Name: morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea
Uploaded: 2019-05-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (81770997, 81771016, 81830030); het gezamenlijke financieringsproject van de Beijing Natural Science Foundation en de Beijing education Committee (KZ201810025040); de Beijing Natural Science Foundation (7174291); en de China postdoctoral Science Foundation (2016M601067).

Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de NRC/ILAR gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren (8e editie). Het studie protocol werd goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van de Capital Medical University, Peking, China.
1. selectie van dieren
<ol><li>Gebruik voor alle experimenten volwassen C57BL/6J mannelijke muizen (8 weken oud) als het diermodel. Opmerking: C57BL/6j muizen die een splice variant van de Cdh2...

<ol>
	<li>Lie, A., Skogstad, M., Johnsen, T. S., Engdahl, B., Tambs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+notched+audiograms+in+a+cross-sectional+study+of+12,055+railway+workers.">The prevalence of notched audiograms in a cross-sectional study of 12,055 railway workers.</a> Ear and Hearing. 36 (3), 86-92 (2015).</li><li>Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+transduction,+tuning,+and+synaptic+transmission+in+the+mammalian+cochlea.">Hair cell transduction, tuning, and synaptic transmission in the mammalian cochlea.</a> Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).</li><li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cochlear+frequency+map+for+the+cat:+labeling+auditory-nerve+fibers+of+known+characteristic+frequency.">The cochlear frequency map for the cat: labeling auditory-nerve fibers of known characteristic frequency.</a> Journal of the Acoustical Society of America. 72 (5), 1441-1449 (1982).</li><li>Fettiplace, R., Kim, K. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+mechanoelectrical+transduction+channels+in+hearing.">The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing.</a> Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).</li><li>Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiological+place-frequency+map+of+the+cochlea+in+the+CBA/J+mouse.">A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse.</a> Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).</li><li>Viberg, A., Canlon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+guide+to+plotting+a+cochleogram.">The guide to plotting a cochleogram.</a> Hearing Research. 197 (1-2), 1-10 (2004).</li><li>Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+exposure+modulates+cochlear+inner+hair+cell+ribbon+volumes,+correlating+with+changes+in+auditory+measures+in+the+FVB/nJ+mouse.">Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse.</a> Scientific Reports. 6, 25056 (2016).</li><li>Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+after+noise+exposure:+acceleration+of+cochlear+synaptopathy+in+"recovered"+ears.">Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears.</a> Journal of Neuroscience. 35 (19), 7509-7520 (2015).</li><li>Wichmann, C., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+structure+and+function+of+inner+hair+cell+ribbon+synapses.">Relating structure and function of inner hair cell ribbon synapses.</a> Cell and Tissue Research. 361 (1), 95-114 (2015).</li><li>Matthews, G., Fuchs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+roles+of+ribbon+synapses+in+sensory+neurotransmission.">The diverse roles of ribbon synapses in sensory neurotransmission.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 812-822 (2010).</li><li>Liberman, L. D., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+maturation+of+auditory-nerve+heterogeneity,+as+seen+in+spatial+gradients+of+synapse+morphology+in+the+inner+hair+cell+area.">Postnatal maturation of auditory-nerve heterogeneity, as seen in spatial gradients of synapse morphology in the inner hair cell area.</a> Hearing Research. 339, 12-22 (2016).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximal+number+of+pre-synaptic+ribbons+are+formed+in+cochlear+region+corresponding+to+middle+frequency+in+mice.">Maximal number of pre-synaptic ribbons are formed in cochlear region corresponding to middle frequency in mice.</a> Acta Oto-Laryngologica. 138 (1), 25-30 (2018).</li><li>Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+synaptopathy+in+acquired+sensorineural+hearing+loss:+Manifestations+and+mechanisms.">Cochlear synaptopathy in acquired sensorineural hearing loss: Manifestations and mechanisms.</a> Hearing Research. 349, 138-147 (2017).</li><li>Moser, T., Starr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+neuropathy--neural+and+synaptic+mechanisms.">Auditory neuropathy--neural and synaptic mechanisms.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (3), 135-149 (2016).</li><li>Yu, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Gata3-Mafb+transcriptional+network+directs+post-synaptic+differentiation+in+synapses+specialized+for+hearing.">A Gata3-Mafb transcriptional network directs post-synaptic differentiation in synapses specialized for hearing.</a> Elife. 2, 01341 (2013).</li><li>Buniello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wbp2+is+required+for+normal+glutamatergic+synapses+in+the+cochlea+and+is+crucial+for+hearing.">Wbp2 is required for normal glutamatergic synapses in the cochlea and is crucial for hearing.</a> EMBO Molecular Medicine. 8 (3), 191-207 (2016).