer de wormen bij 1.000 x g gedurende 1 min, verwijder het supernatant en de Ingehuld wormen met 1 mL M9 buffer overbrengen in een tube van 1,5 mL microcentrifuge.</li>
	<li>Centrifugeer nogmaals bij 845 x g voor 1 min en negeren de meeste van de bovendrijvende substantie. Bewaar de Ingehuld wormen bij-80 ° C gedurende ten minste 4 uur. Opmerking: Met behulp van een bevroren pellet produceert een hoger rendement dan een verse pellet. Een reeks van vorst/dooi cycli met gebruik van vloeibare stikstof of 95% ethanol op droog ijs voor spleet naar de worm cuticle wordt aanbevolen als een verse pellet gebruikt. Het verlaten van een kleine hoeveelheid van de M9 op de pellet zal helpen de cuticle breken wanneer bevriezing.</li>
</ol>2. nucleotide en isolatie van de eiwit
<ol><li>De bovendrijvende vloeistof verwijderen uit de ontdooide pellet en voeg 1 mL koude GTCp reagens. Meng goed door pipetteren omhoog en omlaag. Leg het monster op het ijs gedurende 10 minuten staan en meng het af en toe door te draaien aan het ondersteboven. Let op: Fenol is zeer giftig, bijtend en neurotoxische en chemische brandwonden en blindheid kan veroorzaken. Opmerking: We gebruikten maximaal 5.000 volwassen wormen als het uitgangsmateriaal gemelde hoeveelheden; elk volume is gebaseerd op het gebruik van 1 mL van GTCp reagens. Wanneer u een ruimere steekproef, kan het nodig aan schaal omhoog zijn.</li>
	<li>Voeg aan de oplossing van wormen en GTCp, 200 µL van koude chloroform. Houd de buis tussen de vingers en schud krachtig voor 15 s. laat het op kamertemperatuur (RT) gedurende 3 minuten. Let op: Chloroform is een giftig irriterende huid zweren en andere orgel-gerichte schade kan veroorzaken en is mogelijk kankerverwekkend.</li>
	<li>Centrifugeer de buis bij 13.500 x g gedurende 15 min bij 4 ° C. Opmerking: Drie lagen worden gevormd na deze spin: boven, heldere waterige fase, de bodem, roze organische fase en de kleine, bewolkt interfase die lipiden en DNA bevat.</li>
	<li>Met behulp van een micropipet, de duidelijk toplaag (waterige fase) verplaatsen naar een nieuwe RNase-vrije 1,5 mL microcentrifuge buis (buis A) te isoleren van RNA via alcohol neerslag (zoals beschreven in stap 2.5) en verplaats de roze laag (organische fase) van de resterende pellet naar een nieuwe buis ( buis B) en plaats deze op het ijs. Opmerking: De roze organische fase kan worden bevroren bij-80 ° C tot de isolatie van DNA en eiwit uit dit voorbeeld. Grotere monsters zal produceren een dikke witte laag tussen de waterige en organische fase. Dit gedeelte bevat DNA. Als deze laag kan worden verwijderd zonder verstoring van de andere fasen, doen en zet het in een aparte buis (buis B2).</li>
	<li>
Isoleren RNA als volgt.
	<ol>
<li>Neerslag van de heldere waterige fase in buis A, het RNA met 500 µL van 100% isopropanol. Incubeer gedurende 10 min op RT. Vervolgens, centrifuge buis A bij 13.500 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Opmerking: Een kleine witte pellet van RNA moet worden weergegeven aan de onderkant van de buis.</li>
		<li>Decanteren in de meerderheid van de bovendrijvende substantie. Verwijderen van de rest met een spuit van 1 mL met een naald en verwijder het supernatant. Opmerking: De grootte van de naald is niet belangrijk; echter, zal een grotere naald gauge bieden meer controle om niet de pellet te verstoren. Een micropipet kan worden gebruikt als de naalden zijn niet beschikbaar.</li>
		<li>1 mL van 75% ethanol toevoegen aan buis A bij het wassen van de pellet. Draai de buis bij 5300 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.</li>
		<li>Verwijder het supernatant uit de pellet door decanteren en met behulp van een injectiespuit 1 mL met een naald, zoals beschreven in stap 2.5.2 en verwerp het.</li>
		<li>Laat de pellet gedurende 5-10 min. drogen, maar laat het overdry niet. Gebruik 50 µL RNase-gratis water om te reconstrueren van de pellet van RNA, voordat het wordt volledig transparant. Opmerking: Dit is een voldoende startende volume van 1000 – 3000 wormen, maar het moet mogelijk worden aangepast afhankelijk van hoeveel grondstof werd gebruikt.</li>
		<li>Incubeer de pellet bij 55-60 ° C gedurende 10 min te ontbinden.</li>
		<li>Het meten van de concentratie en de zuiverheid voor het gebruik van een spectrofotometer. Opnemen van verticaal absorptie op 260 nm voor RNA concentratie en 230 en 280 nm tot het identificeren van alle onzuiverheden.</li>
		<li>Reinig het RNA als u wilt verwijderen van eventuele verontreinigingen, zoals fenol residu of DNA, met kolom zuivering of latere ethanol wast en DNase behandeling. Opmerking: Op dit punt, de RNA is klaar om te worden verzonden voor RNAseq analyse of kan worden gebruikt voor het maken van cDNA te gebruiken voor RT-qPCR (zie punt 3.1 voor details). RNA kan worden opgeslagen bij-80 ° C tot verder gebruik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isoleren DNA als volgt.
	<ol>
<li>Van de roze organische fase in buis B en het monster in de buis B2, eventuele neerslag het DNA door het toevoegen van 300 µL van 100% ethanol en meng door inversie. Laat de sproeibuis(-buizen) op RT voor 2-3 min.</li>
		<li>Centrifugeer buizen B en B2 op 375 x g gedurende 5 minuten bij 4 ° C tot pellet DNA.</li>
		<li>Verplaatsen van het supernatant van buizen B en B2 door gieten het in een nieuwe 2 mL tube (buis C) en laat het op ijs voor latere eiwit isolatie. Wassen van de DNA-pellet in buis B of B2 met 1 mL 0,1 M Natriumcitraat in 10% ethanol voor 30 min. Centrifuge buizen B en B2 op 375 x g gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Opmerking: Natrium bindt aan de ruggengraat van DNA, DNA gemakkelijker overhaaste maken in Natriumcitraat en ethanol, waardoor onzuiverheden worden verwijderd door centrifugeren van de lage snelheid.</li>
		<li>Herhaal de stap van wassen zoals beschreven in stap 2.6.3. Resuspendeer de pellet in 1,5 mL 75% ethanol en laat het op RT gedurende 20 minuten, onder af en toe omzwenken door upending.</li>
		<li>Centrifuge buis B en B2 op 375 x g gedurende 5 minuten bij 4 ° C.</li>
		<li>Verwijder het supernatant en laat ze drogen voor 5-10 min.</li>
		<li>Los de pellet in 150 µL van 8 mM natriumhydroxide-oplossing. Aanpassen aan de gewenste pH met HEPES indien nodig. Draai het monster bij 375 x g gedurende 5 minuten bij 4 ° C.</li>
		<li>Met behulp van een micropipet, verplaats het supernatant (DNA) naar een nieuwe buis. Meten van de concentratie en bepalen de zuiverheid voor het gebruik van een spectrofotometer. Opnemen van verticaal absorptie op 260 nm voor DNA-concentratie en op 230 en 280 nm tot het identificeren van alle onzuiverheden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isoleren eiwit als volgt.
	<ol>
<li>Om de neerslag van het eiwit, tot 1,5 mL voor 100% isopropanol toevoegen aan het roze supernatant in buis C, Meng door meerdere keren, omkeren en Incubeer bij RT gedurende 10 min.</li>
		<li>Centrifugeer buis C bij 13.500 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.</li>
