Name: combined nucleotide and protein extractions in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-03-17T14:00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

L.R.L. finanse tarafından NIH/NIA (R00 AG042494 ve R01 AG051810), bir Glenn temel tıbbi araştırma ödülü için araştırma biyolojik mekanizmaları yaşlanma ve Amerikan Federasyonu Junior fakülte hibe yaşlanma araştırma için verir. Yazarlar Anita Kumar ve Shi Quan Wong Bu el yazması yazılı olarak yararlı geribildirim için teşekkür etmek istiyorum.

Not: Her makromolekül yağış adım ardışık olarak, aynı anda yapılan yıkama tarafından takip gerçekleştirilir; Ancak, bu RNA izolasyon tamamlamak için önerilir önce özünde kararsız olduğu gibi.
1. örnek koleksiyonu
<ol><li>1000 solucan yumurta uygun büyüme koşullar19ile 10 cm plaka başına tohum. 72 h için 20 ° C'de kuluçkaya. Not: Daha önce yumurta toplamak için çamaşır suyu yumurta taşıyan yetişkin19açıklanan.</li>
	<li>Yaklaşık 5 mL M9 arabelleği ile tabak yıkama ve 1.000 yetişkin solucanlar bir tüpün içine toplamak. Not: M9 arabellek 35 mM sodyum fosfat dibasic, 102 mM Sodyum Klorür, 22 mM potasyum fosfat yem mono ve 1 mM Magnezyum sülfat steril su19oluşur.</li>
	<li>1000 x g 1 dk. için de solucanlar santrifüj kapasitesi, süpernatant atın ve 1 mL M9 arabelleği pelleted Kurtlarla 1.5 mL microcentrifuge tüp transferi.</li>
	<li>Bir daha vasıl 845 x g 1 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant çoğunu atın. Pelleted solucanlar en az 4 h-80 ° C'de depolayın. Not: Donmuş bir Pelet kullanarak bir taze Pelet daha daha yüksek bir verim elde edilir. Sıvı nitrojen ya da % 95 etanol solucan kütikül çatlamak için Kuru buza kullanarak donma/çözülme döngüsü bir dizi tavsiye edilir bir taze Pelet kullanıyorsanız. M9 az miktarda Pelet üzerinde bırakarak manikür dondurma zaman break yardımcı olur.</li>
</ol>2. nükleotit ve Protein yalıtım
<ol><li>Herhangi bir süpernatant çözdürülen Pelet kaldırın ve 1 mL soğuk GTCp reaktif ekleyin. Mix de yukarı ve aşağı pipetting. Örnek buz 10 min için yer ve zaman zaman ters çevirip tarafından karıştırın. Uyarı: Fenol aşındırıcı, Nörotoksik ve yüksek derecede toksik ve kimyasal yanık ve körlüğe neden. Not: 5. 000'e kadar yetişkin solucanlar bildirilen birimleri ile başlangıç malzemesi olarak kullanılan; her birim 1 mL GTCp reaktif kullanımına dayanır. Daha büyük bir örnek kullanırken, büyütmek için gerekli olabilir.</li>
	<li>Solucanlar ve GTCp, soğuk kloroform 200 µL ekleyin. Seninkine parmakları arasında kontrol ve şiddetle 15 s. izin için bu oda sıcaklığında (RT) 3 dakika çalkalanır. Uyarı: Kloroform bir toksik tahriş edici, Cilt yaralar ve diğer organ hedefli zarar neden olabilir ve olası bir kanserojen olduğunu.</li>
	<li>Tüp, 13.500 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi Not: Üç katmandan sonra bu spin kurdu: üst, açık sulu faz, alt, pembe organik faz ve lipidler ve DNA içeren küçük, bulutlu Interphase.</li>
	<li>Bir micropipette kullanarak, alkol yağış (olarak detaylı içinde adım 2.5) üzerinden RNA yalıtmak ve pembe Katmanı (organik faz) kalan Pelet taşımak için yeni bir tüp (için bir yeni RNase free 1.5 mL microcentrifuge tüp (a tüp) açık üst tabaka (sulu faz) taşımak tüp B) ve buz üzerinde yerleştirin. Not: Pembe organik faz-80 ° C'de DNA ve protein bu örnekten yalıtım kadar donmuş olabilir. Daha büyük örnekleri sulu ve organik faz arasında kalın bir beyaz tabaka üretecek. Bu kesir DNA içerir. Bu katman-ebilmek var olmak çıkarmak diğer aşamalarında bozmadan, bunu yapmak ve bir ayrı tüp (tüp B2) koydu.</li>
	<li>
RNA aşağıdaki gibi izole et.
	<ol>
<li>Tüp A temiz sulu faz 500 µL % 100 isopropanol ile RNA çökelti. 10 dakika dik, kuluçkaya Sonra santrifüj tüpü A 13.500 x g 4 ° C'de 10 dk de Not: RNA'ın küçük bir beyaz Pelet tüp alt kısmında görünür olmalıdır.</li>
		<li>Süpernatant çoğunluğu dikkatle boşaltmak. Kalanı 1 mL şırınga ile bir iğne ile kaldırmak ve süpernatant atın. Not: İğne büyüklüğü önemli değildir; Ancak, daha büyük bir iğne ölçüm Pelet rahatsız etmek daha fazla denetim sunar. İğneler yoksa bir micropipette kullanılabilir.</li>
		<li>% 75 etanol 1 mL tüp Pelet yıkamak için A ekleyin. Tüp 5300 x g 4 ° C'de 5 min için de spin</li>
		<li>Süpernatant Pelet decanting ve bir iğne ile 1 mL şırınga kullanarak adım 2.5.2 konusunda açıklanan şekilde kaldırın ve bu atın.</li>
		<li>Pelet izin için 5-10 dk kuruması, ama overdry izin vermeyin. 50 µL RNase free su tamamen saydam olur önce RNA Pelet yeniden oluşturmak için kullanın. Not: Bu yeterli bir başlangıç birim 1000-3000 solucanlar için ama ne kadar başlangıç materyali kullanılan yönteme bağlı olarak ayarlanması gerekebilir.</li>
		<li>Bunu halletmek için 55-60 ° c 10 min için Pelet kuluçkaya.</li>
		<li>Konsantrasyonu ve bir Spektrofotometre kullanarak saflığı ölçmek. Kayıt absorbances 260 nm RNA yoğunlaşması ve herhangi bir yabancı maddeleri tanımlamak için 230 ve 280 nm.</li>
		<li>Herhangi bir kirletici maddeleri, fenol kalıntı veya DNA, gibi sütun arıtma veya sonraki etanol yıkar ve Dnaz tedavisi kaldırmak için RNA temiz. Not: Bu noktada, RNA RNAseq analiz için gönderilmeye hazır veya cDNA RT-qPCR (Ayrıntılar için 3.1 bölümüne bakın) kullanmak için yapmak için kullanılabilir. RNA-80 ° C'de daha fazla kullanılmasını kadar saklanabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DNA aşağıdaki gibi izole et.
	<ol>
<li>Tüp B pembe organik aşamasında ve tüp B2, örnek varsa, DNA INVERSION tarafından 300 µL % 100 etanol ve karışımı ekleyerek çökelti. Tüpler RT için 2-3 dakika bırakın.</li>
		<li>375 x g 4 ° C'de DNA cips için 5 min için de B ve B2 tüpler santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Süpernatant tüpler B ve B2 yeni 2 mL tüp içine (tüp C) dökerek taşımak ve sonraki protein yalıtım için buz üzerinde bırakın. DNA Pelet tüp B veya B2 ile 1 mL 0.1 M sodyum sitrat 375 x g 4 ° C'de 5 min için de 30 dk santrifüj tüpleri B ve B2 için % 10 etanol içinde yıkayın Not: Sodyum DNA daha kolay sodyum sitrat ve etanol, düşük hızlı Santrifüjü tarafından kaldırılacak kirleri izin acele yapma DNA omurga bağlar.</li>
		<li>2.6.3. adımda açıklandığı gibi yıkama adımı yineleyin. Pelet 1,5 mL % 75 etanol resuspend ve upending tarafından zaman zaman karıştırma ile 20 dk için RT bırakın.</li>
		<li>Santrifüj 375 x g 4 ° C'de 5 min için de B ve B2 tüp</li>
		<li>Süpernatant atın ve 5-10dk için kurumasını bekleyin.</li>
		<li>8 mM sodyum hidroksit 150 µL Pelet geçiyoruz. HEPES ile istenen pH için ayarlayın. 375 x g 4 ° C'de 5 min için örnek spin</li>
		<li>Bir micropipette kullanarak, süpernatant (DNA) için yeni bir tüp taşıyın. Konsantrasyonu ölçmek ve saflık bir Spektrofotometre kullanarak belirleyebilirsiniz. Kayıt absorbances 260 nm DNA yoğunlaşması ve herhangi bir yabancı maddeleri tanımlamak için 230 ve 280 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Protein aşağıdaki gibi izole et.
	<ol>
<li>Protein çökelti için en fazla 1,5 mL % 100 isopropanol pembe süpernatant tüp C, birkaç kez, ters çevirme tarafından karışımı ekleyin ve RT 10 dakikadır kuluçkaya.</li>
		<li>Tüp C 13.500 x g 4 ° C'de 10 dakika için de santrifüj kapasitesi</li>
		<li>Süpernatant atmak ve Pelet ile 0,3 M guanidin hidroklorür 2 mL % 95 etanol RT. santrifüj Tube C 5300 x g 4 ° C'de 5 min için de 20 dakika yıkayın</li>
