Name: morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea
Uploaded: 2019-05-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Kinas National Natural Science Foundation (81770997, 81771016, 81830030); det fælles finansieringsprojekt i Beijing Natural Science Foundation og Beijing Education Committee (KZ201810025040); Beijing Natural Science Foundation (7174291); og China postdoc Science Foundation (2016M601067).

Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med NRC/ILAR guide til pleje og brug af forsøgsdyr (8. udgave). Studieprotokollen blev godkendt af den institutionelle dyrepleje-og anvendelses Komité for Capital Medical University, Beijing, Kina.
1. udvælgelse af dyr
<ol><li>For alle eksperimenter, brug voksne C57BL/6J hanmus (8 uger gammel) som dyremodel. Bemærk: C57BL/6J mus med en Splice variant af Cdh23 udviser accelereret senescens i auditiv systemet, afs...

<ol>
	<li>Lie, A., Skogstad, M., Johnsen, T. S., Engdahl, B., Tambs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+notched+audiograms+in+a+cross-sectional+study+of+12,055+railway+workers.">The prevalence of notched audiograms in a cross-sectional study of 12,055 railway workers.</a> Ear and Hearing. 36 (3), 86-92 (2015).</li><li>Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+transduction,+tuning,+and+synaptic+transmission+in+the+mammalian+cochlea.">Hair cell transduction, tuning, and synaptic transmission in the mammalian cochlea.</a> Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).</li><li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cochlear+frequency+map+for+the+cat:+labeling+auditory-nerve+fibers+of+known+characteristic+frequency.">The cochlear frequency map for the cat: labeling auditory-nerve fibers of known characteristic frequency.</a> Journal of the Acoustical Society of America. 72 (5), 1441-1449 (1982).</li><li>Fettiplace, R., Kim, K. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+mechanoelectrical+transduction+channels+in+hearing.">The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing.</a> Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).</li><li>Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiological+place-frequency+map+of+the+cochlea+in+the+CBA/J+mouse.">A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse.</a> Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).</li><li>Viberg, A., Canlon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+guide+to+plotting+a+cochleogram.">The guide to plotting a cochleogram.</a> Hearing Research. 197 (1-2), 1-10 (2004).</li><li>Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+exposure+modulates+cochlear+inner+hair+cell+ribbon+volumes,+correlating+with+changes+in+auditory+measures+in+the+FVB/nJ+mouse.">Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse.</a> Scientific Reports. 6, 25056 (2016).</li><li>Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+after+noise+exposure:+acceleration+of+cochlear+synaptopathy+in+"recovered"+ears.">Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears.</a> Journal of Neuroscience. 35 (19), 7509-7520 (2015).</li><li>Wichmann, C., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+structure+and+function+of+inner+hair+cell+ribbon+synapses.">Relating structure and function of inner hair cell ribbon synapses.</a> Cell and Tissue Research. 361 (1), 95-114 (2015).</li><li>Matthews, G., Fuchs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+roles+of+ribbon+synapses+in+sensory+neurotransmission.">The diverse roles of ribbon synapses in sensory neurotransmission.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 812-822 (2010).</li><li>Liberman, L. D., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+maturation+of+auditory-nerve+heterogeneity,+as+seen+in+spatial+gradients+of+synapse+morphology+in+the+inner+hair+cell+area.">Postnatal maturation of auditory-nerve heterogeneity, as seen in spatial gradients of synapse morphology in the inner hair cell area.</a> Hearing Research. 339, 12-22 (2016).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximal+number+of+pre-synaptic+ribbons+are+formed+in+cochlear+region+corresponding+to+middle+frequency+in+mice.">Maximal number of pre-synaptic ribbons are formed in cochlear region corresponding to middle frequency in mice.</a> Acta Oto-Laryngologica. 138 (1), 25-30 (2018).</li><li>Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+synaptopathy+in+acquired+sensorineural+hearing+loss:+Manifestations+and+mechanisms.">Cochlear synaptopathy in acquired sensorineural hearing loss: Manifestations and mechanisms.</a> Hearing Research. 349, 138-147 (2017).</li><li>Moser, T., Starr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+neuropathy--neural+and+synaptic+mechanisms.">Auditory neuropathy--neural and synaptic mechanisms.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (3), 135-149 (2016).</li><li>Yu, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Gata3-Mafb+transcriptional+network+directs+post-synaptic+differentiation+in+synapses+specialized+for+hearing.">A Gata3-Mafb transcriptional network directs post-synaptic differentiation in synapses specialized for hearing.</a> Elife. 2, 01341 (2013).</li><li>Buniello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wbp2+is+required+for+normal+glutamatergic+synapses+in+the+cochlea+and+is+crucial+for+hearing.">Wbp2 is required for normal glutamatergic synapses in the cochlea and is crucial for hearing.</a> EMBO Molecular Medicine. 8 (3), 191-207 (2016).