		<li>Verwijder het supernatant en wassen van de pellet met 2 mL 0,3 M guanidine waterstofchloride in 95% ethanol voor 20 min op RT. centrifugebuis C bij 5300 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.</li>
		<li>Herhaal de stap wassen zoals beschreven in stap 2.7.3 2 x.</li>
		<li>De eiwit-pellet naar een nieuwe 1,5 mL tube (buis C2) en voeg tot 1,5 mL 95% ethanol. Vortex en laat het zitten op RT voor 20 min.</li>
		<li>Centrifugeer buis C2 bij 5300 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en laat de pellet drogen 10 min op RT. Los de pellet in 300 µL van 5% SDS bij 50 ° C gedurende 60 minuten. Opmerking: Een langere incubatietijd mogelijk moet volledig los van de eiwit-pellet. In het verleden heeft de pellet is geïncubeerd voor maximaal 6 uur zonder in te boeten op kwaliteit.</li>
		<li>Centrifugeer buis C2 bij 13.500 x g gedurende 10 minuten bij 17 ° C. De bovendrijvende vloeistof verplaatst naar een nieuwe buis.</li>
		<li>Het meten van de concentratie met behulp van een voorkeur eiwit kwantificering assay die compatibel is met wasmiddel. Opmerking: Het eiwit is klaar om te worden gebruikt in SDS-pagina en het westelijke bevlekken. Het kan worden opgeslagen bij-20 ° C voor toekomstig gebruik. Voor andere technieken, zoals LC-MS/MS, zal het wasmiddel moet worden dialyzed uit.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. evaluatie van mRNA en eiwitniveaus
<ol><li>
RT-qPCR
	<ol>
<li>Bereiden van cDNA door omgekeerde transcriptie met 1 ng van RNA, met behulp van de volgende thermocycler protocol: priming (5 min bij 25 ° C), omgekeerde transcriptie (20 min bij 46 ° C), en RT inactivatie (1 min bij 95 ° C).</li>
		<li>Maak een voorraad plaat van cDNA door 100 µL 1:100 verdunningen van elk monster cDNA aan individuele wells van een 96-wells-plaat toe te voegen. Omvatten passende controles, zoals geen sjabloon/alleen water putten en serieel verdunde monsters van 1:25 1:400 (ontstaan met gebundelde cDNA van alle van de monsters geanalyseerd) te voorzien van een standaard curve om primer efficiëntie voor elk gen geanalyseerd. Opmerking: Deze indeling kan worden gebruikt met de 96-Wells-microdispenser, die het mogelijk voor de overdracht van alle monsters in een bord naar een plaat RT-qPCR en voor het tegengaan van de goed-te-goed pipetting variaties maakt. De juiste master mix (bijvoorbeeld, SYBR + inleidingen) kan worden toegevoegd aan elk goed daarna met een meerkanaalspipet. Over het geheel genomen is deze aanpak vermindert fouten geïntroduceerd als hand-pipetting elk monster, waardoor de verdere variabiliteit.</li>
		<li>Voeg 3 µL van cDNA van de voorraad plaat aan de putjes van de plaat RT-qPCR.</li>
		<li>Het maken van een master mix voor elke reeks inleidingen met 1 x supermix met een DNA-intercalating cyanine kleurstof, 5 µM voor forward en reverse inleidingen, en water maximaal 7 µL per monster. 7 µL toevoegen aan de juiste putjes van de plaat van een RT-qPCR en doorroeren licht te mengen. Opmerking: Nemen van monsters voor het meten van de huishouding genen te gebruiken als een verwijzing naar het normaliseren van de resultaten-20.</li>
		<li>Voer de plaat met een RT-qPCR-protocol dat is geschikt voor de inleidingen worden gebruikt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Westelijke vlek Opmerking: Raadpleeg voor gedetailleerde informatie over westelijke vlekken, Mahmood en Yang21.<ol>
<li>Monsters voorbereiden door SDS-pagina door het combineren van 20 µg van eiwit met een gelijk volume van 2 x Laemmli monster Buffer en kook bij 95 ° C gedurende 10 min.</li>
		<li>Laden van de monsters op een 4%-15% Tris-glycine gel en draaien ze op 150 V gedurende 1 uur of totdat de kleurstof voorkant bereikt de onderkant van de gel.</li>
		<li>Eiwitten van de gel overbrengen naar een membraan van het nitrocellulose op 25 V gedurende 30 min. in een apparaat semidry overdracht.</li>
		<li>Bevestig de juiste overdracht door de kleuring van het membraan met Ponceau S vlek.</li>
		<li>Grondig wassen de vlek van het membraan met Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) met 0,01% Polysorbaat 20 (TBS-T).</li>
		<li>Blokkeren van het membraan met 5% nonfat melk in TBS-T voor 1 h op RT.</li>
		<li>Incubeer de membraan in het primaire antilichaam bij de juiste verdunning overeenkomstig de aanbevelingen van de leverancier. Laat het op de rocker bij 4 ° C's nachts.</li>
		<li>Wassen van het membraan 3 x, voor elk, 5 min met TBS-T.</li>
		<li>Incubeer het membraan in de passende secundair antilichaam bij de juiste verdunning overeenkomstig de aanbevelingen van de leverancier. Vertrek op voort naar de rocker gedurende 1 uur op RT.</li>
		<li>Wassen van het membraan 3 x, voor elk, 5 min met TBS-T.</li>
		<li>Beeld en kwantificeren van de westelijke vlek, met behulp van aangewezen methodes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rotroff, D. M., Motsinger-Reif, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embracing+Integrative+Multiomics+Approaches.">Embracing Integrative Multiomics Approaches.</a> International Journal of Genomics. 2016, 1715985 (2016).</li><li>Chen, R., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promise+of+personalized+omics+to+precision+medicine.">Promise of personalized omics to precision medicine.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: System Biology and Medicine. 5 (1), 73-82 (2013).</li><li>Anderson, L., Seilhamer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+selected+mRNA+and+protein+abundances+in+human+liver.">A comparison of selected mRNA and protein abundances in human liver.</a> Electrophoresis. 18 (3-4), 533-537 (1997).</li><li>Harvald, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-omics+Analyses+of+Starvation+Responses+Reveal+a+Central+Role+for+Lipoprotein+Metabolism+in+Acute+Starvation+Survival+in+C.+elegans.">Multi-omics Analyses of Starvation Responses Reveal a Central Role for Lipoprotein Metabolism in Acute Starvation Survival in C. elegans.</a> Cell Systems. 5 (1), (2017).</li><li>Griffin, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+profiling+of+gene+expression+at+the+transcriptome+and+proteome+levels+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Complementary profiling of gene expression at the transcriptome and proteome levels in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cell Proteomics. 1 (4), 323-333 (2002).</li><li>Greenbaum, D., Colangelo, C., Williams, K., Gerstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+protein+abundance+and+mRNA+expression+levels+on+a+genomic+scale.">Comparing protein abundance and mRNA expression levels on a genomic scale.</a> Genome Biology. 4 (9), 117 (2003).</li><li>Lapierre, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TFEB+orthologue+HLH-30+regulates+autophagy+and+modulates+longevity+in+Caenorhabditis+elegans.">The TFEB orthologue HLH-30 regulates autophagy and modulates longevity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 4, 2267 (2013).</li><li>Doherty, C. J., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+control+of+global+gene+expression+patterns.">Circadian control of global gene expression patterns.