		<li>2.7.3. adımda açıklandığı gibi yıkama adımı yineleyin 2 x.</li>
		<li>Yeni bir 1,5 mL tüp (tüp C2) protein Pelet taşıyın ve en fazla 1,5 mL % 95 etanol ekleyin. Girdap ve izin vermek için 20 dk RT otur.</li>
		<li>Tüp C2, 5300 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi Süpernatant atın ve RT. erime, 10 dk 60 dk 50 ° C'de % 5 SDS 300 µL Pelet Makinası Pelet izin. Not: Daha uzun bir kuluçka süresi tam protein Pelet dağıtılması gerekebilir. Geçmişte, pelet en fazla 6 saat için kalite ödün vermeden inkübe.</li>
		<li>Tüp C2 13.500 x g 17 ° C'de 10 dakika için de santrifüj kapasitesi Süpernatant için yeni bir tüp taşıyın.</li>
		<li>Deterjan ile uyumlu bir tercih edilen protein miktar tahlil kullanarak toplama ölçmek. Not: Protein Batı kurutma ve SDS-sayfa içinde kullanılmak üzere hazırdır. İleride kullanmak için-20 ° C'de depolanabilir. LC-MS/MS gibi diğer teknikleri için deterjan kapalı diyaliz gerekecektir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. mRNA ve Protein düzeyleri değerlendirilmesi
<ol><li>
RT-qPCR
	<ol>
<li>1 ters transkripsiyon cDNA hazırlayın ng RNA, aşağıdaki thermocycler iletişim kuralını kullanarak: 25 ° c (5 dk), ters transkripsiyon (20 dk 46 ° c) ve RT inactivation (95 ° C'de 1 dk) priming.</li>
		<li>CDNA hisse senedi bir tabak bir 96-şey plaka bireysel wells için her cDNA Örnek 1: 100 dilutions 100 µL ekleyerek getirin. Hiçbir şablon/su-sadece wells ve 1: 400 (tüm analiz örnekleri havuza alınan cDNA ile kökenli) 1:25 seri olarak seyreltilmiş numune uygun denetimler içerir astar verimlilik analiz her gen için kurmak standart bir eğri için izin vermek için. Not: Bu biçim bir RT-qPCR tabak bir tabak içinde tüm örneklerini aktarmak için ve iyi iyi pipetting varyasyonları azaltılması için sağlar 96-şey microdispenser ile kullanılabilir. Uygun ana mix (örneğin, SYBR + astar) her için de bundan sonra bir çok kanallı pipet ile eklenebilir. Genel olarak, bu yaklaşım el pipetting-her örnek, böylece daha fazla değişkenlik azaltarak zaman tanıttı hataları azaltır.</li>
		<li>CDNA 3 µL hisse senedi plaka RT-qPCR plaka wells için ekleyin.</li>
		<li>İleri ve ters astar ve örnek başına 7 µL su ana mix 1 x supermix bir DNA enterkalasyon siyanür boya, her 5 mikron içeren içerir astar kümelerine olun. 7 µL bir RT-qPCR plaka uygun kuyu ekleyin ve hafifçe karıştırmak için tahrik. Not: Sonuçları20normalleştirmek için bir referans olarak kullanmak üzere temizlik genler ölçmek için örnekleri içerir.</li>
		<li>Kalenin kullanılan astar için uygun bir RT-qPCR protokolünü kullanarak çalıştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Batı leke Not: Batı açıkları hakkında ayrıntılı bilgi için lütfen Mahmud ve Yang21' e bakın.<ol>
<li>Örnekleri ile eşit bir güç 2 x Laemmli örnek arabellek ve 95 ° c 10 dakika kaynatın protein 20 µg birleştirerek SDS-sayfa için hazır olun.</li>
		<li>Örnekleri % 4-% 15 Tris-glisin jel üzerine yük ve 1 h için veya alt jel boya açık ulaşıncaya kadar 150'den V çalıştırabilirsiniz.</li>
		<li>Proteinler jel 25 V 30 dk içinde bir semidry transferi aparatı için nitroselüloz membran aktarın.</li>
		<li>Uygun transfer membran ile Ponceau S leke boyama tarafından onaylayın.</li>
		<li>Iyice leke membran Tris arabelleğe alınmış serum (TBS) % 0,01 polysorbate 20 (TBS-T) ile yıkayın.</li>
		<li>Blok membran RT. 1 h için TBS-T % 5 yağsız süt ile</li>
		<li>Tedarikçinin öneriler göre uygun seyreltme, birincil antikor membran kuluçkaya. Gece 4 ° C'de rocker üzerinde bırakın.</li>
		<li>Membran 3 yıkama x 5 dk her, TBS-T. ile</li>
		<li>Tedarikçinin öneriler göre uygun seyreltme, uygun ikincil antikor membran kuluçkaya. Rocker RT. 1 h için açık bırak</li>
		<li>Membran 3 yıkama x 5 dk her, TBS-T. ile</li>
		<li>Görüntü ve tercih edilen yöntemler kullanarak Batı leke ölçmek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rotroff, D. M., Motsinger-Reif, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embracing+Integrative+Multiomics+Approaches.">Embracing Integrative Multiomics Approaches.</a> International Journal of Genomics. 2016, 1715985 (2016).</li><li>Chen, R., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promise+of+personalized+omics+to+precision+medicine.">Promise of personalized omics to precision medicine.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: System Biology and Medicine. 5 (1), 73-82 (2013).</li><li>Anderson, L., Seilhamer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+selected+mRNA+and+protein+abundances+in+human+liver.">A comparison of selected mRNA and protein abundances in human liver.</a> Electrophoresis. 18 (3-4), 533-537 (1997).</li><li>Harvald, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-omics+Analyses+of+Starvation+Responses+Reveal+a+Central+Role+for+Lipoprotein+Metabolism+in+Acute+Starvation+Survival+in+C.+elegans.">Multi-omics Analyses of Starvation Responses Reveal a Central Role for Lipoprotein Metabolism in Acute Starvation Survival in C. elegans.</a> Cell Systems. 5 (1), (2017).</li><li>Griffin, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+profiling+of+gene+expression+at+the+transcriptome+and+proteome+levels+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Complementary profiling of gene expression at the transcriptome and proteome levels in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cell Proteomics. 1 (4), 323-333 (2002).</li><li>Greenbaum, D., Colangelo, C., Williams, K., Gerstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+protein+abundance+and+mRNA+expression+levels+on+a+genomic+scale.">Comparing protein abundance and mRNA expression levels on a genomic scale.</a> Genome Biology. 4 (9), 117 (2003).</li><li>Lapierre, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TFEB+orthologue+HLH-30+regulates+autophagy+and+modulates+longevity+in+Caenorhabditis+elegans.">The TFEB orthologue HLH-30 regulates autophagy and modulates longevity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 4, 2267 (2013).</li><li>Doherty, C. J., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+control+of+global+gene+expression+patterns.">Circadian control of global gene expression patterns.</a> Annual Reviews Genetics. 44, 419-444 (2010).</li><li>Goya, M. E., Romanowski, A., Caldart, C. S., Benard, C. Y., Golombek, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+identified+in+Caenorhabditis+elegans+by+in+vivo+long-term+monitoring+of+a+bioluminescent+reporter.">Circadian rhythms identified in Caenorhabditis elegans by in vivo long-term monitoring of a bioluminescent reporter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113 (48), E7837-E7845 (2016).</li><li>Dalvin, L. A., Fautsch, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Circadian+Rhythm+Gene+Expression+With+Reference+to+Diurnal+Pattern+of+Intraocular+Pressure+in+Mice.">Analysis of Circadian Rhythm Gene Expression With Reference to Diurnal Pattern of Intraocular Pressure in Mice.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (4), 2657-2663 (2015).</li><li>Narayanan, A., Jacobson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+studies+of+protein+regulation+by+post-translational+phosphorylation.">Computational studies of protein regulation by post-translational phosphorylation.