</li><li>Gilels, F., Paquette, S. T., Beaulac, H. J., Bullen, A., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+hearing+loss+and+outer+hair+cell+death+in+homozygous+Foxo3+knockout+mice+after+moderate+noise+exposure.">Severe hearing loss and outer hair cell death in homozygous Foxo3 knockout mice after moderate noise exposure.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1054 (2017).</li><li>Kane, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+effects+on+age-related+hearing+loss+associated+with+Cdh23+variants+in+mice.">Genetic background effects on age-related hearing loss associated with Cdh23 variants in mice.</a> Hearing Research. 283 (1-2), 80-88 (2012).</li><li>Jiang, X. W., Li, X. R., Zhang, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+of+ribbon+synapses+number+of+cochlear+hair+cells+in+C57BL/6J+mice+with+age+(Delta).">Changes of ribbon synapses number of cochlear hair cells in C57BL/6J mice with age (Delta).</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (10), 19058-19064 (2015).</li><li>Akil, O., Oursler, A., Fan, K., Lustig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+auditory+brainstem+response+testing.">Mouse auditory brainstem response testing.</a> BIO-Protocol. 6 (6), (2016).</li><li>Zhou, X., Jen, P. H. -. S., Seburn, K. L., Frankel, W. N., Zheng, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+brainstem+responses+in+10+inbred+strains+of+mice.">Auditory brainstem responses in 10 inbred strains of mice.</a> Brain Research. 1091 (1), 16-26 (2006).</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+dissection+and+immunofluorescence+of+the+adult+mouse+cochlea.">Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).</li><li>Schmitz, F., Konigstorfer, A., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIBEYE,+a+component+of+synaptic+ribbons:+a+protein's+journey+through+evolution+provides+insight+into+synaptic+ribbon+function.">RIBEYE, a component of synaptic ribbons: a protein's journey through evolution provides insight into synaptic ribbon function.</a> Neuron. 28 (3), 857-872 (2000).</li><li>Suzuki, J., Corfas, G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round-window+delivery+of+neurotrophin+3+regenerates+cochlear+synapses+after+acoustic+overexposure.">Round-window delivery of neurotrophin 3 regenerates cochlear synapses after acoustic overexposure.</a> Scientific Reports. 6, 24907 (2016).</li><li>Rutherford, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+structure+of+inner+ear+ribbon+synapses+with+STED+microscopy.">Resolving the structure of inner ear ribbon synapses with STED microscopy.</a> Synapse. 69 (5), 242-255 (2015).</li><li>Liberman, L. D., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+cochlear+synaptopathy+after+acoustic+overexposure.">Dynamics of cochlear synaptopathy after acoustic overexposure.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 16 (2), 205-219 (2015).</li><li>Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+Foxo3+causes+adult+onset+auditory+neuropathy+and+alters+cochlear+synapse+architecture+in+mice.">Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice.</a> Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).</li><li>Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin-3+regulates+ribbon+synapse+density+in+the+cochlea+and+induces+synapse+regeneration+after+acoustic+trauma.">Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+cochlear+synaptopathy:+an+early-onset+contributor+to+auditory+functional+decline.">Age-related cochlear synaptopathy: an early-onset contributor to auditory functional decline.</a> Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).</li><li>Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+cochlear+neuropathy+is+selective+for+fibers+with+low+spontaneous+rates.">Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).</li><li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adding+insult+to+injury:+cochlear+nerve+degeneration+after+"temporary"+noise-induced+hearing+loss.">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss.</a> Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li><li>Valero, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+cochlear+synaptopathy+in+rhesus+monkeys+(Macaca+mulatta).">Noise-induced cochlear synaptopathy in rhesus monkeys (Macaca mulatta).</a> Hearing Research. 353, 213-223 (2017).</li><li>Viana, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+neuropathy+in+human+presbycusis:+Confocal+analysis+of+hidden+hearing+loss+in+post-mortem+tissue.">Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue.</a> Hearing Research. 327, 78-88 (2015).</li><li>Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerated+synapses+between+postnatal+hair+cells+and+auditory+neurons.">Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (3), 321-329 (2013).</li><li>Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+murine+cochlear+explant+technique+as+an+in+vitro+screening+tool+in+hearing+research.">Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).</li><li>Takeda, S., Mannstr&#246;m, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Aging+and+Noise+Exposure+on+Auditory+Brainstem+Responses+and+Number+of+Presynaptic+Ribbons+in+Inner+Hair+Cells+of+C57BL/6J+Mice.">Effects of Aging and Noise Exposure on Auditory Brainstem Responses and Number of Presynaptic Ribbons in Inner Hair Cells of C57BL/6J Mice.</a> Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).</li><li>Mehraei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+brainstem+response+latency+in+noise+as+a+marker+of+cochlear+synaptopathy.">Auditory brainstem response latency in noise as a marker of cochlear synaptopathy.</a> Journal of Neuroscience. 36 (13), 3755-3764 (2016).</li></ol>