</a> Annual Reviews Genetics. 44, 419-444 (2010).</li><li>Goya, M. E., Romanowski, A., Caldart, C. S., Benard, C. Y., Golombek, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+identified+in+Caenorhabditis+elegans+by+in+vivo+long-term+monitoring+of+a+bioluminescent+reporter.">Circadian rhythms identified in Caenorhabditis elegans by in vivo long-term monitoring of a bioluminescent reporter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113 (48), E7837-E7845 (2016).</li><li>Dalvin, L. A., Fautsch, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Circadian+Rhythm+Gene+Expression+With+Reference+to+Diurnal+Pattern+of+Intraocular+Pressure+in+Mice.">Analysis of Circadian Rhythm Gene Expression With Reference to Diurnal Pattern of Intraocular Pressure in Mice.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (4), 2657-2663 (2015).</li><li>Narayanan, A., Jacobson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+studies+of+protein+regulation+by+post-translational+phosphorylation.">Computational studies of protein regulation by post-translational phosphorylation.</a> Current Opinion in Structural Biology. 19 (2), 156-163 (2009).</li><li>Swatek, K. N., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+modifications.">Ubiquitin modifications.</a> Cell Research. 26 (4), 399-422 (2016).</li><li>Cech, T. R., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+noncoding+RNA+revolution-trashing+old+rules+to+forge+new+ones.">The noncoding RNA revolution-trashing old rules to forge new ones.</a> Cell. 157 (1), 77-94 (2014).</li><li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction.">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).</li><li>Triant, D. A., Whitehead, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Extraction+of+High-Quality+RNA+and+DNA+from+Small+Tissue+Samples.">Simultaneous Extraction of High-Quality RNA and DNA from Small Tissue Samples.</a> Journal of Heredity. 100 (2), 246-250 (2009).</li><li>Liu, X., Harada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Isolation+from+Mammalian+Samples.">RNA Isolation from Mammalian Samples.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).</li><li>Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+solubilization+of+proteins+after+TRIzol+extraction+of+RNA+and+DNA+from+patient+material+following+prolonged+storage.">Isolation and solubilization of proteins after TRIzol extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage.</a> Biotechniques. 42 (4), 467-470 (2007).</li><li>Kopec, A. M., Rivera, P. D., Lacagnina, M. J., Hanamsagar, R., Bilbo, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+solubilization+of+TRIzol-precipitated+protein+permits+Western+blotting+analysis+to+maximize+data+available+from+brain+tissue.">Optimized solubilization of TRIzol-precipitated protein permits Western blotting analysis to maximize data available from brain tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 280, 64-76 (2017).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Hoogewijs, D., Houthoofd, K., Matthijssens, F., Vandesompele, J., Vanfleteren, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+and+validation+of+a+set+of+reliable+reference+genes+for+quantitative+sod+gene+expression+analysis+in+C.+elegans.">Selection and validation of a set of reliable reference genes for quantitative sod gene expression analysis in C. elegans.</a> BMC Molecular Biology. 9 (1), 9 (2008).</li><li>Mahmood, T., Yang, P. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blot:+technique,+theory,+and+trouble+shooting.">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).</li><li>Peach, M., Marsh, N., MacPhee, D. J., Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+solubilization:+Attend+to+the+choice+of+lysis+buffer.">Protein solubilization: Attend to the choice of lysis buffer.</a> Protein Electrophoresis: Methods and Protocols. , 37-47 (2012).</li><li>Lakowski, B., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+caloric+restriction+in+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 95 (22), 13091-13096 (1998).</li><li>Pan, K. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+mRNA+translation+extends+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">Inhibition of mRNA translation extends lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 6 (1), 111-119 (2007).</li><li>Gaudet, P., Livstone, M. S., Lewis, S. E., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic-based+propagation+of+functional+annotations+within+the+Gene+Ontology+consortium.">Phylogenetic-based propagation of functional annotations within the Gene Ontology consortium.</a> Briefings in Bioinformatics. 12 (5), 449-462 (2011).</li><li>Broeks, A., Gerrard, B., Allikmets, R., Dean, M., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologues+of+the+human+multidrug+resistance+genes+MRP+and+MDR+contribute+to+heavy+metal+resistance+in+the+soil+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Homologues of the human multidrug resistance genes MRP and MDR contribute to heavy metal resistance in the soil nematode Caenorhabditis elegans.</a> The EMBO Journal. 15 (22), 6132-6143 (1996).</li><li>Hadwiger, G., Dour, S., Arur, S., Fox, P., Nonet, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Monoclonal+Antibody+Toolkit+for+C.+elegans.">A Monoclonal Antibody Toolkit for C. elegans.</a> PLoS One. 5 (4), e10161 (2010).</li><li>Kostich, M., Fire, A., Fambrough, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+molecular-genetic+characterization+of+a+LAMP/CD68-like+protein+from+Caenorhabditis+elegans.">Identification and molecular-genetic characterization of a LAMP/CD68-like protein from Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Cell Science. 113 (14), 2595 (2000).</li><li>Firestein, B. L., Rongo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DLG-1+is+a+MAGUK+similar+to+SAP97+and+is+required+for+adherens+junction+formation.">DLG-1 is a MAGUK similar to SAP97 and is required for adherens junction formation.</a> Molecular Biology of the Cell. 12 (11), 3465-3475 (2001).</li><li>Heschl, M. F., Baillie, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+hsp70+multigene+family+of+Caenorhabditis+elegans.">Characterization of the hsp70 multigene family of Caenorhabditis elegans.</a> DNA. 8 (4), 233-243 (1989).</li><li>Yoneda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartment-specific+perturbation+of+protein+handling+activates+genes+encoding+mitochondrial+chaperones.">Compartment-specific perturbation of protein handling activates genes encoding mitochondrial chaperones.</a> Journal of Cell Science. 117 (18), 4055 (2004).</li><li>Takahashi, M., Iwasaki, H., Inoue, H., Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+Genetic+Analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+26S+Proteasome+Subunits+by+RNA+Interference.">Reverse Genetic Analysis of the Caenorhabditis elegans 26S Proteasome Subunits by RNA Interference.</a> Biological Chemistry. 383, 1263 (2002).