</a> Current Opinion in Structural Biology. 19 (2), 156-163 (2009).</li><li>Swatek, K. N., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+modifications.">Ubiquitin modifications.</a> Cell Research. 26 (4), 399-422 (2016).</li><li>Cech, T. R., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+noncoding+RNA+revolution-trashing+old+rules+to+forge+new+ones.">The noncoding RNA revolution-trashing old rules to forge new ones.</a> Cell. 157 (1), 77-94 (2014).</li><li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction.">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).</li><li>Triant, D. A., Whitehead, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Extraction+of+High-Quality+RNA+and+DNA+from+Small+Tissue+Samples.">Simultaneous Extraction of High-Quality RNA and DNA from Small Tissue Samples.</a> Journal of Heredity. 100 (2), 246-250 (2009).</li><li>Liu, X., Harada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Isolation+from+Mammalian+Samples.">RNA Isolation from Mammalian Samples.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).</li><li>Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+solubilization+of+proteins+after+TRIzol+extraction+of+RNA+and+DNA+from+patient+material+following+prolonged+storage.">Isolation and solubilization of proteins after TRIzol extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage.</a> Biotechniques. 42 (4), 467-470 (2007).</li><li>Kopec, A. M., Rivera, P. D., Lacagnina, M. J., Hanamsagar, R., Bilbo, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+solubilization+of+TRIzol-precipitated+protein+permits+Western+blotting+analysis+to+maximize+data+available+from+brain+tissue.">Optimized solubilization of TRIzol-precipitated protein permits Western blotting analysis to maximize data available from brain tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 280, 64-76 (2017).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Hoogewijs, D., Houthoofd, K., Matthijssens, F., Vandesompele, J., Vanfleteren, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+and+validation+of+a+set+of+reliable+reference+genes+for+quantitative+sod+gene+expression+analysis+in+C.+elegans.">Selection and validation of a set of reliable reference genes for quantitative sod gene expression analysis in C. elegans.</a> BMC Molecular Biology. 9 (1), 9 (2008).</li><li>Mahmood, T., Yang, P. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blot:+technique,+theory,+and+trouble+shooting.">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).</li><li>Peach, M., Marsh, N., MacPhee, D. J., Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+solubilization:+Attend+to+the+choice+of+lysis+buffer.">Protein solubilization: Attend to the choice of lysis buffer.</a> Protein Electrophoresis: Methods and Protocols. , 37-47 (2012).</li><li>Lakowski, B., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+caloric+restriction+in+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 95 (22), 13091-13096 (1998).</li><li>Pan, K. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+mRNA+translation+extends+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">Inhibition of mRNA translation extends lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 6 (1), 111-119 (2007).</li><li>Gaudet, P., Livstone, M. S., Lewis, S. E., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic-based+propagation+of+functional+annotations+within+the+Gene+Ontology+consortium.">Phylogenetic-based propagation of functional annotations within the Gene Ontology consortium.</a> Briefings in Bioinformatics. 12 (5), 449-462 (2011).</li><li>Broeks, A., Gerrard, B., Allikmets, R., Dean, M., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologues+of+the+human+multidrug+resistance+genes+MRP+and+MDR+contribute+to+heavy+metal+resistance+in+the+soil+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Homologues of the human multidrug resistance genes MRP and MDR contribute to heavy metal resistance in the soil nematode Caenorhabditis elegans.</a> The EMBO Journal. 15 (22), 6132-6143 (1996).</li><li>Hadwiger, G., Dour, S., Arur, S., Fox, P., Nonet, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Monoclonal+Antibody+Toolkit+for+C.+elegans.">A Monoclonal Antibody Toolkit for C. elegans.</a> PLoS One. 5 (4), e10161 (2010).</li><li>Kostich, M., Fire, A., Fambrough, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+molecular-genetic+characterization+of+a+LAMP/CD68-like+protein+from+Caenorhabditis+elegans.">Identification and molecular-genetic characterization of a LAMP/CD68-like protein from Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Cell Science. 113 (14), 2595 (2000).</li><li>Firestein, B. L., Rongo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DLG-1+is+a+MAGUK+similar+to+SAP97+and+is+required+for+adherens+junction+formation.">DLG-1 is a MAGUK similar to SAP97 and is required for adherens junction formation.</a> Molecular Biology of the Cell. 12 (11), 3465-3475 (2001).</li><li>Heschl, M. F., Baillie, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+hsp70+multigene+family+of+Caenorhabditis+elegans.">Characterization of the hsp70 multigene family of Caenorhabditis elegans.</a> DNA. 8 (4), 233-243 (1989).</li><li>Yoneda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartment-specific+perturbation+of+protein+handling+activates+genes+encoding+mitochondrial+chaperones.">Compartment-specific perturbation of protein handling activates genes encoding mitochondrial chaperones.</a> Journal of Cell Science. 117 (18), 4055 (2004).</li><li>Takahashi, M., Iwasaki, H., Inoue, H., Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+Genetic+Analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+26S+Proteasome+Subunits+by+RNA+Interference.">Reverse Genetic Analysis of the Caenorhabditis elegans 26S Proteasome Subunits by RNA Interference.</a> Biological Chemistry. 383, 1263 (2002).</li><li>Le Bot, N., Tsai, M. C., Andrews, R. K., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAC-1,+a+regulator+of+microtubule+length+in+the+C.+elegans+embryo.">TAC-1, a regulator of microtubule length in the C. elegans embryo.</a> Current Biology. 13 (17), 1499-1505 (2003).</li><li>McQuary, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+S6K+Mutants+Require+a+Creatine-Kinase-like+Effector+for+Lifespan+Extension.">C. elegans S6K Mutants Require a Creatine-Kinase-like Effector for Lifespan Extension.</a> Cell Reports. 14 (9), 2059-2067 (2016).</li><li>Larance, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Proteomics+Analysis+of+the+Response+to+Starvation+in+C.+elegans+.">Global Proteomics Analysis of the Response to Starvation in C. elegans .</a> Molecular and Cell Proteomics. 14 (7), 1989-2001 (2015).</li><li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+energy+metabolism+contributes+to+the+extended+life+span+of+calorie-restricted+Caenorhabditis+elegans.">Enhanced energy metabolism contributes to the extended life span of calorie-restricted Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (37), 31414-31426 (2012).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

