कैनोहैबडिटिस एलिगेंस में संयुक्त न्यूक्लियोटाइड और प्रोटीन निष्कर्षण

अंतर-नमूना भिन्नता को हटाने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग एमआरएनए और प्रोटीन के स्तर के बीच अंतर-नमूना विसंगतियों में आधारित मैक्रोमॉलिक्यूल्स के अंतर विनियमन में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। डीएनए, आरएनए और प्रोटीन को अलग करने के लिए एक ही नमूने का उपयोग करना परिवर्तनशीलता को कम करने, प्रजनन क्षमता में सुधार करने और व्याख्या को सुविधाजनक बनाने का प्रयास है। लाभ नमूना संग्रह और मूल्यवान और सीमित नमूनों के पार अनुभागीय विश्लेषण के समय में सहेजा समय और संसाधनों में शामिल हैं ।

शुरू करने के लिए, उचित विकास की स्थिति के साथ एक 10 सेंटीमीटर प्लेट में 1, 000 कीड़ा अंडे बीज। 72 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। फिर, M9 बफर के 5 मिलीलीटर के साथ प्लेट धोएं और 1, 000 वयस्क कीड़े को एक ट्यूब में स्थानांतरित करें।

एक मिनट के लिए 1, 000 ग्राम पर कीड़े को अपकेंद्रित्र करें, सुपरनेट को त्यागें, और एम9 बफर के एक मिलीलीटर के साथ, 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में गोली वाले कीड़े को स्थानांतरित करें। एक मिनट के लिए 845 ग्राम पर फिर से सेंट्रलाइज करें और अधिकांश सुपरनेट को त्यागें। चार घंटे से अधिक समय तक पैलेट किए गए कीड़े को माइनस 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

इसके बाद, गल गोली से किसी भी सुपरनिटेंट को हटा दें। कोल्ड जीटीसीपी रिएजेंट का एक मिलीलीटर जोड़ें, ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह से मिलाएं और नमूना को 10 मिनट के लिए बर्फ पर रखें। इसके बाद इसमें कोल्ड क्लोरोफॉर्म के 200 माइक्रोलीटर डालें।

ट्यूब को 15 सेकंड के लिए सख्ती से हिलाएं और इसे तीन मिनट के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें। इसके बाद, 15 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर 13, 500 ग्राम पर ट्यूब अपकेंद्रित्र। माइक्रो-पिपेट के साथ, स्पष्ट शीर्ष परत को एक नए आरनैस-मुक्त 1.5 मिलीलीटर माइक्रो-सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें।

बादल सफेद इंटरफेज परत को एक नई ट्यूब लेबल B2 में स्थानांतरित करें और शेष गोली से गुलाबी परत को शेष गोली से स्थानांतरित करें, एक नई ट्यूब लेबल बी में और दोनों को बर्फ पर रखें। स्पष्ट रूप से तीन परतों को अलग करना मुश्किल हो सकता है। मैं कार्बनिक, या गुलाबी परत से इस परत से डीएनए उपजी के बजाय अपनी ट्यूब में बादल इंटरफेज परत स्थानांतरित करने की सलाह देते हैं ।

आरएनए को अलग-थलग करने के लिए, आरएनए को उपजी करने के लिए पहले ट्यूब ए में 100% आइसोप्रोपेनॉल के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें। फिर, 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूब इनक्यूबेट। इनक्यूबेशन के बाद, 10 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर 13, 500 ग्राम पर ट्यूब अपकेंद्रित्र।

इसके बाद, सुपरनैट को त्यागें और गोली को धोने के लिए ट्यूब ए में 75% इथेनॉल का एक मिलीलीटर जोड़ें। पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर 5, ३०० ग्राम पर ट्यूब अपकेंद्रित्र । सुपरनेट को त्याग दें और पैलेट एयर को पांच से 10 मिनट तक सूखने दें।