</li><li>Le Bot, N., Tsai, M. C., Andrews, R. K., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAC-1,+a+regulator+of+microtubule+length+in+the+C.+elegans+embryo.">TAC-1, a regulator of microtubule length in the C. elegans embryo.</a> Current Biology. 13 (17), 1499-1505 (2003).</li><li>McQuary, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+S6K+Mutants+Require+a+Creatine-Kinase-like+Effector+for+Lifespan+Extension.">C. elegans S6K Mutants Require a Creatine-Kinase-like Effector for Lifespan Extension.</a> Cell Reports. 14 (9), 2059-2067 (2016).</li><li>Larance, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Proteomics+Analysis+of+the+Response+to+Starvation+in+C.+elegans+.">Global Proteomics Analysis of the Response to Starvation in C. elegans .</a> Molecular and Cell Proteomics. 14 (7), 1989-2001 (2015).</li><li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+energy+metabolism+contributes+to+the+extended+life+span+of+calorie-restricted+Caenorhabditis+elegans.">Enhanced energy metabolism contributes to the extended life span of calorie-restricted Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (37), 31414-31426 (2012).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Methoden voor Biomolecuul isolatie, zoals DNA, RNA en eiwitten zijn vaak geoptimaliseerd zonder technische overlapping of combinaties. Dit is met name nadelig wanneer monsters moeilijk zijn te verkrijgen, die kan leiden tot het oogsten van monsters onder dezelfde voorwaarden op verschillende tijdstippen. Afhankelijk van de cellulaire routes, duplo's verzameld op verschillende tijdstippen kunnen het genereren van variatie. Dit manuscript biedt een procedure om te omzeilen deze hindernis doordat de gelijktijdige isolatie en zuivering van elke Biomolecuul van hetzelfde monster van wormen, vermindering van de veranderingen die zijn aangebracht door andere isolatie technieken, de timing van de oogst van de steekproef, of ongelijke oogsten. Deze variabelen besturen niet alleen bespaart tijd en middelen, maar vergemakkelijkt ook de reproduceerbaarheid. Hier, we blijk geven van een combinatorische aanpak die compromitterende RNA en eiwitten de kwaliteit vermijdt, zij het met variabele resultaten met DNA. Preparaten kunnen verder worden geoptimaliseerd met behulp van DNA reinigingsprocedures. We toonden de aanpak met behulp van materiaal uit de nematode C. elegans en HeLa cellen.
Vorige werk verkennen van de transcriptome en Proteoom van N2 WT dieren en eten-2 en rsks-1 mutants hebben aangeboden inzicht in verschillende trajecten, met inbegrip van mechanismen die levensduur4,34,35 verlengen ,,36. In een poging om de onderzoeken van het mechanisme van calorie beperking in het verlengen van de levensduur, hebben een stabiele isotoop labelen door/met aminozuren in cel cultuur (SILAC) analyse gevonden dat eten-2 wormen een totale Downregulatie van globale eiwitsynthese 36. de hier gepresenteerde gegevens is in overeenstemming met deze bevinding, zelfs als de mRNA niveaus van dezelfde doelstellingen zijn sterk toegenomen. Een andere groep gericht op het identificeren van de effectoren S6K-gemedieerde lange levensduur en dus uitgevoerd een proteomic scherm van rsks-1 wormen34. Uit de RNAseq gegevens gevonden met de huidige studie, we geïdentificeerd ten minste drie genen die met eiwitten geïdentificeerd vanuit dit scherm bevestigen; MRP-1 en homologen van CPA en neuroligin (F07C4.12) werden ontdekt als het differentieel wordt uitgedrukt in rsks-1 wormen in vergelijking met WT N234.
De gegevens die zijn gegenereerd met behulp van deze methode is in overeenstemming met vorige multiomic onderzoeken. De mRNA niveaus van negen doelen werden gebruikt voor het voorspellen van de eiwitniveaus in elk monster. Van deze doelstellingen had veel voorspelbare eiwitniveaus op basis van de mRNA niveaus. Niettemin waren er opmerkelijke discrepanties tussen de niveaus van mRNA en eiwit. Nog belangrijker is, kunt het protocol gepresenteerd hier wetenschappers vol vertrouwen evalueren en interpreteren van deze verschillen doordat intersample variabiliteit door het verzamelen van mRNA en eiwit uit hetzelfde monster. Bovendien, vergeleken we de mRNA niveaus aan de eiwitniveaus verzameld uit hetzelfde monster of verzameld uit een monster van het soortgelijk maar verschillend geoogst met RIPA. We toonden dat voor een aantal van de doelstellingen, er waren veel lagere niveaus van proteïne in het RIPA-geëxtraheerde monster. Zonder controle voor de intersample variatie, zou het onmogelijk zijn om te weten of dit verschil te wijten aan de differentiële regulering van mRNA en eiwit was.
Het is belangrijk om in gedachten houden dat er zijn protocollen geoptimaliseerd specifiek voor deze verschillende macromoleculen, dus als een transversale analyse niet het uiteindelijke doel van het experiment is, dan zou het relevant is voor deze methoden in plaats daarvan gebruiken. Met behulp van GTCp te isoleren van DNA en eiwit zorgt ervoor dat ze worden minder oplosbaar, vereisen de reconstitutie van DNA in een zwakke base, bijvoorbeeld NaOH, en solubilizing van de proteïne in een buffer met een hoge concentratie van wasmiddel met Verwarming, op het risico van onvolledige solubilisatie. Daarnaast GTCp bevat guanidinium kaliumthiocyanaat en zure fenol, die inactiveert de enzymen zoals proteasen, maar zal langzaam eiwit degraderen na verloop van tijd tenzij bevroren. Het zal worden aan het oordeel van de onderzoeker om te beslissen als de omzeiling van deze beperkingen zal de moeite waard.
Nog belangrijker is, bij het werken met RNA een steriele techniek, houden van het monster op ijs, tenzij anders vermeld, en het gebruik van verkrijgbare decontaminatie wordt reagens aanbevolen de RNA om intact te houden. Met name moet grotere monsters meer GTCp om mee te beginnen, waarin elke extractievloeistof moet ook worden opgeschaald. Dit protocol vereist niet handmatige homogenisering van de worm of cel monsters wanneer de juiste hoeveelheid GTCp wordt gebruikt. In het kader van DNA isolatie is de opbrengst sterk afhankelijk van de vaardigheid om te herstellen van de organische (roze) laag. Ten slotte, ter verbetering van de solubilisatie van eiwitten tijdens isolatie, verhoging van de omvang van de buffer van de resolubilization of het toevoegen van andere detergentia naast SDS kan nodig zijn. Proteïnen van een volwassene alleen bevolking van wormen in plaats van een mengsel van volwassenen, larven en eieren zijn inderdaad veel makkelijker om te resolubilize.
Over het geheel genomen met behulp van dit protocol biedt een geïntegreerde aanpak voor Biomolecuul isolatie en vergemakkelijkt de interpretatie van correlaties, of het ontbreken daarvan, tussen mRNA en proteïne niveaus die voortvloeien kunnen uit afzonderlijk oogsten biomoleculen uit verschillende monsters. Met deze methode kan helpen wetenschappers om te identificeren correct gevallen waar de vertaling van mRNA naar eiwit is niet nodig en kan leiden tot het dieper onderzoek van posttranscriptional en posttranslationele regulerende mechanismen onder verschillende omstandigheden.