DNA, RNA ve proteinler, biomolecule izolasyonların yöntemleri kez teknik çakışmasını veya kombinasyonları optimize edilmiştir. Örnekleri elde etmek zordur bu hangi örnekleri aynı koşullar altında farklı zamanlarda hasat için neden olabilir özellikle dezavantajlı olduğunda. Hücresel yollar bağlı olarak farklı zamanlarda toplanan çoğaltır varyasyon oluşturabilir. Bu makale aynı zamanda oluşan yalıtım ve solucanlar, farklı yalıtım teknikleri tarafından tanıtılan varyasyonları azaltmayı örnek hasat zamanlama aynı örneği üzerinden her biomolecule arınma etkinleştirerek bu engeli aşmak için bir yordam sunar, veya eşit olmayan hasat. Bu değişkenler kontrol sadece zaman ve kaynak tasarrufu sağlar, ama aynı zamanda tekrarlanabilirlik kolaylaştırır. Burada, DNA ile değişken sonuçlar da olsa ödün RNA ve protein kalite, önler Kombinatorik yaklaşım göstermektedir. Hazırlıklar daha fazla prosedürleri temizlik DNA'yı kullanarak optimize edilebilir. Biz malzeme nematodunun C. elegans ve HeLa hücreleri kullanarak yaklaşım gösterdi.
Transcriptome ve N2 WT hayvan ve yemek-2 ve rsks-1 mutantlar Proteom keşfetmek daha önceki çalışma ömrü4,34,35 genişletme mekanizmaları da dahil olmak üzere çeşitli yollar içgörü teklif var ,36. Ömrü uzatma içinde kalori kısıtlaması mekanizmasının araştırmak için bir çaba olarak, genel bir downregülasyon küresel protein sentezi var kararlı izotop etiketleme tarafından/ile Amino asit hücre kültür (SILAC) analizi bu yemek-2 solucanlar bulundu 36. aynı hedefleri mRNA düzeyde büyük ölçüde arttıkça bile burada sunulan veriler bu bulgu ile tutarlıdır. Başka bir grup effectors uzun ömürlü S6K aracılı tanımlamak için amaçlı ve böylece, proteomik ekran rsks-1 solucanlar34uygulandı. RNAseq veri ile çalışmada bulundu, biz bu ekrandan tespit proteinler ile teyit en az üç genleri tespit; MRP-1 ve homologs neuroligin (F07C4.12) ve CPA differentially rsks-1 solucanlar WT N234karşılaştırıldığında ifade olarak keşfedilmiştir.
Bu yöntemi kullanarak oluşturulan veri önceki multiomic araştırmalar ile tutarlıdır. Dokuz hedefleri mRNA düzeyde her örnek protein seviyelerinde tahmin etmek için kullanılmıştır. Bu hedefler, çoğu mRNA düzeylerine göre tahmin edilebilir protein düzeyleri vardı. Yine de, mRNA ve protein düzeyleri arasında dikkate değer farklılıklar vardı. Da önemlisi, burada sunulan Protokolü bilim adamı güvenle değerlendirmek ve bu farklılıkların mRNA ve protein aynı örnekten toplayarak intersample değişkenlik kaldırarak yorumlamak sağlar. Ayrıca, aynı örnek toplanan veya benzer ama farklı örnek RIPA ile hasat toplanan protein düzeyleri mRNA düzeylere göre. Biz bunun için hedeflerin sayısı RIPA çıkarılan örnek protein çok daha düşük seviyede olduğunu gösterdi. İntersample varyasyon için kontrol olmadan, bu fark mRNA ve protein fark düzenlenmesi nedeniyle olsaydı bilmek imkansız.
Özellikle için bu farklı oluştururlar, en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralları vardır akılda tutmak önemlidir kesitsel bir analiz deneme nihai amacı yoksa, o zaman bu yöntemleri yerine istihdam için uygun olacaktır. DNA ve protein izole etmek için GTCp kullanarak onları daha az çözünür, DNA rekonstitüsyon NaOH gibi zayıf bir üs gerektiren ve deterjan ısıtmanın, eksik riski yüksek bir konsantrasyon ile bir tampon protein çözücü olmaya neden olur. solubilization. Ayrıca, GTCp guanidinium thiocyanate ve gibi proteaz enzimleri inaktive, asitli fenol içerir ancak yavaş yavaş protein zaman içinde donmuş sürece düşer. Bu sınırlamalar tuzağa değerli olması durumunda karar vermek için araştırmacı takdirine bağlı olacaktır.
Önemlisi, RNA, steril bir teknik, aksi belirtilmediği sürece örnek buz üzerinde tutarak ve ticari olarak mevcut fakat kullanımı ile çalışırken reaktif RNA sağlam tutmak için tavsiye edilir. Özellikle, daha büyük örnekleri daha fazla GTCp ile başlamak içinde her ayıklama solvent Ayrıca ölçekli gerekir gerekir. GTCp doğru miktarda kullanıldığında bu iletişim kuralı el ile herhangi bir homojenizasyon solucan veya hücre örneklerinin gerektirmez. DNA izolasyon bağlamında, verim yeterlilik organik (pembe) katman kurtarmak için son derece bağlıdır. Son olarak, protein solubilization yalıtım sırasında artırmak için resolubilization arabellek hacmi artan veya diğer deterjanlar SDS yanı sıra eklemek gerekli olabilir. Gerçekten de, bir salt yetişkin nüfusunun Worms yetişkin, larva ve yumurta karışımı yerine resolubilize daha kolay proteinlerdir.
Genel olarak, bu iletişim kuralını kullanan biomolecule izolasyonların için entegre bir yaklaşım sağlar ve ayrı ayrı biomolecules farklı--dan hasat ortaya çıkabilir mRNA ve protein düzeyleri arasında korelasyon ya da yokluğundan, yorumlanması kolaylaştırır örnekleri. Bu yöntemi kullanarak doğru hal nereye mRNA çeviri protein Bağdaşık değil ve posttranscriptional ve ardından düzenleyici mekanizmaları çeşitli koşullar altında derin soruşturma açabilir tanımlamak için bilim adamları yardımcı olabilirsiniz.

