Kombinerade nukleotid och Protein extraktioner i Caenorhabditis elegans

Med hjälp av detta protokoll för att ta bort inter-prov variation kan erbjuda insikter i differentiell reglering av makromolekyler baserat i intra-sample avvikelser mellan mRNA och proteinnivåer. Använda samma prov för att isolera DNA, RNA, och protein är ett försök att minska variation, förbättra reproducerbarhet, och underlätta tolkning. Fördelarna omfattar sparad tid och resurser vid tidpunkten för provinsamling och tvärsnittsanalys av värdefulla och begränsade prover.

Till att börja, frö 1, 000 mask ägg i en 10 centimeter tallrik med lämpliga tillväxtförhållanden. Inkubera vid 20 grader Celsius i 72 timmar. Sedan, tvätta plattan med 5 milliliter M9 buffert och överföra 1, 000 vuxna maskar i ett rör.

Centrifugera maskarna vid 1, 000 g i en minut, kassera supernatanten och överför de pelleterade maskarna, med en milliliter M9-buffert, till ett 1,5 milliliter mikrocentrifugrör. Centrifugera igen vid 845 g i en minut och kassera det mesta av supernatanten. Förvara de pelleterade maskarna vid minus 80 grader Celsius i mer än fyra timmar.

Ta sedan bort eventuella supernatant från den tinade pelleten. Tillsätt en milliliter kall GTCP-reagens, blanda väl genom pipettering upp och ner och placera provet på is i 10 minuter. Sedan, tillsätt 200 mikroliter av kall kloroform.

Skaka röret kraftigt i 15 sekunder och låt det vara i rumstemperatur i tre minuter. Därefter centrifug röret vid 13, 500 g vid fyra grader Celsius i 15 minuter. Med en mikropipett överför du det klara toppskiktet till ett nytt RNase-fritt mikrocentrifugrör på 1,5 milliliter.

Överför det grumliga vita interfasskiktet till ett nytt rör märkt B2 och överför det rosa lagret, från den återstående pelleten, till ett nytt rör märkt B och placera både på is. Att skilja de tre skikten åt kan vara svårt. Jag rekommenderar att överföra den grumliga interphase lager i det egna röret snarare än fällning DNA från detta lager från den organiska, eller rosa lager.

För att isolera RNA, tillsätt först 500 mikroliter av 100%isopropanol till rör A för att fälla ut RNA. Därefter, inkubera röret i rumstemperatur i 10 minuter. Efter inkubation, centrifug röret vid 13, 500 g vid fyra grader Celsius i 10 minuter.

Därefter kassera supernatanten och tillsätt en milliliter av 75%etanol till rör A för att tvätta pelleten. Centrifugera röret vid 5, 300 g vid fyra grader Celsius i fem minuter. Kasta supernatanten och låt pelleten lufttorka i fem till tio minuter.

Tillsätt 50 mikroliter RNase-fritt vatten för att rekonstruera pelleten av RNA och inkubera pelleten vid 55 till 60 grader Celsius i 10 minuter för att lösa upp den. Använd slutligen en spektrofotometer för att mäta koncentrationen av det isolerade RNA vid 260 nanometer och för att identifiera eventuella föroreningar vid 230 och 280 nanometer. För att isolera DNA: t, tillsätt först 300 mikroliter av 100%etanol till den organiska fasen i rör B och till det grumliga vita skiktet i rör B2 för att fälla ut DNA: t, blanda genom inversion och låt rören vid rumstemperatur i två till tre minuter.

Sedan centrifugrör B och B2 vid 376 g vid fyra grader Celsius i fem minuter till pellet-DNA. Kombinera supernatanten från rören B och B2 i ett nytt två milliliterrör märkt C och lämna det på is för efterföljande proteinisolering. Därefter tvätta DNA-pelleten i röret B2 med en milliliter på 0,1 molar natriumcitrat i 10%etanol i 30 minuter.

Centrifugeringsröret B2 vid 376 g vid fyra grader Celsius i fem minuter. Upprepa tvättsteget och dra sedan upp pelleten på ny 1,5 milliliter 75%etanol och låt den vara i rumstemperatur i 20 minuter. Därefter centrifugrör B2 vid 376 g vid fyra grader Celsius i fem minuter och sedan kasta supernatanten och låt pelleten torka i fem till 10 minuter.

Lös pelleten i 150 mikroliter av åtta milliliter natriumhydroxid. Sedan centrifug provet vid 376 g vid fyra grader Celsius i fem minuter. Slutligen, med en mikropipette, överföra supernatant som innehåller DNA till ett nytt rör.