Multiomics, de analytische aanpak die gebruikmaakt van een combinatie van omics, zoals genoom, Proteoom, transcriptoom, epigenome, microbiome of lipidome, is steeds populairder geworden bij de verwerking van grote gegevenssets voor ziekte karakterisering1, 2. Montage van bewijsmateriaal heeft aangetoond dat beperking van benaderingen tot een enkel "ome" een onvolledige moleculaire analyse geeft (herzien door Rotroff en Motsinger-Reif1). Grote gegevenssets worden gegenereerd, met name bij het uitvoeren van schermen met behulp van high-throughput technieken, maar om een volledig beeld te schilderen of te identificeren van de meest relevante doelstellingen, multiomic benaderingen zijn te verkiezen boven. Met het gebruik van multiomics benaderingen is er echter de frequente waarneming van verschillen tussen mRNA en proteïne niveaus3,4,5,6. Met name worden mRNA en eiwit gebruikt voor side-by-side transcriptomic en Proteoom analyses met RNA sequencing (RNAseq) en vloeibare chromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS), respectievelijk, vaak verkregen op dezelfde manier behandeld monsters van verschillende replicaten, potentieel invoering van variatie tussen dezelfde voorwaarden3,4,5,6. Harvald et al. een elegant uitgevoerd C. elegans honger tijdsverloop studie die ten opzichte van de transcriptome en Proteoom van wild-type (WT) wormen aan die van de mutant wormen hlh-30 , dat het gebrek aan een belangrijk transcriptiefactor ouder 7. van de nota, het RNA en eiwitten zijn geoogst uit de dezelfde voorwaarde replicaten, dus niet uit hetzelfde monster. Hun bevindingen tonen een lage correlatie tussen de mRNA niveaus en eiwitniveaus op elk tijdstip (r = 0.559-0.628). In feite, hun heatmap vier clusters gevormd: Cluster ik had een grote afname van de mRNA niveaus maar weinig of geen afname van de overeenkomstige eiwitniveaus, Cluster II had weinig of geen toename in mRNA niveaus, maar een toename van de eiwitniveaus, Cluster III had een verhoging in mRNA niveaus, maar een afname van de eiwitniveaus en Cluster-IV had een toename van de mRNA niveaus maar alleen een subtiele verandering in proteïne niveaus4. Bovendien kan deze intersample variatie in gevallen waar de monsters van dezelfde voorwaarde niet worden verzameld op precies hetzelfde moment worden ingevoerd. Bijvoorbeeld, schommelen mRNA en eiwitten de circadiane cyclus geregeld, afhankelijk van de tijd van dag8,9, of, meer in het bijzonder de Gasbedwelming met behulp van C. elegans lichte9; expressie van deze circadiane proteïnen kan oplopen tot 8 h na gen expressie inductie10. Niettemin, de prevalentie van deze vaststelling betekent niet noodzakelijkerwijs dat het verkeerd is; in feite, kan dit blijken te zijn informatief. Eiwit en mRNA zijn in een voortdurende dynamische staat tussen de vorming en afbraak. Eiwitten zijn bovendien vaak posttranslationally bewerkt te verhogen stabiliteit of voor het opwekken van hun afbraak11. Bijvoorbeeld, kan hun ubiquitination-status leiden tot activering of gericht aan de proteasoom of lysosoom voor afbraak12. Bovendien spelen noncoding RNAs een belangrijke rol bij het reguleren van de genexpressie in het transcriptionele en posttranscriptional fase13. De vraag is dus hoe de variabelen om te bevestigen dat de verschillen die we in deze nematode studies waarnemen echte zijn beperken.
Hier stellen wij een methode die door de intersample variabele verwijderd doordat analyses van verschillende macromoleculen uit hetzelfde monster. Het doel van dit protocol is te bieden een methode om consequent isoleren van DNA, RNA en eiwitten uit een enkele monster van C. elegans (ook wormen genoemd) in een poging om te verminderen van variatie, verbetering van de reproduceerbaarheid, en vergemakkelijken van interpretaties. Extra voordelen van het gebruik van hetzelfde monster omvatten de besparing van tijd en middelen tijdens sample collectie, vergemakkelijking van de transversale analyse van waardevolle en beperkte monsters, met inbegrip van soorten die moeilijk te groeien en te handhaven, en het verkrijgen van inzicht in de differentiële regulering van macromoleculen gebaseerd op intrasample verschillen in mRNA en proteïne niveaus.
Deze methode is geschikt voor de beoordeling van gene expressies en eiwitniveaus van een enkelvoudige steekproef van wormen, waardoor voor een uitgebreidere evaluatie van meerdere niveaus van moleculaire verwerking. Guanidinium kaliumthiocyanaat-fenol-chloroform (GTCp) reagens14, een veel gebruikte chemische stof te isoleren van RNA, wordt gebruikt voor de winning van nucleïnezuren en proteïnen uit de wormen, met verdere neerslag, wassen en solubilisatie van elk. Dit protocol is een compilatie van verschillende protocollen15,16 met kleine wijzigingen, ontworpen met een focus op C. elegans, maar we hebben ook met succes geïsoleerd RNA, eiwitten en DNA uit een pellet van HeLa cellen na de dezelfde stappen. Hoewel hier niet getest, is dit protocol waarschijnlijk werken op weefsels alsmede17,18.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#8211;15% Mini-PROTEAN&#174; TGX Stain-Free&#8482; Protein Gels</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>4568084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CePAS7-s</td>
			<td>DHSB- U of Iowa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CeTAC1-s</td>
			<td>DHSB- U of Iowa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DLG1-s</td>
			<td>DHSB- U of Iowa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRP78</td>
			<td>Novus Bio.</td>
			<td>NBp1-06274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP Goat Anti-Mouse</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-80010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP Goat Anti-Rabbit</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>92680011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSP60-s</td>
			<td>DHSB- U of Iowa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LMP1-s</td>
			<td>DHSB- U of Iowa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRP-1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuroligin 3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab172798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-actin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1501R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc MP Imaging System</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C298-500</td>
			<td>Health hazard, Irritant, Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue</td>
			<td>ThermoSci</td>
			<td>20279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Protein assay</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>500-0116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoch 2 microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (200 proof)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>04-355-223</td>
			<td>Flammable, health hazard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td>BSL2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1708840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydra microdispenser: Matrix Hydra</td>
			<td>Robbins/ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A516-4</td>
			<td>Flammable, health hazard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 buffer: 
			3 g KH2PO4 
			6 g Na2HPO4 
			5 g NaCl 
			Add H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving. 
			After solution cools down, add 1 mL sterile 1 M MgSO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli Sample Buffer (2x)</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>ThermoSci</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE apparatus</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J60744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>25 nmole DNA Oligo with Standard Desalting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dlg-1: F (5&#39;-GGTCCTACCA GGCAGTTGAG-3&#39;) 
			 R (5&#39;-CACGTCCGTT AACCTCTCCC-3&#39;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hsp-4: F (5&#39;-AGAGGGCTTT GTCAACCCAG-3&#39;) 
			 R (5&#39;-TCGTCAGGGT TGATTCCACG-3&#39;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hsp-70: F (5&#39;-CGGCATGTGA ACGTGCTAAG-3&#39;) 
			 R (5&#39;-GAGCAGTTGA GGTCCTTCCC-3&#39;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hsp-60: F (5&#39;-ATTGAGCAAT CGACGAGCGA-3&#39;) 
			 R (5&#39;-CAACACCTCC TCCTGGAACG-3&#39;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lmp-1: F (5&#39;-ACAACAACAC CGGACTCACG-3&#39;) 
			 R (5&#39;-ATCGAGCTCC CACTCTTTGG-3&#39;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tac-1: F (5&#39;-AGTGGCAGGC AAAGTTCCTC-3&#39;) 
			 R (5&#39;-TGAGCACCTT GATCTCGTCG-3&#39;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pas-7: F (5&#39;-GTACGCTCAA AAGGCTGTCG-3&#39;) 
			 R (5&#39;-CTGAATCGGC ATTGGCTCAC-3&#39;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mrp-1: F (5&#39;-TTTGCCTTGC GCTTGTTCTG-3&#39;) 
			 R (5&#39;-AGTTCCAGTG CGGAGCATAC-3&#39;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F07C4.12: F (5&#39;-TGCTGAGCAT GAAGGACTGT-3&#39;) 
			 R (5&#39;-TGGCAATAGC TCCTCCGTTG-3&#39;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HK Actin: F (5&#39;-CTACGAACTT CCTGACGGACAAG-3&#39;) 
			 R (5&#39;-CCGGCGGACT CCATACC-3&#39;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HK cyn-1: F (5&#39;-GTGTCACCAT GGAGTTGTTC-3&#39;) 
			 R (5&#39;-TCCGTAGATT GATTCACCAC-3&#39;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HK nhr-23: F (5&#39;-CAGAAACACT GAAGAACGCG-3&#39;) 
			 R (5&#39;-CGATCTGCAG TGAATAGCTC-3&#39;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HK ama-1: F (5&#39;-TGGAACTCTG GAGTCACACC-3&#39;) 
			 R (5&#39;-CATCCTCCTT CATTGAACGG-3&#39;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HK cdc-42: F (5&#39;-CTGCTGGACA GGAAGATTACG-3&#39;) 
			 R (5&#39;-CTCGGACATT CTCGAATGAAG-3&#39;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HK pmp-3: F (5&#39;-GTTCCCGTGT TCATCACTCAT-3&#39;) 
			 R (5&#39;-ACACCGTCGA GAAGCTGTAGA-3&#39;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 96 qPCR machine</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer: 10 mM Tris-Cl (pH 8.0) 
			1 mM EDTA 
			1% Triton X-100 
			0.2% SDS 
			140 mM NaCl 
			1 tablet of Roche protease inhibitor per 20 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Supermix</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1725274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Femto Max Sens Substrate</td>
			<td>ThermoSci</td>
			<td>34095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Transfer apparatus</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer Pack</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>170-4159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Health hazard (skin, eyes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm strains:</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 (wild type)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eat-2 (MAH95)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rsks-1 (VB633)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined nucleotide and protein extractions in caenorhabditis elegans

