Kombinert Nucleotide og Protein utdrag i Caenorhabditis elegans

Bruk av denne protokollen til å fjerne inter-sample-variasjonen kan gi innsikt i differensialreguleringen av makromolekyler basert i intra-prøveavvik mellom mRNA og proteinnivåer. Ved hjelp av den samme prøven for å isolere DNA, RNA og protein er et forsøk på å redusere variasjon, forbedre reproduserbarhet, og lette tolkning. Fordelene inkluderer spart tid og ressurser på tidspunktet for utvalgsinnsamling og tverrsnittsanalyse av verdifulle og begrensede prøver.

Til å begynne, frø 1, 000 orm egg i en 10 centimeter plate med passende vekstforhold. Inkuber ved 20 grader Celsius i 72 timer. Vask deretter platen med 5 milliliter M9-buffer og overfør 1000 voksne ormer til et rør.

Sentrifuger ormene ved 1, 000 g i ett minutt, kast supernatanten og overfør pelleted ormene, med en milliliter M9-buffer, til et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør. Sentrifuge igjen på 845 g i ett minutt og kast det meste av supernatant. Oppbevar pelleted ormene på minus 80 grader Celsius i mer enn fire timer.

Deretter fjerner du eventuelle overnaturlige fra den tinte pelleten. Tilsett en milliliter kald GTCP-reagens, bland godt ved å pipesett opp og ned og legg prøven på is i 10 minutter. Deretter legger du til 200 mikroliter kald kloroform.

Rist røret kraftig i 15 sekunder og la det stå ved romtemperatur i tre minutter. Deretter sentrifugerer røret på 13, 500 g ved fire grader Celsius i 15 minutter. Med en mikropipette overfører du det klare topplaget til et nytt RNase-fritt 1,5 milliliter mikrosentrigerrør.

Overfør det overskyede hvite interfaselaget til et nytt rør merket B2 og overfør det rosa laget, fra gjenværende pellet, til et nytt rør merket B og legg begge på is. Det kan være vanskelig å skille de tre lagene. Jeg anbefaler å overføre det overskyede mellomfaselaget til sitt eget rør i stedet for å utløse DNA fra dette laget fra det organiske eller rosa laget.

For å isolere RNA, legg først til 500 mikroliter på 100% isopropanol til rør A for å utløse RNA. Deretter inkubere røret ved romtemperatur i 10 minutter. Etter inkubasjon sentrifuger røret ved 13, 500 g ved fire grader Celsius i 10 minutter.

Deretter kaster du supernatanten og legger til en milliliter 75% etanol til rør A for å vaske pelleten. Sentrifuger røret ved 5, 300 g ved fire grader Celsius i fem minutter. Kast det overnaturlige og la pelletluften tørke i fem til 10 minutter.

Tilsett 50 mikroliter RNase-fritt vann for å rekonstituere pellet av RNA og inkubere pelleten ved 55 til 60 grader Celsius i 10 minutter for å oppløse den. Til slutt, bruk et spektrofotometer for å måle konsentrasjonen av den isolerte RNA ved 260 nanometer og for å identifisere eventuelle urenheter ved 230 og 280 nanometer. For å isolere DNA- tilspørser du først 300 mikroliter med 100 % etanol i organisk fase i rør B og til det overskyede hvite laget i rør B2 for å utløse DNA-et, bland ved inversjon og la rørene stå ved romtemperatur i to til tre minutter.

Deretter sentrifuge rør B og B2 på 376 g ved fire grader Celsius i fem minutter til pellet DNA. Kombiner supernatant fra rørene B og B2 i et nytt to milliliter rør merket C og la det stå på is for etterfølgende proteinisolering. Deretter vasker du DNA-pelleten i rør B2 med en milliliter 0,1 molarnatriumsitrat i 10% etanol i 30 minutter.

Sentrifugerør B2 ved 376 g ved fire grader Celsius i fem minutter. Gjenta vasketrinnet og deretter suspendere pelleten på nytt i 1,5 milliliter med 75% etanol og la den stå ved romtemperatur i 20 minutter. Deretter sentrifugerør B2 ved 376 g ved fire grader Celsius i fem minutter og kast deretter supernatanten og la pelleten tørke i fem til 10 minutter.

Oppløs pelleten i 150 mikroliter på åtte milliliter natriumhydroksid. Deretter sentrifuger prøven på 376 g ved fire grader Celsius i fem minutter. Til slutt, med en mikropipette, overfør supernatanten som inneholder DNA til et nytt rør.

