Gecombineerde Nucleotide en eiwit extracties in Caenorhabditis elegans

Het gebruik van dit protocol om de variatie tussen de monsters te verwijderen kan inzicht bieden in de differentiële regulatie van macromoleculen op basis van de intra-sample verschillen tussen mRNA en eiwitniveaus. Hetzelfde monster gebruiken om DNA, RNA en eiwit te isoleren is een poging om de variabiliteit te verminderen, reproduceerbaarheid te verbeteren en interpretatie te vergemakkelijken. Voordelen zijn onder andere bespaarde tijd en middelen op het moment van het verzamelen van monsters en cross-sectionele analyse van waardevolle en beperkte monsters.

Om te beginnen, zaad 1.000 worm eieren in een 10 centimeter plaat met de juiste groeiomstandigheden. Incubeer op 20 graden Celsius gedurende 72 uur. Was vervolgens de plaat met 5 milliliter M9-buffer en breng 1.000 volwassen wormen in een buis.

Centrifugeer de wormen op 1,000 g gedurende een minuut, gooi de supernatant, en breng de pelleted wormen, met een milliliter M9 buffer, naar een 1,5 milliliter microcentrifuge buis. Centrifuge opnieuw op 845 g gedurende een minuut en gooi het grootste deel van de supernatant. Bewaar de gepelde wormen op min 80 graden Celsius voor meer dan vier uur.

Verwijder vervolgens een supernatant uit de ontdooide pellet. Voeg een milliliter koud GTCP-reagens toe, meng goed door op en neer te pipetten en plaats het monster 10 minuten op ijs. Voeg vervolgens 200 microliter koude chloroform toe.

Schud de buis gedurende 15 seconden krachtig en laat deze drie minuten op kamertemperatuur. Vervolgens centrifugeren de buis op 13, 500 g bij vier graden Celsius gedurende 15 minuten. Breng met een micropipet de heldere toplaag over in een nieuwe RNase-vrije 1,5 milliliter microcentrifugebuis.

Breng de troebele witte interfaselaag over op een nieuwe buis met het label B2 en breng de roze laag, van de resterende pellet, over in een nieuwe buis met het label B en plaats beide op ijs. Het kan moeilijk zijn om de drie lagen te scheiden. Ik adviseer de overdracht van de troebele interfase laag in zijn eigen buis in plaats van het neerslaan van het DNA van deze laag van de organische, of roze laag.

Om RNA te isoleren, voeg eerst 500 microliter van 100% isopropanol toe aan buis A om het RNA te neerslaan. Vervolgens, incubeer de buis op kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Na incubatie, centrifugeren de buis op 13, 500 g bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten.

Gooi vervolgens de supernatant weg en voeg een milliliter ethanol van 75% toe aan buis A om de pellet te wassen. Centrifuge de buis op 5, 300 g bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en laat de pelletlucht vijf tot tien minuten drogen.

Voeg 50 microliter RNase-vrij water toe om de pellet van RNA te reconstrueren en de pellet gedurende 10 minuten bij 55 tot 60 graden Celsius uit te broeden om het op te lossen. Gebruik ten slotte een spectrofotometer om de concentratie van het geïsoleerde RNA op 260 nanometer te meten en om onzuiverheden op 230 en 280 nanometer te identificeren. Om het DNA te isoleren, voeg eerst 300 microliters van 100% ethanol toe aan de organische fase in buis B en aan de troebele witte laag in buis B2 om het DNA neer te slaan, meng door inversie en laat de buizen twee tot drie minuten op kamertemperatuur.

Dan, centrifuge buizen B en B2 op 376 g bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten om DNA pellet. Combineer de supernatant van buizen B en B2 in een nieuwe twee milliliter buis gelabeld C en laat het op ijs voor de daaropvolgende eiwitisolatie. Was vervolgens de DNA-pellet in buis B2 met een milliliter van 0,1 molaire natriumcitraat in 10% ethanol gedurende 30 minuten.

Centrifugebuis B2 bij 376 g bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Herhaal de wasstap en zet de pellet opnieuw op in 1,5 milliliter ethanol van 75%en laat deze 20 minuten op kamertemperatuur. Vervolgens centrifuge buis B2 op 376 g bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten en gooi de supernatant en laat de pellet te drogen voor vijf tot 10 minuten.

Los de pellet op in 150 microliter van acht milliliter natriumhydroxide. Dan, centrifuge het monster op 376 g bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Ten slotte, met een micropipet, breng de supernatant met het DNA naar een nieuwe buis.