Multiomics, omics, genom, Proteom, transcriptome, epigenome, microbiome veya lipidome, gibi bir arada kullanan analitik yaklaşım büyük veri kümeleri için hastalık karakterizasyonu1işlerken giderek daha popüler hale geldi, 2. Montaj kanıt yaklaşımlar tek bir "ome" sınırlı (Rotroff ve Motsinger-Reif1tarafından gözden) eksik bir moleküler analiz sağlar göstermiştir. Özellikle yüksek üretilen iş teknikleri kullanarak ekranlar gerçekleştirirken büyük veri kümeleri oluşturulur, ancak tam bir resim "boyamak için" ya da en uygun hedefler belirlemek için multiomic yaklaşımlar tercih edilir. Multiomics yaklaşımlar kullanımı ile ancak, mRNA ve protein düzeyleri3,4,5,6arasındaki farklılıkları sık gözlem yoktur. Özellikle, mRNA ve yan yana transcriptomic ve RNA sıralama (RNAseq) ve sıvı Kromatografi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS), proteomik analizleri için sırasıyla, kullanılan protein kez aynı şekilde tedavi örneklerinden elde edilen farklı çoğaltır, varyasyon aynı arasında potansiyel olarak tanıtan3,4,5,6koşulları. Harvald ve ark. gerçekleştirilen bir zarif transcriptome ve vahşi-türü (WT) Proteom göre C. elegans açlık zaman-ders çalışmada solucanlar bu uzun ömürlü bir önemli transkripsiyon faktör eksikliği hlh-30 mutant solucanlar 7. Not, RNA ve protein aynı örnekten çok değil aynı koşul çoğaltır üzerinden hasat edildi. Onların bulgular mRNA düzeyleri ile her zaman bir noktada protein düzeyleri düşük bir korelasyon göstermektedir (r = 0.559-0.628). Aslında, onların heatmap dört kümeleri kurdu: mRNA büyük bir düşüş vardı küme düzeyleri ama az veya hiç karşılık gelen protein düzeyleri azalma, küme II mRNA düzeylerinde artış protein düzeyleri ama az veya hiç artış vardı, küme III mRNA bir artış vardı düzeyleri ancak protein düzeyleri ve küme IV bir düşüş bir mRNA düzeylerinde artış ama protein düzeyleri4sadece ince bir değişiklik vardı. Ayrıca, bu intersample varyasyon nerede aynı durumda örnekleri tam olarak aynı zamanda toplanan değil durumlarda tanıttı. Örneğin, mRNA ve proteinler sirkadiyen döngüsü tarafından düzenlenmiş bağlı olarak gün8,9saat veya daha ayrıntılı olarak, C. elegans pozlama ışık9dalgalanma; ifade bu sirkadiyen proteinlerin gen ifade indüksiyon10sonra 8 saat kadar gecikebilir. Yine de, bu gözlem yaygınlığı mutlaka yanlış bir şey gelmez; Aslında, bu bilgilendirici olarak kanıtlamak. Protein ve mRNA dinamik devamlı oluşumu ve yıkımı arasında bulunmaktadır. Ayrıca, proteinler kez posttranslationally istikrarı artırmak veya onların yıkımı11ikna etmek için değiştirilir. Örneğin, ubiquitination durumlarını etkinleştirme veya proteasome veya lysosome bozulması12için hedefleme yol açabilir. Ayrıca, kodlamayan RNA'ların transkripsiyon ve posttranscriptional aşamaları13gen ifadesinin düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Böylece, soru biz nematodunun bu çalışmalarda gözlemlemek tutarsızlıkları gerçek olduğunu doğrulamak için değişkenleri sınırlamak nasıl olduğunu.
Burada, intersample değişkeni aynı örnekten farklı oluştururlar analizlerini izin vererek siler bir yöntem öneriyorum. Bu iletişim kuralı sürekli bir çaba varyasyon azaltmak, tekrarlanabilirlik geliştirmek için DNA, RNA ve protein (solucan da bilinir) C. elegans tek bir örnek üzerinden izole etmek için bir yöntem sağlar ve yorumların kolaylaştırmak için hedeftir. Zaman ve kaynak tasarrufu kazanıyor ve büyümek ve korumak zor olan suşları dahil olmak üzere değerli ve sınırlı örnekleri, kesitsel analizini kolaylaştıran örnek toplama sırasında aynı örnek kullanarak ek yararları içerir farklı düzenleme intrasample değişimler mRNA ve protein düzeyleri temel oluştururlar, anlayışlar.
Bu yöntem gen ifadeleri ve solucanlar, moleküler işleme kadar birden çok düzeyde daha kapsamlı bir değerlendirme için izin tek bir örnek protein düzeyleri değerlendirmek için uygundur. Guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform (GTCp) Reaktif14, RNA, izole etmek için yaygın olarak kullanılan bir kimyasal solucanlar, sonraki yağmur damlaları, çamaşır ve solubilization her ile nükleik asitler ve protein çıkarılması için kullanılır. Bu iletişim kuralı C. elegans, odaklanarak tasarlanmış küçük değişiklikler ile çeşitli protokolleri15,16 derlenmiştir ama biz de başarıyla DNA RNA ve protein takip HeLa hücreleri Pelet izole ettim aynı adımları. Her ne kadar burada test değil, bu dokular üzerinde de17,18çalışma olasılığı bir protokoldür.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#8211;15% Mini-PROTEAN&#174; TGX Stain-Free&#8482; Protein Gels</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>4568084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CePAS7-s</td>
			<td>DHSB- U of Iowa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CeTAC1-s</td>
			<td>DHSB- U of Iowa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DLG1-s</td>
			<td>DHSB- U of Iowa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRP78</td>
			<td>Novus Bio.</td>
			<td>NBp1-06274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP Goat Anti-Mouse</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-80010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP Goat Anti-Rabbit</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>92680011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSP60-s</td>
			<td>DHSB- U of Iowa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LMP1-s</td>
			<td>DHSB- U of Iowa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRP-1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuroligin 3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab172798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-actin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1501R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc MP Imaging System</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C298-500</td>
			<td>Health hazard, Irritant, Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue</td>
			<td>ThermoSci</td>
			<td>20279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Protein assay</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>500-0116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoch 2 microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (200 proof)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>04-355-223</td>
			<td>Flammable, health hazard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td>BSL2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1708840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydra microdispenser: Matrix Hydra</td>
			<td>Robbins/ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A516-4</td>
			<td>Flammable, health hazard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 buffer: 
			3 g KH2PO4 
			6 g Na2HPO4 
			5 g NaCl 
			Add H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving. 
			After solution cools down, add 1 mL sterile 1 M MgSO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli Sample Buffer (2x)</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>ThermoSci</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE apparatus</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J60744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>25 nmole DNA Oligo with Standard Desalting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dlg-1: F (5&#39;-GGTCCTACCA GGCAGTTGAG-3&#39;) 
			 R (5&#39;-CACGTCCGTT AACCTCTCCC-3&#39;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hsp-4: F (5&#39;-AGAGGGCTTT GTCAACCCAG-3&#39;) 
			 R (5&#39;-TCGTCAGGGT TGATTCCACG-3&#39;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hsp-70: F (5&#39;-CGGCATGTGA ACGTGCTAAG-3&#39;) 
			 R (5&#39;-GAGCAGTTGA GGTCCTTCCC-3&#39;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hsp-60: F (5&#39;-ATTGAGCAAT CGACGAGCGA-3&#39;) 
			 R (5&#39;-CAACACCTCC TCCTGGAACG-3&#39;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lmp-1: F (5&#39;-ACAACAACAC CGGACTCACG-3&#39;) 
			 R (5&#39;-ATCGAGCTCC CACTCTTTGG-3&#39;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tac-1: F (5&#39;-AGTGGCAGGC AAAGTTCCTC-3&#39;) 
			 R (5&#39;-TGAGCACCTT GATCTCGTCG-3&#39;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pas-7: F (5&#39;-GTACGCTCAA AAGGCTGTCG-3&#39;) 
			 R (5&#39;-CTGAATCGGC ATTGGCTCAC-3&#39;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mrp-1: F (5&#39;-TTTGCCTTGC GCTTGTTCTG-3&#39;) 
			 R (5&#39;-AGTTCCAGTG CGGAGCATAC-3&#39;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F07C4.12: F (5&#39;-TGCTGAGCAT GAAGGACTGT-3&#39;) 
			 R (5&#39;-TGGCAATAGC TCCTCCGTTG-3&#39;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HK Actin: F (5&#39;-CTACGAACTT CCTGACGGACAAG-3&#39;) 
			 R (5&#39;-CCGGCGGACT CCATACC-3&#39;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HK cyn-1: F (5&#39;-GTGTCACCAT GGAGTTGTTC-3&#39;) 
			 R (5&#39;-TCCGTAGATT GATTCACCAC-3&#39;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HK nhr-23: F (5&#39;-CAGAAACACT GAAGAACGCG-3&#39;) 
			 R (5&#39;-CGATCTGCAG TGAATAGCTC-3&#39;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HK ama-1: F (5&#39;-TGGAACTCTG GAGTCACACC-3&#39;) 
			 R (5&#39;-CATCCTCCTT CATTGAACGG-3&#39;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HK cdc-42: F (5&#39;-CTGCTGGACA GGAAGATTACG-3&#39;) 
			 R (5&#39;-CTCGGACATT CTCGAATGAAG-3&#39;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HK pmp-3: F (5&#39;-GTTCCCGTGT TCATCACTCAT-3&#39;) 
			 R (5&#39;-ACACCGTCGA GAAGCTGTAGA-3&#39;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 96 qPCR machine</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer: 10 mM Tris-Cl (pH 8.0) 
			1 mM EDTA 
			1% Triton X-100 
			0.2% SDS 
			140 mM NaCl 
			1 tablet of Roche protease inhibitor per 20 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Supermix</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1725274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Femto Max Sens Substrate</td>
			<td>ThermoSci</td>
			<td>34095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Transfer apparatus</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer Pack</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>170-4159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Health hazard (skin, eyes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm strains:</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 (wild type)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eat-2 (MAH95)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rsks-1 (VB633)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined nucleotide and protein extractions in caenorhabditis elegans