</li><li>Gilels, F., Paquette, S. T., Beaulac, H. J., Bullen, A., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+hearing+loss+and+outer+hair+cell+death+in+homozygous+Foxo3+knockout+mice+after+moderate+noise+exposure.">Severe hearing loss and outer hair cell death in homozygous Foxo3 knockout mice after moderate noise exposure.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1054 (2017).</li><li>Kane, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+effects+on+age-related+hearing+loss+associated+with+Cdh23+variants+in+mice.">Genetic background effects on age-related hearing loss associated with Cdh23 variants in mice.</a> Hearing Research. 283 (1-2), 80-88 (2012).</li><li>Jiang, X. W., Li, X. R., Zhang, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+of+ribbon+synapses+number+of+cochlear+hair+cells+in+C57BL/6J+mice+with+age+(Delta).">Changes of ribbon synapses number of cochlear hair cells in C57BL/6J mice with age (Delta).</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (10), 19058-19064 (2015).</li><li>Akil, O., Oursler, A., Fan, K., Lustig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+auditory+brainstem+response+testing.">Mouse auditory brainstem response testing.</a> BIO-Protocol. 6 (6), (2016).</li><li>Zhou, X., Jen, P. H. -. S., Seburn, K. L., Frankel, W. N., Zheng, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+brainstem+responses+in+10+inbred+strains+of+mice.">Auditory brainstem responses in 10 inbred strains of mice.</a> Brain Research. 1091 (1), 16-26 (2006).</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+dissection+and+immunofluorescence+of+the+adult+mouse+cochlea.">Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).</li><li>Schmitz, F., Konigstorfer, A., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIBEYE,+a+component+of+synaptic+ribbons:+a+protein's+journey+through+evolution+provides+insight+into+synaptic+ribbon+function.">RIBEYE, a component of synaptic ribbons: a protein's journey through evolution provides insight into synaptic ribbon function.</a> Neuron. 28 (3), 857-872 (2000).</li><li>Suzuki, J., Corfas, G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round-window+delivery+of+neurotrophin+3+regenerates+cochlear+synapses+after+acoustic+overexposure.">Round-window delivery of neurotrophin 3 regenerates cochlear synapses after acoustic overexposure.</a> Scientific Reports. 6, 24907 (2016).</li><li>Rutherford, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+structure+of+inner+ear+ribbon+synapses+with+STED+microscopy.">Resolving the structure of inner ear ribbon synapses with STED microscopy.</a> Synapse. 69 (5), 242-255 (2015).</li><li>Liberman, L. D., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+cochlear+synaptopathy+after+acoustic+overexposure.">Dynamics of cochlear synaptopathy after acoustic overexposure.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 16 (2), 205-219 (2015).</li><li>Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+Foxo3+causes+adult+onset+auditory+neuropathy+and+alters+cochlear+synapse+architecture+in+mice.">Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice.</a> Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).</li><li>Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin-3+regulates+ribbon+synapse+density+in+the+cochlea+and+induces+synapse+regeneration+after+acoustic+trauma.">Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+cochlear+synaptopathy:+an+early-onset+contributor+to+auditory+functional+decline.">Age-related cochlear synaptopathy: an early-onset contributor to auditory functional decline.</a> Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).</li><li>Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+cochlear+neuropathy+is+selective+for+fibers+with+low+spontaneous+rates.">Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).</li><li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adding+insult+to+injury:+cochlear+nerve+degeneration+after+"temporary"+noise-induced+hearing+loss.">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss.</a> Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li><li>Valero, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+cochlear+synaptopathy+in+rhesus+monkeys+(Macaca+mulatta).">Noise-induced cochlear synaptopathy in rhesus monkeys (Macaca mulatta).</a> Hearing Research. 353, 213-223 (2017).</li><li>Viana, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+neuropathy+in+human+presbycusis:+Confocal+analysis+of+hidden+hearing+loss+in+post-mortem+tissue.">Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue.</a> Hearing Research. 327, 78-88 (2015).</li><li>Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerated+synapses+between+postnatal+hair+cells+and+auditory+neurons.">Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (3), 321-329 (2013).</li><li>Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+murine+cochlear+explant+technique+as+an+in+vitro+screening+tool+in+hearing+research.">Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).</li><li>Takeda, S., Mannstr&#246;m, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Aging+and+Noise+Exposure+on+Auditory+Brainstem+Responses+and+Number+of+Presynaptic+Ribbons+in+Inner+Hair+Cells+of+C57BL/6J+Mice.">Effects of Aging and Noise Exposure on Auditory Brainstem Responses and Number of Presynaptic Ribbons in Inner Hair Cells of C57BL/6J Mice.</a> Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).</li><li>Mehraei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+brainstem+response+latency+in+noise+as+a+marker+of+cochlear+synaptopathy.">Auditory brainstem response latency in noise as a marker of cochlear synaptopathy.</a> Journal of Neuroscience. 36 (13), 3755-3764 (2016).</li></ol>