Sinds cochlear immuunziekte werd voor het eerst gekarakteriseerd in volwassen muizen met een tijdelijke drempel verschuiving (TTS) geïnduceerd door 8 \ u201216 kHz octaafband ruis op 100 dB SPL voor 2 h31, onderzoekers hebben steeds meer onderzocht de effecten van synaptopathie in verschillende zoogdieren, met inbegrip van apen en mensen32,33. Naast de blootstelling aan lawaai, zijn er verschillende andere voorwaarden in verband gebracht ...

Frequenties in het bereik van ongeveer 20 \ u201220, 000 Hz kunnen worden waargenomen als auditieve stimuli door de mens. Het menselijk gehoor is normaalgesproken het meest gevoelig bij 1.000 Hz, waarbij het gemiddelde geluidsdrukniveau 20 μPa is bij jonge volwassenen (d.w.z. 0 decibel van het geluidsdrukniveau [dB SPL]). In sommige pathologische omstandigheden is gehoorverlies beperkt tot specifieke frequenties. Bijvoorbeeld, in de vroege stadia van lawaai-geïnduceerde gehoorverlies (NIHL), een "Inkeping" (dat wil zeggen, gehoor drempel hoogte) kan worden waargenomen in het audiogram op 4 kHz1. Langs de cochleaire partitie van zoogdieren produceren de gradaties van stijfheid en massa een exponentiële frequentie kaart, met hoogfrequente geluidsdetectie aan de basis van de slakkenhuis en lage frequentie detectie op de Apex2. Inderdaad, er is een cochleaire plaats-frequentie kaart langs het basilaire membraan, wat leidt tot wat bekend staat als tonotopische organisatie2,3. Elke gegeven plaats op het basilaire membraan heeft de hoogste gevoeligheid voor slechts één bepaalde geluidsfrequentie, die gewoonlijk de karakteristieke frequentie3,4wordt genoemd, hoewel ook reacties op andere frequenties kunnen worden waargenomen.
Tot op heden zijn verschillende Muismodellen gebruikt om de normale functie, pathologische processen en therapeutische werkzaamheid in het auditieve systeem te onderzoeken. Precieze kennis van fysiologische parameters in de muis slakkenhuis is een voorwaarde voor dergelijke studies van gehoorverlies. De muis slakkenhuis is anatomisch verdeeld in apicale, middelste en basale bochten, die corresponderen met verschillende frequentiegebieden. Door auditieve zenuw afferents te labelen in de cochlear Nucleus om hun corresponderende perifere innervatie locaties in de cochlea te analyseren, slaagde Müller et al. erin om de cochleaire plaats-frequentie kaart in de normale muis in vivo5te vestigen. In het interval van 7,2 – 61.8 kHz, dat overeenkomt met posities tussen 90% en 10% van de volledige lengte van het basilaire membraan, kan de muis cochleaire plaats-frequentie kaart worden beschreven door een eenvoudige lineaire regressiefunctie, wat duidt op een relatie tussen de genormaliseerde afstand van de cochleaire basis en de logaritme van de karakteristieke frequentie5. In laboratorium muizen kan de plaats-frequentie kaart worden gebruikt om de relatie tussen gehoor drempels binnen specifieke frequentiebereiken en cochleogrammen te onderzoeken die het aantal ontbrekende haarcellen in relatieve gebieden langs het basilaire-membraan6tonen. Belangrijk is dat de plaats-frequentie kaart een positioneringssysteem biedt voor het onderzoeken van minimale structurele schade, zoals schade aan het lint synapsen van haarcellen op specifieke cochleaire frequentie locaties in muizen met perifeer gehoor trauma7 ,8.
In de zoogdieren cochlea, lint synapsen bestaan uit een presynaptische lint, een elektron-dichte projectie die een Halo van release-Ready synaptische blaasjes met glutamaat in de IHC, en een postsynaptisch dichtheid op de zenuw terminal van de SGN met glutamaat receptoren9. Tijdens cochlear Sound transduction resulteert de afbuiging van de haarcelbundel in IHC depolarisatie, wat leidt tot het vrijgeven van glutamaat van Ihc's op de postsynaptische afferente terminals, waardoor de auditieve route wordt geactiveerd. Activering van dit traject leidt tot de transformatie van geluidsgeïnduceerde mechanische signalen naar een tariefcode in de SGN10. Inderdaad, de IHC lint Synapse is zeer gespecialiseerd voor ondefatigable geluid transmissie bij de tarieven van honderden Hertz met hoge temporele precisie, en is van cruciaal belang voor presynaptische mechanismen van geluid coderen. Eerdere studies hebben uitgewezen dat lint synapsen sterk variëren in grootte en aantal in verschillende frequentiegebieden in de volwassen muis slakkenhuis11,12, waarschijnlijk