Gebruik een spectrofotometer om de concentratie van het geïsoleerde DNA op 260 nanometer te meten en eventuele onzuiverheden op 230 en 280 nanometer te identificeren. Om het eiwit te laten neerslaan, voeg dan eerst tot 1,5 milliliter 100% isopropanol toe aan het roze supernatant in buis C, meng door meerdere keren om te keren en incubeer gedurende 10 minuten op kamertemperatuur. Dan, centrifuge buis C op 13, 500 g bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten.

Gooi de supernatant weg en was de pellet met twee milliliter 0,3 molaire guanidinehydrochloride in 95% ethanol gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Centrifuge de buis opnieuw op 5, 300 g bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten en herhaal de wasstap zoals voorheen. Breng de eiwitpellet over op een nieuwe 1,5 milliliter buis met het label C2 en voeg tot 1,5 milliliter ethanol, vortex, en laat het zitten op kamertemperatuur gedurende 20 minuten.

Centrifuge de buis op 5, 300 g bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en laat de pellet 10 minuten drogen op kamertemperatuur. Los vervolgens de pellet op in 300 microliters van 5%SDS bij 50 graden Celsius gedurende 60 minuten.

Tot slot, centrifuge de buis op 13, 500 g bij 17 graden Celsius gedurende 10 minuten. En breng de supernatant met het eiwit over naar een nieuwe buis. Om een kwantitatieve omgekeerde transcriptie PCR uit te voeren.

Gebruik eerst een nanogram van het geïsoleerde RNA om cDNA voor te bereiden door omgekeerde transcriptie. Om een stockplaat van cDNA te maken, voeg 100 microliter van één tot 100 verdunningen van elk cDNA-monster toe aan individuele putten van een 96 putplaat, inclusief passende controles, zoals waterputten en serieel verdunde monsters, om primer-efficiëntie voor elk gen vast te stellen. Om een master mix voor elke set van primers, voeg tot zeven microliter water, een DNA-intercalating cyanide kleurstof, en vijf micro-molar elk van voorwaartse en omgekeerde primers.

Voeg zeven microliters van de master mix toe aan de juiste putten van een RT-qPCR plaat. Voeg vervolgens drie microliters van de cDNA van de stockplaat toe en voer de plaat uit met behulp van een RT-qPCR-protocol dat geschikt is voor de primers die worden gebruikt. RT-qPCR analyse van geïsoleerde mRNAs uit vier onafhankelijke monsters van drie worm stammen werden gedaan om de doelstellingen geïdentificeerd door RNA seq test te bevestigen.

F07C4.12 gen werd upregulated in beide tests in eat-2 wormen, maar de upregulatie in rsks-1 wormen werd niet gedetecteerd door RT-qPCR test. Ook RNA seq gedetecteerd expressie veranderingen van mrp-1 in eat-2 en rsks-1 wormen werden bevestigd via RT-qPCR. Upregulation of down-regulatie van organelle marker genen in mutant wormen werden ook gedetecteerd door RT-qPCR analyse.

Vergelijking van GTCp versus RIPA-geëxtraheerd eiwit in wormen gescheiden door SDS-pagina en gekleurd met coomassie blauw toonde een vergelijkbare kwaliteit met een betere resolutie van grotere eiwitten voor GTCp-geëxtraheerde eiwitten. Westerse vlekanalyse toonde in de meeste gevallen vergelijkbare eiwitniveaus aan;de eiwitten groter dan 75 kilodalton vertoonden echter lagere niveaus in het ripa-geëxtraheerde eiwit. De vergelijking tussen doelen mRNA en eiwitniveaus van vier afzonderlijke monsters van drie wormstammen toonde een lage variabiliteit van de mRNA-niveaus met een grotere variabiliteit op eiwitniveau.

In de context van DNA-isolatie is de opbrengst sterk afhankelijk van de vaardigheid om de troebele interfaselaag te herstellen van de organische of roze laag. Om de oplosing van eiwitten uit de pellet te verbeteren kan het verhogen van het volume van de resolubilisatie buffer of het toevoegen van andere detergenten naast SDS nodig zijn. Het gebruik van deze methode kan helpen bij het correct identificeren van gevallen waarin de vertaling van mRNA naar eiwit niet corelatieven is en kan leiden tot een dieper onderzoek van posttranscriptie- en post translationele regelgevingsmechanismen onder verschillende omstandigheden.

In ons lab is dit protocol gebruikt om waardevolle en beperkte tijd kernmonsters te behouden. Bovendien kan ik me voorstellen dat dit een nuttig protocol zou zijn om vast te stellen op het gebied van het circadiane ritme. Het GCTP-reagens en de oplosmiddelen die in de RNA-isolatie worden gebruikt, zijn gevaren en moeten voorzichtig worden gebruikt.