आरएनए के गोली का पुनर्गठन करने के लिए आरएनएएस-मुक्त पानी के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें और इसे भंग करने के लिए 10 मिनट के लिए 55 से 60 डिग्री सेल्सियस पर गोली को इनक्यूबेट करें। अंत में, 260 नैनोमीटर पर अलग आरएनए की एकाग्रता को मापने और 230 और 280 नैनोमीटर पर किसी भी अशुद्धियों की पहचान करने के लिए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करें। डीएनए को अलग करने के लिए, पहले ट्यूब बी में कार्बनिक चरण में 100% इथेनॉल के 300 माइक्रोलीटर जोड़ें और डीएनए को उपजी करने के लिए ट्यूब बी 2 में बादल सफेद परत के लिए, उलटा द्वारा मिश्रण और दो से तीन मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूबों छोड़ दें।

इसके बाद सेंट्रलाइज ट्यूब बी और बी 2 पर ३७६ ग्राम पर पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर गोली डीएनए । ट्यूब बी और बी 2 से सुपरनैट को एक नए दो मिलीलीटर ट्यूब लेबल सी में मिलाएं और बाद में प्रोटीन अलगाव के लिए बर्फ पर छोड़ दें। इसके बाद, ट्यूब बी 2 में डीएनए गोली को 30 मिनट के लिए 10% इथेनॉल में 0.1 मोलर सोडियम साइट्रेट के एक मिलीलीटर के साथ धोएं।

पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर ३७६ ग्राम पर सेंट्रलाइज ट्यूब बी 2 । वॉश स्टेप दोहराएं और फिर 75% इथेनॉल के 1.5 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें और इसे 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें। इसके बाद, पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर ३७६ ग्राम पर अपकेंद्रित्र ट्यूब B2 और फिर सुपरनैंट त्यागें और गोली को पांच से 10 मिनट तक सूखने दें ।

आठ मिलीलीटर सोडियम हाइड्रोक्साइड के 150 माइक्रोलीटर में गोली को भंग करें। इसके बाद पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर 376 ग्राम पर सैंपल को सेंट्रलाइज करें। अंत में, एक माइक्रोपिपेट के साथ, डीएनए युक्त सुपरनेट को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें।

260 नैनोमीटर पर अलग डीएनए की एकाग्रता को मापने और 230 और 280 नैनोमीटर पर किसी भी अशुद्धियों की पहचान करने के लिए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करें। प्रोटीन को कम करने के लिए, पहले ट्यूब सी में गुलाबी सुपरनेट में 100% आइसोप्रोपैनॉल के 1.5 मिलीलीटर तक जोड़ें, कई बार उलटा करके मिलाएं, और कमरे के तापमान पर 10 मिनट तक इनक्यूबेट करें। इसके बाद 13 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर 13, 500 ग्राम पर सेंट्रलाइज ट्यूब सी।

सुपरनेट को त्यागें और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 95% इथेनॉल में 0.3 मोलर ग्वानिडीन हाइड्रोक्लोराइड के दो मिलीलीटर के साथ गोली को धोएं। पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर 5, 300 ग्राम पर फिर से ट्यूब अपकेंद्रित्र करें और पहले की तरह वॉश स्टेप दोहराएं। प्रोटीन पेलेट को एक नए 1.5 मिलीलीटर ट्यूब लेबल C2 में स्थानांतरित करें और 95% इथेनॉल, भंवर के 1.5 मिलीलीटर तक जोड़ें, और इसे 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठने दें।

पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर 5, ३०० ग्राम पर ट्यूब अपकेंद्रित्र । सुपरनेट को त्यागें और गोली को 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सूखने दें। इसके बाद 5% एसडीएस के 300 माइक्रोलीटर में गोली को 60 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर घोलें।

अंत में, 10 मिनट के लिए 17 डिग्री सेल्सियस पर 13, 500 ग्राम पर ट्यूब अपकेंद्रित्र। और प्रोटीन युक्त सुपरनैंट को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें। मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर करना।

सबसे पहले, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन द्वारा सीडीएनए तैयार करने के लिए अलग आरएनए के एक नैनोग्राम का उपयोग करें। सीडीएनए की स्टॉक प्लेट बनाने के लिए, प्रत्येक जीन के लिए प्राइमर दक्षता स्थापित करने के लिए, प्रत्येक जीन के लिए प्राइमर दक्षता स्थापित करने के लिए, प्रत्येक सीडीएनए नमूने के एक से 100 कमजोर पड़ने के 100 माइक्रोलीटर को 96 अच्छी तरह से प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में जोड़ें, जिसमें पानी-केवल कुओं और क्रमिक रूप से पतला नमूनों जैसे उचित नियंत्रण शामिल हैं। प्राइमर के प्रत्येक सेट के लिए एक मास्टर मिश्रण बनाने के लिए, पानी के सात माइक्रोलीटर, एक डीएनए-इंटरकैलिटिंग सायनाइड डाई, और फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर के पांच माइक्रो-मोलर प्रत्येक को जोड़ें।