weerspiegelen structurele aanpassing aan de specifieke geluids codering voor overlevings behoeften. Onlangs hebben experimentele dieronderzoeken aangetoond dat cochleaire synaptopathie bijdraagt aan meerdere vormen van gehoorbeschadiging, waaronder lawaai-geïnduceerde gehoorverlies, leeftijdsgebonden gehoorverlies en erfelijk gehoorverlies13, 14. zo zijn methoden voor het identificeren van gecorreleerde veranderingen in het synaptische getal, de structuur en de functie in specifieke frequentiegebieden in toenemende mate werkzaam in onderzoeken naar auditieve ontwikkeling en binnenoor ziekte, met behulp van modellen die via experimentele manipulatie van genetische of omgevingsvariabelen15,16,17.
In het huidige rapport presenteren we een protocol voor het analyseren van het synaptische getal, de structuur en de functie in een specifieke frequentie regio van het basilaire membraan bij volwassen muizen. De lokalisatie van de cochlear-frequentie wordt uitgevoerd met behulp van een bepaalde plaats-frequentie kaart in combinatie met een cochleogram. De normale morfologische kenmerken van cochleaire lint synapsen worden geëvalueerd via presynaptische en postsynaptische immunokleuring. De functionele status van cochleaire lint synapsen wordt bepaald op basis van de suprathreshold amplitudes van ABR Wave I. Met kleine wijzigingen kan dit protocol worden gebruikt om fysiologische of pathologische omstandigheden in andere diermodellen te onderzoeken, waaronder ratten, cavia's en gerbils.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:828px;" width="828">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ketamine hydrochloride</td>
			<td style="width:304px;">Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China</td>
			<td style="width:141px;">H35020148</td>
			<td style="width:167px;">100mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>X-1251</td>
			<td>10mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TDT physiology apparatus</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA</td>
			<td colspan="2">Auditory Physiology System III</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SigGen/BioSig software</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA</td>
			<td colspan="2">Auditory Physiology System III</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electric Pad</td>
			<td>Pet Fun</td>
			<td>11072931136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps 3#</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada</td>
			<td>0203-3-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps 5#</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada</td>
			<td>0209-5-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereo dissection microscope</td>
			<td>Nikon Corp., Tokyo, Japan</td>
			<td>SMZ1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat serum</td>
			<td>ZSGB-BIO, Beijing,China</td>
			<td>ZLI-9021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4</td>
			<td>Millipore Corp., Billerica, MA, USA</td>
			<td>MAB397</td>
			<td>mouse&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified Mouse Anti-CtBP2</td>
			<td>BD Biosciences, Billerica, MA, USA</td>
			<td>612044</td>
			<td>mouse&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>A21124</td>
			<td>goat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>A21131</td>
			<td>goat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting medium containing DAPI</td>
			<td>ZSGB-BIO, Beijing,China</td>
			<td>ZLI-9557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal fluorescent microscopy</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>TCS SP8 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image Pro Plus software</td>
			<td>Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA</td>
			<td>version 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Professional diagnostic pocket otoscope</td>
			<td>Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,China</td>
			<td>HS-OT10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle electrode</td>
			<td>Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi&#39;an,China</td>
			<td>1029</td>
			<td>20 mm, 28 G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Closed-field speaker</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA</td>
			<td>CF1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea

Cochleaire binnenste haarcellen (Ihc's) zenden akoestische signalen naar spiraalvormige ganglion neuronen (SGNs) door middel van lint synapsen. Verschillende experimentele studies hebben aangegeven dat haarcellen synapsen de initiële doelen in perceptief gehoorverlies (SNHL) kunnen zijn. Dergelijke studies hebben voorgesteld het concept van cochleaire "synaptopathie", die verwijst naar wijzigingen in lint Synapse nummer, structuur, of functie die resulteren in abnormale synaptische transmissie tussen IHCs en SGNs. Hoewel cochlear immuunziekte onomkeerbaar is, heeft dit geen invloed op de gehoor drempel. In door lawaai geïnduceerde experimentele modellen wordt beperkte schade aan IHC synapsen in bepaalde frequentiegebieden gebruikt om de omgevingsfactoren te identificeren die specifiek synaptopathie veroorzaken, evenals de fysiologische gevolgen van het verstoren van dit binnenoor Circuit. Hier presenteren we een protocol voor het analyseren van cochlear synaptische morfologie en functie in een specifiek frequentiegebied bij volwassen muizen. In dit protocol wordt cochleaire lokalisatie van specifieke frequentie regio's uitgevoerd met behulp van plaatfrequentiekaarten in combinatie met cochleogramgegevens, waarna de morfologische kenmerken van lint synapsen worden geëvalueerd via synaptische immunokleuring. De functionele status van het lint synapsen wordt vervolgens bepaald op basis van de amplitudes van auditieve hersenstam Response (ABR) Wave I. Het voorliggende verslag toont aan dat deze aanpak kan worden gebruikt om ons begrip van de pathogenese en mechanismen van synaptische disfunctie in het cochlea te verdiepen, wat kan helpen bij de ontwikkeling van nieuwe therapeutische interventies.