Bruk et spektrofotometer for å måle konsentrasjonen av det isolerte DNA-et ved 260 nanometer og for å identifisere eventuelle urenheter ved 230 og 280 nanometer. For å utløse proteinet, legg først opp til 1,5 milliliter på 100% isopropanol til rosa supernatant i rør C, bland ved å invertere flere ganger og inkubere ved romtemperaturen i 10 minutter. Deretter sentrifuge rør C på 13, 500 g ved fire grader Celsius i 10 minutter.

Kast det overnaturlige og vask pelleten med to milliliter på 0,3 molar guanidinhydroklorid i 95% etanol i 20 minutter ved romtemperatur. Sentrifuger røret igjen ved 5, 300 g ved fire grader Celsius i fem minutter og gjenta vasketrinnet som før. Overfør proteinpelleten til et nytt 1,5 milliliter rør merket C2 og legg til opptil 1,5 milliliter 95% etanol, virvel, og la den sitte ved romtemperatur i 20 minutter.

Sentrifuger røret ved 5, 300 g ved fire grader Celsius i fem minutter. Kast det overnaturlige og la pelleten tørke ved romtemperatur i 10 minutter. Oppløs deretter pelleten i 300 mikroliter på 5% SDS ved 50 grader Celsius i 60 minutter.

Til slutt sentrifuger røret ved 13, 500 g ved 17 grader Celsius i 10 minutter. Og overfør det overnaturlige som inneholder proteinet til et nytt rør. For å utføre en kvantitativ omvendt transkripsjon PCR.

Bruk først ett nanogram av den isolerte RNA til å forberede cDNA ved omvendt transkripsjon. For å lage en lagerplate med cDNA, tilsett 100 mikroliter av en til 100 fortynninger av hver cDNA-prøve til individuelle brønner av en 96-brønnplate, inkludert passende kontroller, for eksempel vannbrønner og seriefortynnede prøver, for å etablere primereffektivitet for hvert gen. For å lage en masterblanding for hvert sett med primere, legg til opptil syv mikroliter vann, et DNA-intercalating cyanidfargestoff og fem mikromeler hver av forover- og omvendt primere.

Tilsett syv mikroliter av hovedblandingen til de riktige brønnene til en RT-qPCR-plate. Deretter legger du til tre mikroliter av cDNA fra lagerplaten og kjører platen ved hjelp av en RT-qPCR-protokoll som passer for primerne som brukes. RT-qPCR analyse av isolerte mRNAs fra fire uavhengige prøver av tre orm stammer ble gjort for å bekrefte målene identifisert av RNA seq analyse.

F07C4.12 genet ble oppregulert i begge analysene i spise-2 ormer, men dens oppregulering i rsks-1 ormer ble ikke oppdaget ved RT-qPCR analyse. RNA seq oppdaget også uttrykksendringer av mrp-1 i eat-2 og rsks-1 ormer ble også bekreftet via RT-qPCR. Oppregulering eller nedregulering av organelle markørgener i muterte ormer ble også oppdaget ved RT-qPCR-analyse.

Sammenligning av GTCp versus RIPA-ekstrahert protein i ormer atskilt med SDS-side og farget med coomassie blå viste en lignende kvalitet med bedre oppløsning av større proteiner for GTCp-ekstraherte proteiner. Western blot analyse viste lignende proteinnivåer i de fleste tilfeller;men proteinene større enn 75 kilodalton viste lavere nivåer i RIPA-ekstrahert protein. Sammenligningen mellom mål mRNA og proteinnivåer fra fire individuelle prøver av tre ormstammer viste en lav variasjon av mRNA-nivåene med større variasjon på proteinnivået.

I sammenheng med DNA-isolasjon er utbyttet svært avhengig av ferdighetene til å gjenopprette det overskyede interfaselaget fra det organiske, eller rosa laget. For å forbedre solubilisering av proteiner fra pellet øke volumet av resolubilisering buffer eller legge til andre vaskemidler i tillegg til SDS kan være nødvendig. Ved hjelp av denne metoden kan bidra til å identifisere tilfeller der oversettelse av mRNA til protein ikke er corelativ og kan føre til dypere undersøkelse av posttranskripsjonelle og post-translasjonelle regulatoriske mekanismer under ulike forhold.

I laboratoriet vårt har denne protokollen blitt brukt til å spare verdifulle og begrensede tidskjerneprøver. Videre kan jeg forestille meg at dette ville være en nyttig protokoll å vedta i døgnrytmefeltet. GCTP-reagensen og løsemidler som brukes i RNA-isolasjonen er farer og bør brukes med forsiktighet.