एक आरटी-क्यूपीसीआर प्लेट के उपयुक्त कुओं में मास्टर मिक्स के सात माइक्रोलीटर जोड़ें। फिर, स्टॉक प्लेट से सीडीएनए के तीन माइक्रोलीटर जोड़ें और प्राइमर्स के लिए उपयुक्त आरटी-क्यूपीसीआर प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्लेट चलाएं। आरएनए सेक परख द्वारा पहचाने गए लक्ष्यों की पुष्टि के लिए तीन कृमि उपभेदों के चार स्वतंत्र नमूनों से अलग-अलग एमआरएएनए का आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण किया गया ।

F07C4.12 जीन खाने में दोनों परख में उप विनियमित किया गया था-2 कीड़े, लेकिन rsks-1 कीड़े में अपने उपनियम आरटी-qPCR परख द्वारा पता नहीं चला था । इसके अलावा, आरएनए एसईक्यू ने ईट-2 में एमआरपी-1 के अभिव्यक्ति परिवर्तनों का पता लगाया और आरटी-क्यूपीसीआर के माध्यम से आरएसके-1 कीड़े की पुष्टि की गई । आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण द्वारा उत्परिवर्ती कीड़े में ऑर्गेनेल मार्कर जीन के अपरेगुलेशन या डाउन-रेगुलेशन का भी पता लगाया गया ।

जीटीसीपी बनाम रिपा-एसडी पेज द्वारा अलग किए गए कीड़े में प्रोटीन निकाले गए प्रोटीन की तुलना और coomassie नीले रंग के साथ दाग GTCp-निकाले प्रोटीन के लिए बड़ा प्रोटीन के बेहतर संकल्प के साथ एक समान गुणवत्ता दिखाया । पश्चिमी दाग विश्लेषण ज्यादातर मामलों में इसी तरह के प्रोटीन का स्तर दिखाया; हालांकि, ७५ किलोडिंगटन से बड़े प्रोटीन ने रिपा-निकाले गए प्रोटीन में निचले स्तर को दिखाया । तीन कृमि उपभेदों के चार व्यक्तिगत नमूनों से एमआरएनए और प्रोटीन के स्तर के बीच तुलना में प्रोटीन स्तर पर अधिक परिवर्तनशीलता के साथ एमआरएनए के स्तर की कम परिवर्तनशीलता दिखाई गई ।

डीएनए अलगाव के संदर्भ में, उपज कार्बनिक, या गुलाबी, परत से बादल अंतरफेज परत को ठीक करने के लिए प्रवीणता पर अत्यधिक निर्भर है। पैलेट से प्रोटीन के घुलनशीलता में सुधार करने के लिए पुनर्सैलिकरण बफर की मात्रा में वृद्धि या एसडीएस के अलावा अन्य डिटर्जेंट जोड़ने के लिए आवश्यक हो सकता है। इस विधि का उपयोग करने से उन मामलों की सही ढंग से पहचान करने में मदद मिल सकती है जहां प्रोटीन के लिए एमआरएनए का अनुवाद मूलात्मक नहीं है और विभिन्न शर्तों के तहत पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल और पोस्ट-ट्रांसलेशनल नियामक तंत्र की गहरी जांच हो सकती है।

हमारी प्रयोगशाला में, इस प्रोटोकॉल का उपयोग मूल्यवान और सीमित समय कोर नमूनों के संरक्षण के लिए किया गया है। इसके अलावा, मैं सोच सकता हूं कि यह सर्कैडियन लय क्षेत्र में अपनाने के लिए एक उपयोगी प्रोटोकॉल होगा। आरएनए आइसोलेशन में इस्तेमाल होने वाले जीसीटीपी रिएजेंट और सॉल्वैंट्स खतरे हैं और इसका इस्तेमाल सावधानी के साथ किया जाना चाहिए ।