Använd en spektrofotometer för att mäta koncentrationen av det isolerade DNA vid 260 nanometer och för att identifiera eventuella föroreningar vid 230 och 280 nanometer. För att fälla ut proteinet, tillsätt först upp till 1,5 milliliter 100%isopropanol till den rosa supernatanten i tub C, blanda genom att invertera flera gånger och inkubera vid rumstemperatur i 10 minuter. Sedan centrifugröret C vid 13, 500 g vid fyra grader Celsius i 10 minuter.

Kassera supernatanten och tvätta pelleten med två milliliter på 0,3 molar guanidinhydroklorid i 95%etanol i 20 minuter i rumstemperatur. Centrifugera röret igen vid 5, 300 g vid fyra grader Celsius i fem minuter och upprepa tvättsteget som tidigare. Överför proteinpelleten till ett nytt 1,5 milliliterrör märkt C2 och tillsätt upp till 1,5 milliliter 95%etanol, virvel, och låt det sitta i rumstemperatur i 20 minuter.

Centrifugera röret vid 5, 300 g vid fyra grader Celsius i fem minuter. Kassera supernatanten och låt pelleten torka i rumstemperatur i 10 minuter. Lös sedan pelleten i 300 mikroliter på 5%SDS vid 50 grader Celsius i 60 minuter.

Slutligen centrifug röret vid 13, 500 g vid 17 grader Celsius i 10 minuter. Och överför supernatanten som innehåller proteinet till ett nytt rör. Att utföra en kvantitativ omvänd transkription PCR.

Använd först ett nanogram av det isolerade RNA för att förbereda cDNA genom omvänd transkription. För att göra en lagerplatta av cDNA, tillsätt 100 mikroliter av en till 100 utspädningar av varje cDNA-prov till enskilda brunnar av en 96 brunnsplatta, inkludera lämpliga kontroller, såsom brunnar med enbart vatten och serieutspädda prover, för att fastställa primereffektivitet för varje gen. För att göra en master mix för varje uppsättning primers, tillsätt upp till sju mikroliter vatten, en DNA-intercalating cyanid färgämne, och fem mikro-molar vardera av framåt och omvänd primers.

Lägg till sju mikroliter av mastermixen till lämpliga brunnar av en RT-qPCR-platta. Lägg sedan till tre mikroliter av cDNA från lagerplattan och kör plattan med hjälp av ett RT-qPCR-protokoll som passar för de primers som används. RT-qPCR analys av isolerade mRNAs från fyra oberoende prover av tre mask stammar gjordes för att bekräfta de mål som identifierats av RNA seq analys.

F07C4.12 genen var uppreglerad i båda assays i äta-2 maskar, men dess uppreglering i rsks-1 maskar upptäcktes inte av RT-qPCR analys. Också, RNA seq upptäckt uttryck förändringar av MRP-1 i äta-2 och rsks-1 maskar bekräftades via RT-qPCR. Uppreglering eller ned-reglering av organelle markör gener i mutanta maskar upptäcktes också av RT-qPCR analys.

Jämförelse av GTCp kontra RIPA-extraherade protein i maskar åtskilda av SDS sida och färgas med coomassie blå visade en liknande kvalitet med bättre upplösning av större proteiner för GTCp-extraherade proteiner. Western blot analys visade liknande proteinnivåer i de flesta fall,dock visade de proteiner större än 75 kilodalton lägre nivåer i RIPA-extraherade protein. Jämförelsen mellan mål mRNA och proteinnivåer från fyra enskilda prover av tre maskstammar visade en låg variabilitet av mRNA-nivåerna med större variation på proteinnivå.

I samband med DNA-isolering är avkastningen mycket beroende av kompetensen att återvinna det grumliga interfasskiktet från det organiska, eller rosa, lagret. För att förbättra solubilisering av proteiner från pelleten öka volymen av resolubilization buffert eller lägga till andra rengöringsmedel förutom SDS kan vara nödvändigt. Att använda denna metod kan hjälpa till att korrekt identifiera fall där översättning av mRNA till protein inte är corelative och kan leda till djupare undersökning av post-transkriptionella och post-translationella regleringsmekanismer under olika förhållanden.

I vårt labb har detta protokoll använts för att bevara värdefulla och begränsade tidsympprover. Dessutom kan jag tänka mig att detta skulle vara ett användbart protokoll att anta i dygnsrytmen fältet. GCTP-reagensen och lösningsmedel som används i RNA-isoleringen är faror och bör användas med försiktighet.