Tek bir biyolojik örnek bir bolluk bilgi tutar, ve şimdi aynı anda birden çok düzeyde moleküler işleme ve değişiklikleri farklı koşullar arasında tam bir resim yakalamak için birkaç oluştururlar araştırmak için yaygın bir uygulama. Bu iletişim kuralı DNA, RNA, yalıtma yöntem sunar ve Yuvarlak solucanlar bu biomolecules çoğaltır izole olduğunda tanıttı değişim kaldırmak için Caenorhabditis elegans aynı örnek protein ama sonuçta aynı şekilde tedavi farklı örnekler. Nükleik asitler ve protein sonraki yağmur damlaları, çamaşır ve solubilization her ile asit guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform ayıklama yöntemini kullanarak Yuvarlak solucanlar gelen ayıklanır. Biz başarılı yalıtım RNA, DNA ve protein üç soy-in yuvarlak solucanlar ve yetişkin hayvanlarda daha iyi protein yalıtım sonuçlarla HeLa hücreleri tek bir örnekten üzerinden göstereceğim. Ayrıca, guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform-çıkarılan protein nematodlar immunoblotting, protein geleneksel RIPA çıkarımı karşılaştırıldığında tarafından gözlemlediği gibi gelişmiş tespit düzeyi ile daha büyük proteinlerin çözünürlüğünü artırır.
Burada sunulan yöntem özellikle Proteom ve transcriptome arama için bir multiomic yaklaşım kullanarak örnekleri soruşturma zaman yararlı olur. Tamamlayıcı seviyelerde gerçekleşmesi için moleküler sinyal temel karmaşık biyolojik olayları düşündüm çünkü aynı anda değerlendirmek multiomics teknikleri itiraz ediyorlar; Ancak, mRNA düzeyleri değişiklikleri her zaman protein düzeyleri aynı değişikliği yansıtmaz ve toplama zamanı sirkadiyen düzenlemeler bağlamında ilgili görmek için giderek daha yaygın hale gelmiştir. Bu yöntem intersample herhangi bir değişiklik (intrasample.) aynı örnek içinde farklı içeriği raporlaması kaldırır