Een enkele biologische steekproef heeft een overvloed aan informatie, en het is nu gebruikelijk om te onderzoeken gelijktijdig verschillende macromoleculen te vangen een volledig beeld van de verschillende niveaus van moleculaire verwerking en wijzigingen tussen verschillende omstandigheden. Dit protocol stelt de methode van het isoleren van DNA, RNA en eiwit uit hetzelfde monster van de nematode Caenorhabditis elegans te verwijderen van de variatie ingevoerd wanneer deze biomoleculen zijn geïsoleerd van replicatieonderzoeken voor op dezelfde manier behandeld maar uiteindelijk verschillende monsters. Nucleïnezuren en proteïnen worden geëxtraheerd uit de nematode met behulp van de zure guanidinium kaliumthiocyanaat-fenol-chloroform extractiemethode, met verdere neerslag, wassen en solubilisatie van elk. Laten we het succesvolle isolement van RNA, DNA en eiwit uit één sample uit drie stammen van nematode en HeLa cellen, met betere resultaten van de isolatie van de eiwit in volwassen dieren. Bovendien verbetert guanidinium kaliumthiocyanaat-fenol-chloroform-geëxtraheerde eiwit van nematoden de resolutie van grotere proteïnen, met verbeterde detecteerbare niveaus zoals waargenomen door immunoblotting, in vergelijking met de traditionele RIPA winning van eiwit.
De methode die hier gepresenteerd is handig bij het onderzoeken van de monsters met behulp van een multiomic aanpak, specifiek voor de verkenning van de Proteoom en transcriptome. Technieken die gelijktijdig multiomics beoordelen zijn aantrekkelijk omdat moleculaire signalering onderliggende complexe biologische fenomenen wordt verondersteld te treden bij aanvullende niveaus; het is echter steeds vaker te zien dat veranderingen in mRNA niveaus niet altijd met dezelfde wijziging in eiwitniveaus overeen komen en dat de tijd van de collectie relevant in de context van circadiane verordeningen is geworden. Deze methode verwijdert elke intersample variatie bij het analyseren van verschillende inhoud binnen hetzelfde monster (intrasample.)