ABR hoortesten werden uitgevoerd voor 10 C57BL/6J muizen (8 weken oud) onder anesthesie. Abr's werden opgewekt met behulp van Tone Burst stimuli op 4, 8, 16, 32 en 48 kHz. De gehoor drempel van elk dier werd visueel ontdekt door ten minste één heldere golfvorm in de ABR te onderscheiden. Alle muizen vertoonden ABR-drempels in reactie op Toon uitbarstingen, variërend tussen 25 en 70 dB SPL, afhankelijk van de frequentie van de stimulus. Onze resultaten gaven aan dat de gehoor drempel het laagst was bij 16 kHz (<strong ...

Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea at JoVE.com

Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

Dit manuscript beschrijft een experimenteel protocol voor het evalueren van de morfologische kenmerken en functionele status van het lint synapsen in normale muizen. Het huidige model is ook geschikt voor door lawaai geïnduceerde en leeftijdsgebonden cochlear synaptopathy-beperkte modellen. De correlatieve resultaten van eerdere muizen studies worden ook besproken.

Morfologische en functionele evaluatie van het lint synapsen op specifieke frequentiegebieden van de muis cochlea

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

Het primaire rapport is echt stress belang van het nauwkeurig lokaliseren van de specifieke frequentie regio van de basilaire membraan in de meeste modellen, waar synaps nummers veranderd en functie kan worden geanalyseerd. De cochleaire lokalisatie van de specifieke frequentiegebieden wordt betrouwbaar uitgevoerd met behulp van frequentiekaarten in combinatie met cochleogramgegevens. De microscoop geeft inzicht in verschillende onderzoeken.Het ondersteunt het idee dat de cochleaire neuropathie de primaire eerste gebeurtenissen is die specifiek voorafgingen aan gehoorverlies, tinnitus en hyperacusis. Na de bevestiging van een gebrek aan reactie op teen knijpen in een verdoofde acht weken oude volwassen C57 zwarte 6J mannelijke muis. Plaats de muis op een 37 graden Celsius warmtepad in een elektrisch en akoestisch afgeschermde ruimte.Plaats vervolgens een onderhuidse 20 millimeter 28-meter naaldopname-elektrode, met de diepte van drie millimeter onder de huid op het hoekpunt van de schedel. Een referentie-elektrode in het ipsilaterale parotidgebied, onder de pinna van gemeten oor en een grondelektrode in het contralaterale parotidgebied. Plaats een gesloten veldluidspreker uitgerust met een twee centimeter plastic buis met een kegelvormige punt naast de muis en plaats de punt in de externe gehoorgang.Voor een auditieve hersenstamrespons, of ABR-opname, genereren toonpitten bij afnemende geluidsdrukniveaus van 90 tot 10 decibel, in vijf tot 10 decibel geluidsdrukniveaustappen. Tijdens deze stap worden de antwoorden versterkt, gefilterd en gemiddeld. Bepaal bij elke frequentie de ABR-drempel, het minimale geluidsdrukniveau dat resulteert in een betrouwbare ABR-opname met een of meer te onderscheiden golven die duidelijk kunnen worden geïdentificeerd door visuele inspectie.Na de ABR-opname, bloot de bulla van de ventrale kant en open de bulla met een scherpe schaar om toegang te krijgen tot het slakken. Met behulp van fijne tangen, verwijder de tijdelijke botten en verbreken de stapes slagader. Verwijder vervolgens de stapes uit het ovale venster en scheur het ronde raammembraan.Draai voorzichtig de punt van een 13 millimeter 27-meter naald om een klein gaatje te maken aan de top van het slakkenvlies, voordat u een fijne gekantelde pipet gebruikt om 4%paraformaldehyde voorzichtig door het raam in de perilymphatische ruimten te spoelen. Spoel vervolgens de botten drie keer gedurende vijf minuten per wasbeurt met koude verse 0,1 molaire PBS per wasbeurt. Gevolgd door ontkalking van de botten met 10%EDTA gedurende vier uur bij kamertemperatuur en 20 rotaties per minuut op een horizontale shaker.Breng aan het einde van de incubatie een ontkalkt tijdelijk bot over in verse 0,1 molaire PBS onder een ontledende microscoop. Gebruik 3 en 5 Dumont tangen en een 27-meter naald om op hun beurt de apicale, middelste en basale slakkenagebieden te ontleden. Gebruik een scheermesje om een kleine reeks sneden langs de spiraalligament te maken en verwijder tectorial membraan en Reissner's membraan.Ontleden verder het resterende auditieve epitheel, met inbegrip van de spiraalvormige limbus, in individuele cochleaire bochten voor hele mount preparaten. Gebruik vervolgens de 40X oliedoelstelling van een lichtmicroscoop om de basilaire membraanlengte te meten met een schaal van 250 micrometer die in het oogstuk is geplaatst. Het kan worden aangepast langs de stereocilia van de binnenste haarcellen.Na dissectie, plaats elke cochleaire beurt in individuele 2,5 milliliter centrifuge buizen. Blokkeer elke niet-specifieke binding met 10% geitenserum in PBS in 