Da cochlear synaptopathy først blev karakteriseret i voksne mus med en midlertidig tærskel forskydning (TTS) induceret af 8 \ u201216 kHz oktavbånd støj ved 100 dB SPL for 2 h31, har forskerne i stigende grad undersøgt virkningerne af synaptopati i forskellige pattedyr, herunder aber og mennesker32,33. Ud over støjeksponering har flere andre forhold været forbundet med cochlear synaptopati (f. eks. aldring, brug af ototoksiske læge...

Frekvenser i intervallet ca. 20 \ u201220, 000 Hz kan opfattes som auditive stimuli af mennesker. Menneskelig hørelse er normalt mest følsom i nærheden af 1.000 Hz, hvor det gennemsnitlige lydtrykniveau er 20 μPa hos unge voksne (dvs. 0 decibel lydtryksniveau [dB SPL]). Under visse patologiske forhold er høretab begrænset til bestemte frekvenser. For eksempel, i de tidlige stadier af støj-induceret høretab (NIHL), en "hak" (dvs., hørelse tærskelhøjde) kan observeres i audiogram ved 4 kHz1. Langs pattedyr cochlear-partitionen producerer dens gradueringer af stivhed og masse et eksponentielt frekvens kort med højfrekvent lyddetektering ved foden af cochlea og lavfrekvens detektering ved Apex2. Faktisk er der et cochlear sted-frekvens kort langs basilær membranen, hvilket fører til, hvad der er kendt som tonotopic Organization2,3. Hvert givet sted på basilær membranen har den højeste følsomhed for kun en bestemt lydfrekvens, som normalt betegnes som den karakteristiske frekvens3,4, selv om responser på andre frekvenser også kan observeres.
Til dato, forskellige musemodeller har været ansat til at undersøge normal funktion, patologiske processer, og terapeutisk virkning i auditive system. Præcis viden om fysiologiske parametre i mus cochlea er en forudsætning for sådanne undersøgelser af høretab. Musens cochlea er anatomisk inddelt i apical, midterste og basal sving, som svarer til forskellige frekvensområder. Ved at beskrive Auditive nerve afferenter på cochlear Nucleus for at analysere deres tilsvarende perifere innervations steder i cochlea lykkedes det Müller et al. at etablere cochlear Place-frekvens kortet i den normale mus in vivo5. I intervallet 7,2 – 61.8 kHz, som svarer til positioner mellem 90% og 10% af den fulde længde af basilær membranen, kan musens cochlear-sted-frekvens kort beskrives ved en simpel lineær regressions funktion, hvilket tyder på en relation mellem normaliseret afstand fra cochlear base og logaritmen af den karakteristiske frekvens5. I laboratorie mus kan sted-frekvens kortet bruges til at udforske forholdet mellem høre tærskler inden for bestemte frekvensområder og cochleograms, der viser antallet af manglende hårceller i relative regioner langs basilær membranen6. Vigtigere er det sted-frekvens kort giver et positioneringssystem til undersøgelse af minimal strukturel skade, såsom beskadigelse af båndet synapser af hårceller på specifikke cochlear frekvens steder i mus med perifer auditiv traume7 ,8.
I pattedyrs cochlea består bånd synapserne af et præsynaptisk bånd, en elektron-tæt projektion, der gør en Halo af Release-Ready synaptiske vesikler indeholdende glutamat i IHC, og en postsynaptisk tæthed på nerve terminalen i SGN med glutamat-receptorer9. Under cochlear Sound transduction resulterer udbøjning af hårcelle bundtet i IHC depolarisering, hvilket fører til glutamat frigivelse fra IHCs på de postsynaptiske afferent terminaler, hvorved den auditive vej aktiveres. Aktivering af denne vej fører til omdannelsen af lyd-induceret mekaniske signaler til en sats kode i SGN10. Faktisk IHC Ribbon synapse er højt specialiseret til utrættelige lyd transmission på satser på hundredvis af Hertz med høj tidsmæssig præcision, og er af afgørende betydning for præsynaptiske mekanismer lydkodning. Tidligere undersøgelser har afsløret, at bånd synapser varierer meget i størrelse og antal på forskellige frekvensområder i den voksne mus cochlea11,12, sandsynligvis afspejler strukturel tilpasning til den særlige lyd kodning for overlevelses behov. Eksperimentelle dyreforsøg har for nylig vist, at cochlear synaptopathy bidrager til flere former for hørenedsættelse, herunder høretab, der er forårsaget af støj, aldersrelateret høretab og arvelig høretab13, 14. metoderne til identificering af korrelerede ændringer i det synaptiske antal, struktur og funktion på bestemte frekvensområder er således i stigende grad blevet anvendt i studier af auditiv udvikling og indre øre-sygdom ved hjælp af modeller genereret via Eksperimentel manipulation af genetiske eller miljømæssige variabler15,16,17.