De eiwitten, RNA en DNA-monsters werden geanalyseerd en representatieve resultaten met behulp van de isolaten van RNA en eiwitten zijn hier gepresenteerd. Daarnaast vergelijken wij de eiwitSteekproef geoogst met behulp van de methode van de GTCp tot en met de gemeenschappelijke RIPA lysis methode22. We hebben voor ons experiment, vier onafhankelijke replicatieonderzoeken van elke WT (N2) wormen en twee langlevende mutant wormen, eten-2 en rsks-123,24gebruikt.
RNA en DNA kwantiteit en kwaliteit
De concentratie van RNA wanneer in water 50 µL geresuspendeerde varieerden van 0,2-2 µg/µL, met behulp van ongeveer 3.000 volwassen wormen als grondstof. De absorptie ratio's, die wijzen op zuiverheid, varieerden van 2.0 naar 2.2 voor A260/A280 en 1,9 tot en met 2.5 voor A260/A230 (tabel 1), met vermelding van de succesvolle extractie van RNA zonder besmetting met GTCp onderdelen, zoals fenol of guanidine hydrochloride.
De DNA-extractie was succesvol, maar de kwaliteit was variabele. De concentratie van het DNA als in 150 µL van NaOH varieerden van 0.04 tot 1.1 µg/µL geresuspendeerde. De verhoudingen van de extinctie varieerden van 1,8 tot 2.1 voor A260/A280 en 0,9 tot 1,6 voor A260/A230 (tabel 1), met vermelding van de succesvolle extractie van DNA; echter, sommige van de monsters besmet waren met GTCp componenten, zoals fenol of guanidine hydrochloride. DNA isolatie nodig is, zorg moet worden genomen bij het scheiden van de middelste laag van de GTCp fase-separatie zichtbaar als meer wast kunnen het nodig zijn.
RT-qPCR van de geselecteerde doelen
Het isoleren van het RNA van vier onafhankelijke steekproeven van elke worm stam was succesvol en werd gestuurd voor de analyse van de RNAseq, met latere RT-qPCR uitgevoerd met behulp van een supermix met een kleurstof cyanine. Doelstellingen geanalyseerd door RT-qPCR werden geselecteerd uit een grote dataset van de RNAseq op basis van de meest differentieel gereglementeerde genen gemeenschappelijk in beide mutanten in vergelijking met de WT-wormen. F07C4.1225, een homolog naar menselijke neuroligin 3, isovorm b, was het doelwit van de geselecteerde gedeelde upregulated. We zijn ook opgenomen met een differentieel gereglementeerde gen tussen beide mutanten, mrp-126, voor aanvullende analyse, die upregulated in eten-2 wormen maar werden in rsks-1 wormen was. Expressie veranderingen van mrp-1 werden bevestigd via RT-qPCR; de opregulatie van de F07C4.12 in rsks-1 wormen voorspeld door de analyse van de RNAseq werd echter niet gezien door RT-qPCR (Figuur 1).
Aanvullende doelstellingen met antilichamen gevalideerd voor wormen werden eveneens onderzocht. Deze omvatten verschillende organel markeringen gekenmerkt in Hadwiger et al.27. Een aantal van deze markeringen waren differentieel uitgedrukt op het niveau van de mRNA in de mutant wormen. Zoals te zien in Figuur 1, werden lmp-128 en dlg-129 upregulated in eten-2 wormen; HSP-4 30, hsp-7030en lmp-1 waren upregulated in rsks-1 wormen; HSP-60 31 en pas-732 waren werden in eet-2 wormen; HSP-60 en tac-133 waren werden in rsks-1 wormen.
Simultaan vs. RIPA eiwit voorbereiding
Om te bevestigen de efficiëntie en de kwaliteit van het eiwit met de GTCp-methode zoals hierboven beschreven, we ten opzichte van het eiwit verzameld met behulp van de meer traditionele methode van RIPA lysis22. Met behulp van dezelfde hoeveelheid grondstof, namelijk alleen voor volwassenen (ongeveer 10.000 worms) of een gemengde bevolking van volwassenen, larven en eieren (ongeveer 130.000 worms), was de totale hoeveelheid verzameld met GTCp minder wanneer geresuspendeerde in gelijk einde volumes (tabel 1 ); echter, de extractie van een volwassene alleen bevolking was succesvoller dan uit een gemengde populatie. Bovendien is de kwaliteit van de eiwitten was vergelijkbaar, zij het eiwit GTCp-geëxtraheerde een betere resolutie voor grotere proteïnen op gelijke laden van totale eiwitten, toonde zoals blijkt uit Coomassie vlek in Figuur 2. Inderdaad, doelstellingen beoordeeld door westelijke vlek in Figuur 3 vergelijkbare niveaus toonde in de meeste gevallen; de eiwitten groter dan 75 kDa toonde echter lagere niveaus in het RIPA-geëxtraheerde eiwit in vergelijking met de GTCp-geëxtraheerde proteïne (figuur 3A, rechter rijstrook; Figuur 3B, gele balk).
De hier gepresenteerde extractiemethode is ook in de lijn van zoogdiercellen HeLa geëvalueerd. Ter referentie, de hoeveelheid eiwit met RIPA geëxtraheerd uit een compacte pellet van zes miljoen HeLa cellen (een pellet ~ 25 µL) was vergelijkbaar is met die geëxtraheerd uit een 130.000 gemengde populatie van worms (een ~ 75 µL compacte pellet), of ongeveer de helft van wat wordt gewonnen uit 10.000 volwassen wormen (een ~ 100 µL zwaartekracht aanleiding geven tot afwikkeling pellet), zoals te zien in tabel 1. We laten zien dat de efficiëntie van eiwit extractie (tabel 1) en de resolutie van grotere proteïnen (Figuur 2) werd verlaagd in GTCp ten opzichte van RIPA-geëxtraheerde eiwit in HeLa cellen, suggereren dat deze techniek werkt beter in een volwassen bevolking van wormen. De onvolledige solubilisatie van de pellet eiwit uit GTCp-geëxtraheerde HeLa eiwitten mogelijk een beperking van deze methode in zoogdiercellen.
Immunoblotting doelstellingen geanalyseerd door RT-qPCR
We onderzochten vervolgens de eiwitniveaus van de gene producten getest door RT-qPCR om te bepalen als de mRNA niveaus gecorreleerd met de eiwitniveaus. Zoals in Figuur 3zien, de gemiddelde expressie veranderingen van eiwit gecorreleerd met de gemiddelde mRNA expressies veranderd voor veel doelen; Sommige eiwitniveaus deed echter niet overeen met de veranderingen in mRNA niveaus. Vaak de mRNA niveaus in eet-2 wormen waren hoger dan in de andere stammen, maar de eiwitniveaus werden deze gelijk of lager dan de andere soorten van hetzelfde doel. De meest opmerkelijke waarneming werd de zeer hoge niveaus van dlg-1 mRNA in eet-2 wormen, die niet naar meer eiwit vertalen deed; in feite, waren er dlg-1 eiwit lager in vergelijking met de andere stammen (Figuur 3).
Tot slot de niveaus in het GTCp-geëxtraheerde eiwit en het eiwit RIPA-geëxtraheerde toonde een opvallende verschil. Het RNA werd gewonnen op dezelfde manier voor zowel; echter verminderd het gelijksoortige maar afzonderlijke monster verzameld door lysis van de RIPA bleek aanzienlijk eiwitniveaus, vooral voor personen groter dan 75 kDa (figuur 3A, rechter rijstrook; Figuur 3B, gele balk).
Intrasample vergelijking van mRNA en proteïne niveaus
Een van de doelstellingen van dit protocol was om te bepalen als de variatie die we zagen op de mRNA en eiwit niveau echt was, of als het zou een artefact van intersample variatie. In Figuur 4, werd een subset van doelen binnen de monsters vergeleken. Elk afzonderlijke monster wordt weergegeven als de dezelfde tint en kleur van de stip, met voorbeeld 1 de donkerste schaduw en sample 4 worden als de lichtste grijstint (WT), blauw (eten-2) of rood (rsks-1). Binnen de meeste monsters was er een lage variabiliteit van de mRNA niveaus, met grotere variabiliteit op het niveau van eiwit, een potentiële fout van de semikwantitatieve analyse western blots. Wanneer we kijken naar de positie van elk van de gekleurde stippen tussen de mRNA en eiwit pairs, de volgorde van hoogste-aan-laagste vaak niet overeenkomen met; bijvoorbeeld, was de volgorde van de mRNA hsp-60 in WT, proef 4, 3, 2, 1, maar de eiwitniveaus waren 1, 2, 3 of 4. Dus, tussen mRNA en proteïne niveaus binnen een steekproef zeker verschillen, maar de onderhavige methode gebruikers toestaat om te verwijderen van de tijd van de collectie als een mogelijke bron van het geobserveerde verschil.
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59178/59178table1.jpg"> Tabel 1: concentraties en absorptie ratio's. RNA- en DNA-concentraties en zuiverheid ratio's werden gemeten op een spectrofotometer. Eiwit concentraties werden bepaald met behulp van een colorimetrische eiwit kwantificering assay. De grijs, blauw en rood markeren de monsters gebruikt voor RT-qPCR en westelijke vlek. De geel geeft monsters gewend GTCp te vergelijken met RIPA eiwit extractie of worm eiwit aan HeLa proteïne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59178/Table_1.xlsx">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59178/59178fig1.jpg"> Figuur 1: gen-expressie door RT-qPCR. RT-qPCR analyse voor de mRNA die volgens deze methode, verkregen streefcijfers vastgesteld van RNAseq gegevens en van organel markers bevestigen. De foutbalken vertegenwoordigen standaardafwijking; n = 4. De concentratie van mRNA werd gedefinieerd tegen een standaard curve voor elke reeks inleidingen. Alle mRNA niveaus werden genormaliseerd naar het gemiddelde van een set van zes huishouding genen gebruikt als referentie genen, waaronder wet-1, cdc-42, ama-1, nhr-23, pmp-3en cyn-1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59178/59178fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59178/59178fig2.jpg"> Afbeelding 2: vergelijking van GTCp-versus RIPA-geëxtraheerde eiwit in wormen en HeLa cellen. Totaal eiwit van wild-type (WT) wormen of HeLa cellen geoogst via GTCp of RIPA lysis methode, gescheiden door SDS-PAGE en gekleurd met Coomassie blue. Elke rijstrook bevat 25 µg totaal eiwit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59178/59178fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59178/59178fig3.jpg"> Figuur 3: eiwitniveaus in wormen. (A) westelijke vlek van doelstellingen onderzocht door RT-qPCR en (B) densitometrie analyse van signaalsterkte. Elke rijstrook bevat 20 µg van totale GTCp-geëxtraheerde eiwit van wild-type (WT), eten-2of rsks-1 mutant wormen. De afbeelding komt te staan is een representatie van de vier onafhankelijke replicatieonderzoeken per worm stam. Β-actine (onder) werd gebruikt om te controleren voor gelijke laden voor elk doel; slechts één worden vertegenwoordiger weergegeven. De rechterbaan bevat 20 µg totale RIPA-geëxtraheerde eiwit uit rsks-1 mutant wormen. (B) overeenkomstige signaal intensiteit werden gekwantificeerd aan de hand van ImageJ. De foutbalken vertegenwoordigen standaardafwijking; n = 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59178/59178fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59178/59178fig4.jpg"> Figuur 4: Intrasample mRNA en eiwit niveau vergelijking. Het niveau van het mRNA en eiwit uit afzonderlijke monsters van een subset van de doelen voor elke stam worden uitgelijnd. De kleur is de vertegenwoordiger van de tabel 1. De grijs/zwart WT, de blauwe is eten-2, en de rode rsks-1. mRNA en eiwit voor hetzelfde doel zijn gekoppeld naast elkaar en gescheiden door nematode stam. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59178/59178fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van RNA, DNA en eiwit uit hetzelfde monster, in een poging om de variatie te reduceren, reproduceerbaarheid te verbeteren en vergemakkelijken van interpretaties.