0,1%Triton X-100 gedurende een uur bij kamertemperatuur op een rotator. Gebruik aan het einde van de incubatie 200 microliter pipetpunt om de oplossing onder een dissectiemicroscoop te verwijderen.Incubeer de specimens met de primaire antilichamen van belang verdund in 5%geitenserum en PBS in 0,1%Triton X-100 's nachts bij 4 graden Celsius op een rotator. De volgende ochtend, spoel de weefselmonsters drie keer gedurende vijf minuten met koude 0,1 molaire PBS per was om eventuele resterende primaire antilichamen te verwijderen. Label vervolgens de monsters met de juiste secundaire antilichamen verdund in 5%geitenserum in PBS in 0,1%Triton X-100 gedurende twee tot drie uur bij kamertemperatuur op de rotator, beschermd tegen licht.Aan het einde van de incubatie, was de monsters drie keer met 0,1 molaire PBS zoals aangetoond en breng de monsters in individuele 35 millimeter platen met 0,1 molaire PBS. Plaats een druppel DAPI-aangevuld montagemedium op de glijbaan en breng de exemplaren van PBS naar het montagemedium. Plaats een rand van een deksel slip op elke dia en laat om de cover slips zachtjes vallen.Droog vervolgens de dia's in een diavak op vier graden Celsius 's nachts. Om de monsters in beeld te brengen, gebruikt u een confocale microscoop met de juiste lasers en 63X olieonderdompelingslens met hoge resolutie om acht micrometer confocale Z-stapels van elke cochleaire draai te verwerven. Voor synaptische puncta telt, stel de Z-stapels met de 0,3 micrometer stap grootte om de gehele lengte van de binnenste haarcellen overspannen, verzekeren van alle synaptische puncta kan worden afgebeeld en voeg de puncta met afbeeldingen in een Z-stack om de Z-toegang projectie te verkrijgen.Importeer de samengevoegde afbeeldingen in een geschikt softwareprogramma voor beeldverwerking. Verdeel het synaptische totaal aantal in elke Z-stack op specifieke frequentiegebieden door het aantal DAPI-positieve binnenhaarcellen om het aantal synaptische puncta voor elke cel te berekenen. Bij elk specifiek frequentiegebied, gemiddeld alle synaptische puncta in drie beelden van verschillende microscopische velden, met negen tot 11 binnenhaarcellen.Om de cytoskeletale architectuur en synaptische lokalisatie beter te visualiseren, gebruikt u het penseelgereedschap om de synaptische structuur en verdeling van de afzonderlijke binnenhaarcellen visueel te beoordelen. Om de nevenschikking van presynaptische linten en postsynaptische receptorpatches te inspecteren, gebruikt u het rechthoekige selectiekadergereedschap de voxelruimte rond de linten en gebruikt u afbeeldingsknippen om de afzonderlijke linten te isoleren. Klik vervolgens op afbeeldings- en afbeeldingsgrootte om een miniatuurarray van deze miniatuurprojecties te verkrijgen die kunnen worden gebruikt om gekoppelde synapsen versus weeslinten te identificeren.Alle tien muizen in dit representatieve experiment vertoonden ABR-drempels in reactie op toonuitbarstingen variërend tussen 25 en 70 decibel per geluidsdrukniveau, afhankelijk van de frequentie van de stimulus. De gehoordrempel voor dit experiment was het laagst met 16 kilohertz, wat overeenkomt met een ongeveer 43% van de afstand tot de cochleaire top, wat erop wijst dat de akoestische gevoeligheid in andere cochleaire gebieden aanzienlijk wordt verminderd. Hele mounts van het auditieve epitheel wordt in drie stukken ontleed en de lengtes worden gemeten en omgezet in hun procenten afstand van de cochleaire top.De frequentielocatie op het basilaire membraan van elke cochleaire draai wordt berekend met behulp van logaritmische functie. In normale oren van volwassen muizen, immunostaining onthult naast elkaar geplaatste paren van synaptische linten en glutamaat receptor patches. Het bestuderen van het oppervlak van het basolaterale membraan van de binnenhaarcellen, met acht tot 20 paren per cel.Hoewel de overgrote meerderheid van de puncta verschijnen als naast elkaar geplaatste paren in normale oren, worden weeslinten zelden waargenomen bij hoge vergrotingen. Het aantal binnenste haarcel lint synapsen is het hoogst op de 16 kilohertz regio en aanzienlijk afneemt als de afstand tot deze locatie toeneemt. Het belangrijkste om te onthouden tijdens deze procedure is dat men de integriteit van cochleair basaal membraan moet garanderen.We moeten de nauwkeurigheid benadrukken totdat de technische vaardigheid is bereikt. Na deze procedure kan de gentherapie worden uitgevoerd om te beantwoorden of de cochleaire neuropathie met deze maatregel kan worden hersteld. Deze maatregel is een bredere techniek voor het verkennen van cochleaire neuropathie, die als de primaire eerste gebeurtenissen associëren met het hebben van gehoorverlies, tinnitus, en hyperacusis.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Neuroscience