I den aktuelle rapport præsenterer vi en protokol til analyse af det synaptiske tal, strukturen og funktionen i en bestemt frekvens region i basilær-membranen i voksne mus. Lokalisering af cochlear-frekvens udføres ved hjælp af et givet sted-frekvens kort i kombination med et cochleogram. De normale morfologiske egenskaber ved cochlear-bånd synapser evalueres via præsynaptisk og postsynaptisk immun farvning. Den funktionelle status for cochlear-bånd synapser bestemmes ud fra de suprathreshold-amplituder af ABR Wave I. Med mindre ændringer kan denne protokol anvendes til at undersøge fysiologiske eller patologiske tilstande i andre dyremodeller, herunder rotter, marsvin og gerbils.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:828px;" width="828">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ketamine hydrochloride</td>
			<td style="width:304px;">Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China</td>
			<td style="width:141px;">H35020148</td>
			<td style="width:167px;">100mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>X-1251</td>
			<td>10mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TDT physiology apparatus</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA</td>
			<td colspan="2">Auditory Physiology System III</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SigGen/BioSig software</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA</td>
			<td colspan="2">Auditory Physiology System III</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electric Pad</td>
			<td>Pet Fun</td>
			<td>11072931136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps 3#</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada</td>
			<td>0203-3-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps 5#</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada</td>
			<td>0209-5-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereo dissection microscope</td>
			<td>Nikon Corp., Tokyo, Japan</td>
			<td>SMZ1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat serum</td>
			<td>ZSGB-BIO, Beijing,China</td>
			<td>ZLI-9021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4</td>
			<td>Millipore Corp., Billerica, MA, USA</td>
			<td>MAB397</td>
			<td>mouse&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified Mouse Anti-CtBP2</td>
			<td>BD Biosciences, Billerica, MA, USA</td>
			<td>612044</td>
			<td>mouse&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>A21124</td>
			<td>goat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>A21131</td>
			<td>goat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting medium containing DAPI</td>
			<td>ZSGB-BIO, Beijing,China</td>
			<td>ZLI-9557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal fluorescent microscopy</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>TCS SP8 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image Pro Plus software</td>
			<td>Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA</td>
			<td>version 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Professional diagnostic pocket otoscope</td>
			<td>Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,China</td>
			<td>HS-OT10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle electrode</td>
			<td>Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi&#39;an,China</td>
			<td>1029</td>
			<td>20 mm, 28 G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Closed-field speaker</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA</td>
			<td>CF1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea

Cochlear indre hårceller (IHCs) sender akustiske signaler til spiral ganglion neuroner (SGNs) gennem bånd synapser. Flere eksperimentelle undersøgelser har vist, at hårcelle synapser kan være de oprindelige mål i sensorineuralt høretab (SNHL). Sådanne undersøgelser har foreslået begrebet cochlear "synaptopathy", som refererer til ændringer i bånd synapse nummer, struktur, eller funktion, der resulterer i unormal synaptisk transmission mellem IHCs og SGNs. Mens cochlear synaptopathy er irreversibel, påvirker det ikke høretærsklen. I støj-induceret eksperimentelle modeller, begrænset skade på IHC synapser i udvalgte frekvensområder er ansat til at identificere de miljømæssige faktorer, der specifikt forårsager synaptopati, samt de fysiologiske konsekvenser af at forstyrre dette indre øre Kredsløb. Her præsenterer vi en protokol til analyse af cochlear synaptisk morfologi og funktion i en bestemt frekvens region i voksne mus. I denne protokol udføres cochlear lokalisering af specifikke frekvensområder ved hjælp af sted-frekvens kort i forbindelse med cochleogram-data, hvorefter de morfologiske egenskaber ved bånd synapser evalueres via synaptisk immun. Den funktionelle status af bånd synapser bestemmes derefter baseret på amplituder af auditive Brain EM Response (ABR) Wave I. Den foreliggende rapport viser, at denne fremgangsmåde kan bruges til at uddybe vores forståelse af patogenesen og mekanismerne i den synaptiske dysfunktion i cochlea, som kan støtte i udviklingen af nye terapeutiske interventioner.

ABR-høre tests blev udført for 10 C57BL/6J mus (8 ugers alderen) under anæstesi. ABRs blev fremkaldt ved hjælp af tone burst stimuli ved 4, 8, 16, 32 og 48 kHz. Høretærsklen for hvert dyr blev visuelt påvist ved at skelne mindst én klar bølgeform i ABR. Alle mus udstillet ABR tærskler som reaktion på tone udbrud, spænder mellem 25 og 70 dB SPL afhængigt af hyppigheden af stimulus. Vores resultater viste, at høretærsklen var lavest ved 16 kHz (figur 1), svarende til ca. 43% afs...

Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea at JoVE.com

Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

Dette manuskript beskriver en eksperimentel protokol til evaluering af de morfologiske egenskaber og funktionel status af bånd synapser i normale mus. Den nuværende model er også velegnet til støj-induceret og aldersrelaterede cochlear synaptopathy-begrænsede modeller. De korrelative resultater af tidligere mus undersøgelser er også drøftet.

Morfologiske og funktionelle evaluering af bånd synapser på specifikke frekvensområder af musen cochlea