Gecombineerde Nucleotide en eiwit extracties in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Het gebruik van dit protocol om de variatie tussen de monsters te verwijderen kan inzicht bieden in de differentiële regulatie van macromoleculen op basis van de intra-sample verschillen tussen mRNA en eiwitniveaus. Hetzelfde monster gebruiken om DNA, RNA en eiwit te isoleren is een poging om de variabiliteit te verminderen, reproduceerbaarheid te verbeteren en interpretatie te vergemakkelijken. Voordelen zijn onder andere bespaarde tijd en middelen op het moment van het verzamelen van monsters en cross-sectionele analyse van waardevolle en beperkte monsters.Om te beginnen, zaad 1.000 worm eieren in een 10 centimeter plaat met de juiste groeiomstandigheden. Incubeer op 20 graden Celsius gedurende 72 uur. Was vervolgens de plaat met 5 milliliter M9-buffer en breng 1.000 volwassen wormen in een buis.Centrifugeer de wormen op 1,000 g gedurende een minuut, gooi de supernatant, en breng de pelleted wormen, met een milliliter M9 buffer, naar een 1,5 milliliter microcentrifuge buis. Centrifuge opnieuw op 845 g gedurende een minuut en gooi het grootste deel van de supernatant. Bewaar de gepelde wormen op min 80 graden Celsius voor meer dan vier uur.Verwijder vervolgens een supernatant uit de ontdooide pellet. Voeg een milliliter koud GTCP-reagens toe, meng goed door op en neer te pipetten en plaats het monster 10 minuten op ijs. Voeg vervolgens 200 microliter koude chloroform toe.Schud de buis gedurende 15 seconden krachtig en laat deze drie minuten op kamertemperatuur. Vervolgens centrifugeren de buis op 13, 500 g bij vier graden Celsius gedurende 15 minuten. Breng met een micropipet de heldere toplaag over in een nieuwe RNase-vrije 1,5 milliliter microcentrifugebuis.Breng de troebele witte interfaselaag over op een nieuwe buis met het label B2 en breng de roze laag, van de resterende pellet, over in een nieuwe buis met het label B en plaats beide op ijs. Het kan moeilijk zijn om de drie lagen te scheiden. Ik adviseer de overdracht van de troebele interfase laag in zijn eigen buis in plaats van het neerslaan van het DNA van deze laag van de organische, of roze laag.Om RNA te isoleren, voeg eerst 500 microliter van 100% isopropanol toe aan buis A om het RNA te neerslaan. Vervolgens, incubeer de buis op kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Na incubatie, centrifugeren de buis op 13, 500 g bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten.Gooi vervolgens de supernatant weg en voeg een milliliter ethanol van 75% toe aan buis A om de pellet te wassen. Centrifuge de buis op 5, 300 g bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en laat de pelletlucht vijf tot tien minuten drogen.Voeg 50 microliter RNase-vrij water toe om de pellet van RNA te reconstrueren en de pellet gedurende 10 minuten bij 55 tot 60 graden Celsius uit te broeden om het op te lossen. Gebruik ten slotte een spectrofotometer om de concentratie van het geïsoleerde RNA op 260 nanometer te meten en om onzuiverheden op 230 en 280 nanometer te identificeren. Om het DNA te isoleren, voeg eerst 300 microliters van 100% ethanol toe aan de organische fase in buis B en aan de troebele witte laag in buis B2 om het DNA neer te slaan, meng door inversie en laat de buizen twee tot drie minuten op kamertemperatuur.Dan, centrifuge buizen B en B2 op 376 g bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten om DNA pellet. Combineer de supernatant van buizen B en B2 in een nieuwe twee milliliter buis gelabeld C en laat het op ijs voor de daaropvolgende eiwitisolatie. Was vervolgens de DNA-pellet in buis B2 met een milliliter van 0,1 molaire natriumcitraat in 10% ethanol gedurende 30 minuten.Centrifugebuis B2 bij 376 g bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Herhaal de wasstap en zet de pellet opnieuw op in 1,5 milliliter ethanol van 75%en laat deze 20 minuten op kamertemperatuur. Vervolgens centrifuge buis B2 op 376 g bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten en gooi de supernatant en laat de pellet te drogen voor vijf tot 10 minuten.Los de pellet op in 150 microliter van acht milliliter natriumhydroxide. Dan, centrifuge het monster op 376 g bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Ten slotte, met een micropipet, breng de supernatant met het DNA naar een nieuwe buis.Gebruik een spectrofotometer om de concentratie van het geïsoleerde DNA op 260 nanometer te meten en eventuele onzuiverheden op 230 en 280 nanometer te identificeren. Om het eiwit te laten neerslaan, voeg dan eerst tot 1,5 milliliter 100% isopropanol toe aan het roze supernatant in buis C, meng door meerdere keren om te keren en incubeer gedurende 10 minuten op kamertemperatuur. Dan, centrifuge buis C op 13, 500 g bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten.Gooi de supernatant weg en was de pellet met twee milliliter 0,3 molaire guanidinehydrochloride in 95% ethanol gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Centrifuge de buis opnieuw op 5, 300 g bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten en herhaal de wasstap zoals voorheen. Breng de eiwitpellet over op een nieuwe 1,5 milliliter buis met het label C2 en voeg tot 1,5 milliliter ethanol, vortex, en laat het zitten op kamertemperatuur gedurende 20 minuten.Centrifuge de buis op 5, 300 g bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en laat de pellet 10 minuten drogen op kamertemperatuur. Los vervolgens de pellet op in 300 microliters van 5%SDS bij 50 graden Celsius gedurende 60 minuten.Tot slot, centrifuge de buis op 13, 500 g bij 17 graden Celsius gedurende 10 minuten. En breng de supernatant met het eiwit over naar een nieuwe buis. Om een kwantitatieve omgekeerde transcriptie PCR uit te voeren.Gebruik eerst een nanogram van het geïsoleerde RNA om cDNA voor te bereiden door omgekeerde transcriptie. Om een stockplaat van cDNA te maken, voeg 100 microliter van één tot 100 verdunningen van elk cDNA-monster toe aan individuele putten van een 96 putplaat, inclusief passende controles, zoals waterputten en serieel verdunde monsters, om primer-efficiëntie voor elk gen vast te stellen. Om een master mix voor elke set van primers, voeg tot zeven microliter water, een DNA-intercalating cyanide kleurstof, en vijf micro-molar elk van voorwaartse en omgekeerde primers.Voeg zeven microliters van de master mix toe aan de juiste putten van een RT-qPCR plaat. Voeg vervolgens drie microliters van de cDNA van de stockplaat toe en voer de plaat uit met behulp van een RT-qPCR-protocol dat geschikt is voor de primers die worden gebruikt. RT-qPCR analyse van geïsoleerde mRNAs uit vier onafhankelijke monsters van drie worm stammen werden gedaan om de doelstellingen geïdentificeerd door RNA seq test te bevestigen.F07C4.12 gen werd upregulated in beide tests in eat-2 wormen, maar de upregulatie in rsks-1 wormen werd niet gedetecteerd door RT-qPCR test. Ook RNA seq gedetecteerd expressie veranderingen van mrp-1 in eat-2 en rsks-1 wormen werden bevestigd via RT-qPCR. Upregulation of down-regulatie van organelle marker genen in mutant wormen werden ook gedetecteerd door RT-qPCR analyse.Vergelijking van GTCp versus RIPA-geëxtraheerd eiwit in wormen gescheiden door SDS-pagina en gekleurd met coomassie blauw toonde een vergelijkbare kwaliteit met een betere resolutie van grotere eiwitten voor GTCp-geëxtraheerde eiwitten. Westerse vlekanalyse toonde in de meeste gevallen vergelijkbare eiwitniveaus aan;de eiwitten groter dan 75 kilodalton vertoonden echter lagere niveaus in het ripa-geëxtraheerde eiwit. De vergelijking tussen doelen mRNA en eiwitniveaus van vier afzonderlijke monsters van drie wormstammen toonde een lage variabiliteit van de mRNA-niveaus met een grotere variabiliteit op eiwitniveau.In de context van DNA-isolatie is de opbrengst sterk afhankelijk van de vaardigheid om de troebele interfaselaag te herstellen van de organische of roze laag. Om de oplosing van eiwitten uit de pellet te verbeteren kan het verhogen van het volume van de resolubilisatie buffer of het toevoegen van andere detergenten naast SDS nodig zijn. Het gebruik van deze methode kan helpen bij het correct identificeren van gevallen waarin de vertaling van mRNA naar eiwit niet corelatieven is en kan leiden tot een dieper onderzoek van posttranscriptie- en post translationele regelgevingsmechanismen onder verschillende omstandigheden.In ons lab is dit protocol gebruikt om waardevolle en beperkte tijd kernmonsters te behouden. Bovendien kan ik me voorstellen dat dit een nuttig protocol zou zijn om vast te stellen op het gebied van het circadiane ritme. Het GCTP-reagens en de oplosmiddelen die in de RNA-isolatie worden gebruikt, zijn gevaren en moeten voorzichtig worden gebruikt.

Research

JoVE Journal

Biology

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolatie en In vitro Activering van Caenorhabditis elegans Sperma

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based dieetbeperking in Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse microscopie van de vroege embryogenese in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basis-<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisatie-en-

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandine-extractie en analyse in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Gebruik<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Als een modelsysteem voor de Protein Homeostase studeren in een meercellige

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

teelt van<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; In drie dimensies in het Laboratorium

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methoden om wijzigingen van de studie in inherente aggregatie van eiwitten met de leeftijd in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

Opsporen van Eiwit Subcellular Localisatie door Green fluorescentie eiwit Tagging en 4', 6-Diamidino-2-phenylindole vlekken in Caenorhabditis elegans

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Meting van zuurstof verbruik in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...