RNA, DNA ve protein örnekleri analiz edildi ve RNA ve protein yalıtır kullanarak temsilcisi sonuçları burada sunulmuştur. Ayrıca, ortak RIPA lizis yöntemi22GTCp yöntemini kullanarak hasat protein örnek karşılaştırın. Deneyimiz için biz her WT (N2) solucanlar ve iki uzun ömürlü mutant solucanlar, yemek-2 ve rsks-123,24dört bağımsız çoğaltır kullanılır.
RNA ve DNA miktar ve kalite
Ne zaman su 50 µL içinde resuspended RNA konsantrasyonu arasında değişiyordu 0.2-2 den µg/µL, solucanlar gibi başlangıç materyali yaklaşık 3.000 yetişkin kullanarak. Saflık belirtmek, Absorbans oranları fenol veya guanidin hidroklorür gibi GTCp bileşenleri ile kirlenme olmadan RNA'ın çıkarma başarılı gösteren 2.0 2.2 için A260/A280 ve 1.9-2.5 A260/A230 (Tablo 1), için için arasında değişiyordu.
DNA ekstraksiyon başarılı oldu, ancak kalite değişken oldu. 1.1 µg/µL 0,04 değişiyordu NaOH 150 µL resuspended zaman DNA toplama. DNA'ın başarılı ayıklama gösteren 1.8 2.1 için A260/A280 ve 0,9-1.6 için değişiyordu (Tablo 1), A260/A230 için Absorbans oranları; Ancak, bazı örnekleri fenol veya guanidin hidroklorür gibi GTCp bileşenleri ile kontamine. DNA izolasyon gerekli ise, Orta tabaka GTCp faz ayrılması ayıran zaman bakım alınması gerekir ve daha fazla yıkamak gerekli olabilir.
RT-qPCR seçilen hedeflerin
Dört bağımsız örnekleri RNA izolasyonu her solucan baskı başarılı oldu ve RNAseq analiz için sonraki RT-siyanür boya içeren bir supermix kullanılarak yapılan qPCR ile gönderildi. RT-qPCR tarafından analiz hedefleri bir veri kümesinden yaygın olarak her iki mutantlar WT solucanlara kıyasla en differentially düzenlenmiş genler dayalı büyük RNAseq seçildi. F07C4.1225, homolog insan neuroligin 3, izoformu b, için Seçili paylaşılan upregulated hedef oldu. Biz de her iki mutantlar, mrp-126, yemek-2 kurt upregulated ama downregulated rsks-1 solucanlar, ek çözümleme arasında differentially düzenlenmiş bir gen dahil. Mrp-1 ' in ifade değişiklikleri RT-qPCR yolu ile teyit edildi; Ancak, rsks-1 solucanlar göre RNAseq analiz tahmin F07C4.12 upregulation RT-qPCR tarafından (şekil 1) görülen değildi.
Solucanlar için doğrulanmış antikorlar ile ek hedefleri de araştırıldı. Bu Hadwiger vd.27' karakterize birkaç organel işaretleri dahil. Bu işaretler bir dizi differentially mutant solucanlar mRNA düzeyinde ifade edildi. Şekil 1' de görüldüğü gibi lmp-128 ve dlg-129 upregulated yemek-2 solucanlar vardı; HSP-4 30, hsp-7030ve lmp-1 rsks-1 solucan upregulated vardı; HSP-60 31 ve pas-732 downregulated yemek-2 solucanlar vardı; HSP-60 ve tac-133 downregulated rsks-1 solucan vardı.
Eşzamanlı vs RIPA protein hazırlık
Yukarıda açıklandığı gibi GTCp yöntemi ile verimliliği ve protein kalitesini teyit için biz bu protein RIPA lizis22daha geleneksel yöntemi kullanarak toplanan göre. Malzeme, yani sadece yetişkin (yaklaşık 10.000 solucanlar) ya da yetişkin, larva ve yumurta (yaklaşık 130.000 solucanlar), karışık bir nüfusa başlayan aynı miktarda kullanarak GTCp ile toplanan genel miktarı daha az eşit son birimleri (Tablo 1 resuspended zaman oldu ); Ancak, bir salt yetişkin nüfus çıkarma nüfus daha başarılı oldu. Ayrıca, proteinlerin kalitesini benzer, de olsa GTCp çıkarılan protein daha iyi çözünürlüğe sahip toplam protein, eşit yükleme üzerine büyük proteinler Şekil 2Coomassie leke tarafından gösterildiği gibi gösterdi. Gerçekten de, şekil 3 western blot tarafından değerlendirilen hedefleri benzer düzeyleri çoğu durumda gösterdi; Ancak, 75 kDa büyük protein düzeyi düşük GTCp çıkarılan protein için (şekil 3A, sağ şeride; karşılaştırıldığında RIPA çıkarılan protein gösterdi Şekil 3B, sarı bar).
Burada sunulan ayıklama yöntemi Ayrıca memeli hücre satırı HeLa değerlendirilmiştir. Başvuru için RIPA ile altı milyon HeLa hücreleri (~ 25 µL pelet) kompakt bir Pelet çıkarılan protein miktarı solucanlar (bir ~ 75 µL kompakt pelet) bir 130.000 karışık popülasyondan ayıklanmış karşılaştırılabilir veya yaklaşık yarısı ne ayıklanır 10.000 Yetişkin solucanlar (bir ~ 100 µL yerçekimi yerleşmiş pelet), olarak görülen Tablo 1. Biz RIPA çıkarılan protein HeLa hücreleri, göre GTCp bu teknik daha iyi bir yetişkin nüfusu çalışıyor düşündüren protein ayıklama (Tablo 1) verimliliğini ve daha büyük proteinler (Şekil 2) çözünürlüğe azalma gösterir solucanlar. Protein Pelet HeLa GTCp çıkarılan protein üzerinden eksik solubilization memeli hücrelerinde bu yöntemin bir sınırlaması olabilir.
RT-qPCR tarafından analiz Immunoblotting hedefleri
Daha sonra biz mRNA düzeyleri protein düzeyleri ile ilişkili Eğer belirlemek için RT-qPCR tarafından test gen ürünlerinin protein düzeyleri araştırdık. Şekil 3' te görüldüğü gibi ortalama ifade değişiklikleri protein için birçok hedefleri değişti ortalama mRNA ifadeleri ile korelasyon; Ancak, bazı protein düzeyleri mRNA düzeyleri değişiklikleri yansıtmak değildir. Genellikle, yemek-2 solucanlar mRNA seviyelerinde daha fazla olan diğer suşların daha yüksek, ancak her iki aynı olduğunu veya aynı hedef diğer suşların düşük protein düzeyleri. Dlg-1 çok yüksek düzeyde en önemli gözlemin mRNA daha fazla protein; çevirmek değil yemek-2 solucanlar Aslında, ne zaman diğer suşları için (şekil 3) göre daha düşük dlg-1 protein düzeyleri vardı.
Son olarak, GTCp çıkarılan protein ve RIPA çıkarılan protein düzeyleri çarpıcı bir farklılık göstermiştir. RNA her ikisi için aynı şekilde ayıklandı; Ancak, özellikle için o 75 kDa (şekil 3A, sağ şeride; büyük protein düzeyleri, belirgin gösterdi RIPA lizis tarafından toplanan benzer ama ayrı örnek azaltılmış Şekil 3B, sarı bar).
İntrasample mRNA ve protein düzeylerinin karşılaştırılması
Bu iletişim kuralı amaçlarından biri de değişim mRNA gördüğümüz ve protein seviyesini gerçekti, yoksa bu intersample varyasyon bir obje olabilir belirlemek için yapıldı. Şekil 4' te, bir alt hedefler içinde tek örnekler karşılaştırıldı. Tek tek her örnek aynı gölge ve renk örneği 1 en koyu gölge ve örnek 4 en hafif gölge gri (WT), mavi (ye-2) veya kırmızı (rsks-1) varlık ile nokta olarak gösterilir. Çoğu örnekleri içinde mRNA düzeyleri düşük bir değişkenlik büyük değişkenlik protein düzeyinde bir açığı Batı lekesi semiquantitative analizi ile vardı. Her bir renkli noktalar mRNA ve protein çiftleri arasındaki konumunu bakıldığında, yüksek-için-en düşük sırasını kez aynı değil; Örneğin, WT içinde 4, örnek hsp-60 mRNA sipariş edildi 3, 2, 1, ama protein düzeyleri vardı 1, 2, 3, 4. Böylece, kesinlikle bir örnek içinde mRNA ve protein düzeyleri arasında farklılıklar var, ama koleksiyon gözlenen fark olası bir kaynak olarak zaman kaldırmak için kullanıcılara sunulan yöntem sağlar.
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59178/59178table1.jpg"> Tablo 1: konsantrasyonları ve emme oranları. RNA ve DNA konsantrasyonları ve saflık oranları bir Spektrofotometre üzerinde ölçüldü. Protein konsantrasyonları Renkölçer protein miktar tahlil kullanılarak belirlenmiştir. Gri, mavi ve kırmızı RT-qPCR ve western blot için kullanılan örnekleri vurgulayın. Sarı RIPA protein çekme ya da solucan protein HeLa protein GTCp karşılaştırmak için kullanılan örnekleri gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59178/Table_1.xlsx">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59178/59178fig1.jpg"> Şekil 1: gen ekspresyonu tarafından RT-qPCR. RT-qPCR analiz RNAseq verilerden ve organel marker gen tespit hedefleri teyit bu yöntemle elde edilen mRNA için. Hata çubuklarını temsil eden standart sapma; n = 4. MRNA konsantrasyonu astar her kümesi için standart bir eğri karşı tanımlanmıştır. Tüm mRNA düzeyleri ortalama altı temizlik genler Yasası-1, cdc-42, ama-1, nhr-23, pmp-3ve cyn-1başvuru genler kullanılan bir dizi için normalleştirilmiş. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59178/59178fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59178/59178fig2.jpg"> Şekil 2: karşılaştırma GTCp-solucanlar ve HeLa hücreleri protein RIPA ayıklanır karşı. Vahşi-tipi (WT) solucan veya GTCp veya RIPA lizis yöntemi, SDS-PAGE tarafından ayrılmış ve ile Coomassie mavi lekeli ile hasat HeLa hücreleri toplam protein. Her lane 25 µg toplam protein içerir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59178/59178fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59178/59178fig3.jpg"> Şekil 3: Protein düzeyleri solucanlar. (A)Western blot hedeflerinden RT-qPCR ve (B) Dansitometresi analiz için sinyal yoğunluğu tarafından araştırıldı. Her lane 20 µg vahşi-tipi (WT), yemek-2veya rsks-1 mutant solucanlar toplam GTCp çıkarılan protein içerir. Görüntü gösterilen dört bağımsız çoğaltır solucan zorlanma başına bir gösterimidir. Β-aktin (alt) denetimine her hedef için eşit yükleme için kullanılan; yalnızca bir temsilci kümesi gösterilir. Sağ şeride 20 µg rsks-1 mutant solucanlar gelen toplam RIPA çıkarılan protein içerir. (B) sorumlu sinyal yoğunluklarda sayısal ImageJ kullanarak. Hata çubuklarını temsil eden standart sapma; n = 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59178/59178fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59178/59178fig4.jpg"> Şekil 4: Intrasample mRNA ve protein düzeyi karşılaştırması. Bir alt kümesindeki her zorlanma için hedefleri bireysel örneklerinden mRNA ve protein düzeyleri hizalanır. Tablo 1temsilcisi rengidir. Gri/siyah WT mavi yemek-2ve kırmızı rsks-1. mRNA ve protein aynı hedef yan yana eşleştirilmiş ve nematodunun zorlanma tarafından ayrılmış. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59178/59178fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Burada, varyasyon azaltmak, tekrarlanabilirlik geliştirmek ve yorumların kolaylaştırmak amacıyla bir protokol RNA, DNA ve protein aynı örnekten izolasyonu için mevcut.