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

Den primære rapport er virkelig stress betydningen af præcist at lokalisere den specifikke frekvens region basilar membran i de fleste modeller, hvor synapse tal ændret og funktion kan analyseres. Cochlear-lokaliseringen af de specifikke frekvensområder udføres pålideligt ved hjælp af stedfrekvenstilknytninger sammen med cochleogramdata. Mikroskopet giver indsigt i flere forskningsundersøgelser.Det understøtter forestillingen om, at cochlear neuropati er den primære indledende begivenheder specifikt forud for høretab, tinnitus, og hyperacusis. Efter at have bekræftet en manglende reaktion på tå knivspids i en bedøvet otte uger gammel voksen C57 sort 6J mandlige mus. Placer musen på en 37 grader celsius varmepude i et elektrisk og akustisk afskærmet rum.Dernæst placere en subdermal 20 millimeter 28 gauge nål optagelse elektrode, med dybden af tre millimeter under huden på knudepunktet af kraniet. En referenceelektrode i det ipsilaterale parotideale område under pinnaen af det målte øre og en jordelektrode i det kontralaterale parotideale område. Placer en lukket felthøjttaler udstyret med et to centimeter plastikrør med en kegleformet spids ved siden af musen, og sæt spidsen ind i den ydre øregang.For en auditiv hjernestamme respons, eller ABR optagelse, generere tone kerner ved faldende lydtrykniveauer fra 90 til 10 decibel, i fem til 10 decibel lydtrykniveau trin. Under dette trin forstærkes, filtreres og beregnes gennemsnittet. Ved hver frekvens bestemmes ABR-tærsklen, som er det minimale lydtrykniveau, der resulterer i en pålidelig ABR-optagelse med en eller flere karakteristiske bølger, der tydeligt kan identificeres ved visuel inspektion.Efter ABR-optagelsen skal du udsætte bullaen fra ventrale side og åbne bullaen med en skarp saks for at få adgang til cochlea. Ved hjælp af fine scet, fjerne de tidsmæssige knogler og afskære stapes arterie. Fjern derefter bånd fra det ovale vindue og brud den runde vinduesmembran.Drej forsigtigt spidsen af en 13 millimeter 27 gauge nål til at lave et lille hul på toppen af cochlea, før du bruger en fin tippet pipette til forsigtigt at skylle 4% paraformaldehyd gennem vinduet ind i perilymphatic rum. Dernæst skylles knoglerne tre gange i fem minutter pr vask med kold frisk 0,1 molar PBS per vask. Efterfulgt af afkalkning af knoglerne med 10% EDTA i fire timer ved stuetemperatur og 20 rotationer i minuttet på en vandret shaker.Ved inkubationens afslutning overføres en afkalket tidsmæssig knogle til frisk 0,1 molar PBS under et dissekerende mikroskop. Brug 3 og 5 Dumont-kraftaffængte og en 27 gauge nål til at dissekere de apiske, midterste og basale cochlea-regioner efter tur. Brug et barberblad til at lave en lille serie af snit langs spiralledbåndet og fjern tectorial membran og Reissners membran.Yderligere dissekere de resterende auditive epitel, herunder spiral limbus, i individuelle cochlear vender for hele mount præparater. Brug derefter 40X oliemålet af et lysmikroskop til at måle basilarmembranens længde med 250 mikrometerskala placeret i øjet. Det kan justeres langs stereocilia af de indre hårceller.Efter dissektion, placere hver cochlear bliver til individuelle 2,5 milliliter centrifuge rør. Sæv enhver uspecifikke binding med 10% gedeserum i PBS i 0,1 % Triton X-100 i en time ved stuetemperatur på en rotator. Ved slutningen af inkubationen skal du bruge 200 mikroliterspipettespids til at fjerne opløsningen under et dissektionsmikroskop.Inkuber prøverne med de primære antistoffer af interesse fortyndet i 5% gedeserum og PBS i 0,1%Triton X-100 natten over ved 4 grader Celsius på en rotator. Næste morgen skylles vævsprøverne tre gange i fem minutter med koldt 0,1 molar PBS pr. vask for at fjerne eventuelle resterende primære antistof. Derefter mærkes prøverne med de relevante sekundære antistoffer fortyndet i 5%gedeserum i PBS i 0,1%Triton X-100 i to til tre timer ved stuetemperatur på rotatoren, beskyttet mod lys.Ved inkubationens afslutning vaskes prøverne tre gange med 0,1 molar PBS som påvist, og prøverne overføres til individuelle 35 millimeter plader indeholdende 0,1 molar PBS. Anlæg en dråbe DAPI-suppleret monteringsmedium på sliden, og overfør prøverne fra PBS til monteringsmediet. Placer den ene kant af et dæksel på hvert dias, og slip for at lade dækslet glide forsigtigt.Tør derefter diasene i en slideboks ved fire grader Celsius natten over. For at afbilde prøverne skal du bruge et konfokalt mikroskop med de relevante lasere og 63X olienedsænkningslinse med høj opløsning til at anskaffe otte mikrometerkonfokale Z-stakke fra hver cochlear-vending. For