Unit 1

The Special Senses

SCIENTISTS IN ACTION

Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse

Postsynaptische Recordings op Afferente Dendrieten Contact opnemen met Cochlear binnenste haarcellen: Monitoring multivesiculaire release op een lint Synapse

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the ...

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Cerebrovasculaire Gieten van de volwassen muis voor 3D Imaging en morfologische analyse

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase activiteit in de verschillende regio&#39;s van de hersenen van muizen: Non-Radioactive Telomerase Herhaal Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

Functionele en morfologische beoordeling van Diafragma Innervatie door diafragma Motor Neuronen

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

High-Resolution Kwantitatieve immunogoud Analyse van membraanreceptoren op het netvlies Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Hele Mount Dissection en Immunofluorescentie van de Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Snelle en specifieke Immunomagnetic isolatie van de primaire oligodendrocyten muis

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Functionele evaluatie van olfactorische trajecten in levende Xenopus kikkervisjes

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Beeldvorming van cel-specifieke Calcium signalering in de tripartiete Synaps van het middenrif muis

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Stimulus-specific Cortical Visual Evoked Potential Morphological Patterns

Stimulus-specifieke corticale visuele Evoked potentiële morfologische patronen

This paper presents a methodology for the recording and analysis of cortical visual evoked potentials (CVEPs) in response to various visual stimuli using ...