Kombine nükleotit ve Caenorhabditis elegans Protein çekimi

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Bu protokolün örnekler arası değişimi kaldırmak için kullanılması, mRNA ve protein düzeyleri arasındaki numune içi tutarsızlıklara dayalı makromoleküllerin diferansiyel regülasyonu hakkında öngörüler sunabilir. DNA, RNA ve proteini izole etmek için aynı örneği kullanmak değişkenliği azaltmak, tekrarlanabilirliği artırmak ve yorumlamayı kolaylaştırmak için bir girişimdir. Avantajlar, numune toplama ve değerli ve sınırlı numunelerin kesit analizi sırasında kaydedilen zaman ve kaynakları içerir.Başlamak için, uygun büyüme koşulları ile bir 10 santimetre plaka içinde tohum 1,000 solucan yumurtası. 72 saat boyunca 20 derecede kuluçkaya yat. Daha sonra, 5 mililitre M9 tamponu ile plakayı yıkayın ve 1.000 yetişkin solucanı bir tüpe aktarın.Solucanları 1,000 g'da bir dakika lığına santrifüj edin, süpernatantı atın ve bir mililitre M9 tamponuyla peletlenmiş solucanları 1,5 mililitrelik mikrosentrifüge tüpüne aktarın. Bir dakika için 845 g tekrar santrifüj ve supernatant en atın. Peletlenmiş solucanları eksi 80 derecede dört saatten fazla saklayın.Daha sonra, çözülmüş pelet herhangi bir supernatant kaldırın. Bir mililitre soğuk GTCP reaktifi ekleyin, yukarı ve aşağı borular oluşturarak iyice karıştırın ve numuneyi 10 dakika boyunca buzüzerine yerleştirin. Sonra, soğuk kloroform 200 mikrolitre ekleyin.Tüpü 15 saniye boyunca şiddetle çalkalayın ve oda sıcaklığında üç dakika bekletin. Sonra, 13, 500 g dört santigrat derece 15 dakika boyunca tüp santrifüj. Bir mikro pipet ile, yeni bir RNase-free 1.5 mililitre mikro-santrifüj tüp içine net üst tabaka aktarın.Bulutlu beyaz interfaz tabakasını B2 etiketli yeni bir tüpe aktarın ve pembe katmanı kalan peletten B etiketli yeni bir tüpe aktarın ve her ikisini de buza yerleştirin. Üç katmanı açıkça ayırmak zor olabilir. Bu tabakadan gelen DNA'yı organik ya da pembe tabakadan çöktürmektense bulutlu interfaz tabakasını kendi tüpüne aktarmanızı öneririm.RNA izole etmek için, ilk RNA çöktürmek için tüp A için% 100 isopropanol 500 mikrolitre ekleyin. Daha sonra tüpü oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra tüpü 13, 500 g'da 4 derece santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin.Sonra, supernatant atın ve pelet yıkamak için tüp A% 75 etanol bir mililitre ekleyin. Tüpü 5, 300 gr'da dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin. Supernatant atın ve pelet 5 ila 10 dakika kuru izin.RNA pelet yeniden oluşturmak ve 10 dakika boyunca 55 ila 60 santigrat derece pelet kuluçka ya da rNase içermeyen su 50 mikrolitre ekleyin. Son olarak, 260 nanometre de izole RNA konsantrasyonu ölçmek ve 230 ve 280 nanometre herhangi bir yabancı maddeleri belirlemek için bir spektrofotometre kullanın. DNA'yı izole etmek için, önce B tüpündeki organik faza ve B2 tüpündeki bulutlu beyaz tabakaya 300 mikrolitre ekleyin, DNA'yı çökeltin, ters çevrilerek karıştırın ve tüpleri oda sıcaklığında iki ila üç dakika bekletin.Sonra, santrifüj tüplerI B ve B2 376 g dört santigrat derecede beş dakika boyunca DNA pelet. B ve B2 tüplerinden gelen süpernatantı C etiketli yeni bir iki mililitrelik tüpte birleştirin ve sonraki protein izolasyonu için buzda bırakın. Daha sonra, 30 dakika boyunca% 10 etanol 0.1 molar sodyum sitrat bir mililitre ile tüp B2 DNA pelet yıkayın.Santrifüj tüp B2 376 g dört santigrat beş dakika için santigrat g. Yıkama adımını tekrarlayın ve peleti 1,5 mililitre %75 etanolde tekrar askıya alın ve 20 dakika oda sıcaklığında bırakın. Sonra, santrifüj tüp B2 376 g dört derece santigrat beş dakika ve sonra supernatant atın ve pelet beş ila 10 dakika kurumasını bekleyin.Sekiz mililitre sodyum hidroksit 150 mikrolitre pelet çözün. Sonra, numuneyi 376 g'da dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin. Son olarak, bir mikropipet ile, yeni bir tüp DNA içeren supernatant aktarın.İzole DNA konsantrasyonu ölçmek için bir spektrofotometre kullanın 260 nanometre ve 230 ve 280 nanometre herhangi bir yabancı maddeleri tanımlamak için. Proteini çökeltmek için, ilk olarak 1,5 mililitreye kadar %100 isopropanol ekleyin, c tüpündeki pembe süpernatana, birkaç kez ters çevirerek karıştırın ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Sonra, 13, 500 g'da 10 dakika boyunca 4 santigrat derecede c'de santrifüj tüpü.Supernatant atın ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 95 etanol 0.3 molar guanidin hidroklorür iki mililitre ile pelet yıkayın. Tüpü tekrar 5, 300 g'da dört santigrat derecede beş dakika bekleyin ve yıkama adımını eskisi gibi tekrarlayın. Protein peletini C2 etiketli yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın ve 1,5 mililitreye kadar %95 etanol, girdap ekleyin ve 20 dakika oda sıcaklığında oturmasına izin verin.Tüpü 5, 300 gr'da dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin. Supernatant atın ve 10 dakika oda sıcaklığında pelet kuru masını bekleyin. Daha sonra, 60 dakika boyunca 50 santigrat derecede 50 derece SDS 300 mikrolitre pelet eritin.Son olarak, 10 dakika boyunca 17 santigrat derece 13, 500 g tüp santrifüj. Ve protein içeren süpernatantı yeni bir tüpe aktarın. Nicel ters transkripsiyon PCR gerçekleştirmek için.İlk olarak, ters transkripsiyon ile cDNA hazırlamak için izole RNA bir nanogram kullanın. CDNA bir stok plaka yapmak için, 96 kuyu plaka bireysel kuyulara her cDNA örnek 100 mikrolitre ila 100 seyreltme ekleyin, su sadece kuyular ve seri seyreltilmiş numuneler gibi uygun kontrolleri içerir, her gen için astar verimliliği kurmak için. Astar her set için bir ana karışımı yapmak için, su yedi mikrolitre kadar ekleyin, bir DNA-intercalating siyanür boya, ve beş mikro-molar her ileri ve ters astar.Bir RT-qPCR plakauygun kuyulara ana karışımı yedi mikrolitre ekleyin. Daha sonra, stok plakasından cDNA'nın üç mikrolitresini ekleyin ve kullanılan astarlara uygun bir RT-qPCR protokolü kullanarak plakayı çalıştırın. Rt-qPCR, RNA seq tahlilinde belirlenen hedefleri doğrulamak için üç solucan suşunun dört bağımsız örneğinden izole mRNA'ların analizi yapıldı.F07C4.12 geni eat-2 solucanlarında her iki tahlilde de düzenlendi, ancak rsks-1 solucanlarında regülasyonu RT-qPCR testi ile tespit edilmedi. Ayrıca, RNA seq eat-2'de mrp-1 ve rsks-1 solucanlarında ekspresyon değişiklikleri RT-qPCR ile doğrulandı. Mutant solucanlarda organel marker genlerinin yükselticisi veya aşağı regülasyonu da RT-qPCR analizi ile saptandı.GtCp ile RIPA'dan çıkarılan proteinlerin SDS sayfası ile ayrılan ve coomassie mavisi ile boyanmış solucanlarda karşılaştırılması, GTCp'den çıkarılan proteinler için daha büyük proteinlerin daha iyi çözünürlüğü ile benzer bir kalite göstermiştir. Batı leke analizi çoğu durumda benzer protein düzeyleri gösterdi;ancak, proteinler 75 kilodalton daha büyük RIPA çıkarılan protein daha düşük seviyelerde gösterdi. Üç solucan suşunun dört ayrı örneğinden alınan hedefler mRNA ve protein düzeyleri arasındaki karşılaştırma, protein düzeyinde daha fazla değişkenliğe sahip mRNA düzeylerinin düşük değişkenlik gösterdiğini göstermiştir.DNA izolasyonu bağlamında verim, bulutlu interfaz tabakasını organik veya pembe tabakadan kurtarma yeterliliğine son derece bağlıdır. Resolubilizasyon tampon hacmini artırarak veya SDS yanında diğer deterjanlar ekleyerek pelet proteinlerin çözünürhale artırmak için gerekli olabilir. Bu yöntemin kullanılması, mRNA'nın proteine çevrilmesi ile eşakraba olmayan durumların doğru bir şekilde belirlenmesine yardımcı olabilir ve çeşitli koşullar altında transkripsiyon sonrası ve çeviri sonrası düzenleyici mekanizmaların daha derin araştırılmasına yol açabilir.Laboratuarımızda, bu protokol değerli ve sınırlı süreli çekirdek örneklerini korumak için kullanılmıştır. Ayrıca, bu sirkadiyen ritim alanında benimsemek için yararlı bir protokol olacağını hayal edebiliyorum. RNA izolasyonunda kullanılan GCTP reaktifi ve çözücüler tehlikelerdir ve dikkatli kullanılmalıdır.

Research

JoVE Journal

Biology

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

İzolasyon ve In vitro Etkinleştirme Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Katı Plaka tabanlı Diyet Kısıtlama Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Erken Embriyo Oluşumu Zaman atlamalı Mikroskopi Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Temel<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Yöntem: Senkronizasyon ve Gözlem

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Ekstraksiyon ve Analiz<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

yetiştirme<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Laboratuvarı Üç boyutlu

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Yöntemleri ile Caenorhabditis elegans çağda doğal Protein toplama çalışma değişikliklere

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

Protein hücre altı yerelleştirme yeşil floresans Protein etiketleme ve 4', 6-Diamidino-2-phenylindole Caenorhabditis elegans içinde boyama tarafından tespit

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Oksijen tüketimi oranlarında sağlam Caenorhabditis elegans ölçümü

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...