synaptic punktformet tal, indstille Z stakke med 0,3 mikrometer trin størrelse til at spænde hele længden af indre hår celler, forsikre alle de synaptiske punktncta kan afbildes og fusionere punktform og indeholder billeder i en Z stak for at opnå Z adgang projektion.Importer de flettede billeder til et passende billedbehandlingsprogram. Divider de synaptiske totaltal i hver Z-stak ved bestemte frekvensområder med antallet af DAPI-positive indre hårceller for at beregne antallet af synaptiske punktformørta for hver celle. På hver bestemt frekvens region, gennemsnit alle de synaptiske punktformet i tre billeder af forskellige mikroskopiske felter, der indeholder ni til 11 indre hårceller.For bedre at visualisere den cytoskeletale arkitektur og synaptisk lokalisering, skal du bruge penselværktøjet til visuelt at vurdere den synaptiske struktur og fordeling af de enkelte indre hårceller. For at inspicere sammenstillingen af præsynaptiske bånd og postsynaptiske receptor patches, skal du bruge den rektangulære telt værktøj udtrække voxel plads omkring båndene og bruge billedskæring til at isolere de enkelte bånd. Klik derefter på billede og billedstørrelse for at hente en miniaturematrix af disse miniatureprojektioner, der kan bruges til at identificere parrede synapser i forhold til forældreløse bånd.Alle ti mus i dette repræsentative eksperiment udviste ABR-tærskler som reaktion på toneudbrud på mellem 25 og 70 decibel pr. lydtrykniveau afhængigt af stimulusens hyppighed. Høretærsklen for dette eksperiment var lavest ved 16 kilohertz svarende til ca. 43% af afstanden fra cochlear apex, hvilket tyder på, at den akustiske følsomhed er væsentligt reduceret i andre cochlear regioner. Hele mounts af auditive epitel er dissekeret i tre stykker og længder måles og omdannes til deres procent afstand fra cochlear apex.Frekvensplaceringen på basilarmembranen for hver cochlear-vending beregnes ved hjælp af logaritmisk funktion. I normale ører af voksne mus, immunstaining afslører sammenstillet par synaptiske bånd og glutamat receptor patches. Undersøgelse af overfladen af basolateral membran af de indre hårceller, med otte til 20 par per celle.Selv om langt størstedelen af punktformørke vises som sammenstillede par i normale ører, forældreløse bånd er sjældent observeret ved høje forstørrelser. Antallet af indre hår celle bånd synapser er højest på 16 kilohertz regionen og falder betydeligt som afstanden fra denne placering stiger. Det vigtigste at huske under denne procedure er, at man skal garantere integriteten af cochlear basal membran.Vi er nødt til at understrege nøjagtigheden, indtil de tekniske færdigheder er nået. Efter denne procedure kan genterapien udføres for at svare på, om cochlear neuropati kan repareres ved denne foranstaltning. Denne foranstaltning er bredere teknik til at udforske cochlear neuropati, som hvis de primære indledende begivenheder forbinder med at have høretab, tinnitus, og hyperacusis.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Neuroscience

Unit 1

The Special Senses

SCIENTISTS IN ACTION

Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the ...

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Cerebrovaskulære Støbning af Voksen Mouse til 3D Imaging og morfologisk analyse

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomeraseaktivitet i de forskellige regioner i Mouse Brain: Ikke-radioaktivt Telomerase Gentag Amplifikationsprotokol (TRAP) Indhold

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

Funktionel og Morfologisk vurdering af Membran innervation af phrenic Motor neuroner

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

High-Resolution Kvantitativ immunoguld Analyse af membranreceptorer på retinale Ribbon synapser

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Hele Mount Dissektion og Immunofluorescens af Voksen Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Hurtig og specifik Immunomagnetic Isolation af musen primære Oligodendrocytes

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Funktionel evaluering af olfaktoriske veje i levende Xenopus haletudser

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Billeddannelse af celle-specifikke Calcium signalerer på den tredelte Synapse mus membran

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Stimulus-specific Cortical Visual Evoked Potential Morphological Patterns

Stimulus-specifikke kortikale visuelle fremkaldte potentielle morfologiske mønstre

This paper presents a methodology for the recording and analysis of cortical visual evoked potentials (CVEPs) in response to various visual stimuli using ...