Name: morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea
Uploaded: 2019-05-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (81770997, 81771016, 81830030); le projet de financement conjoint de la Fondation des sciences naturelles de Beijing et du Comité de l'éducation de Beijing (KZ201810025040); la Fondation des sciences naturelles de Beijing (7174291); et la China Postdoctoral Science Foundation (2016M601067).

Toutes les procédures ont été effectuées conformément au Guide du CNRC/ILAR pour l'entretien et l'utilisation des animaux de laboratoire (8e édition). Le protocole d'étude a été approuvé par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université médicale de la capitale, Beijing, Chine.
1. Sélection des animaux
<ol><li>Pour toutes les expériences, utilisez des souris mâles adultes C57BL/6J (8 semaines) comme modèle animal. REMARQUE:...

<ol>
	<li>Lie, A., Skogstad, M., Johnsen, T. S., Engdahl, B., Tambs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+notched+audiograms+in+a+cross-sectional+study+of+12,055+railway+workers.">The prevalence of notched audiograms in a cross-sectional study of 12,055 railway workers.</a> Ear and Hearing. 36 (3), 86-92 (2015).</li><li>Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+transduction,+tuning,+and+synaptic+transmission+in+the+mammalian+cochlea.">Hair cell transduction, tuning, and synaptic transmission in the mammalian cochlea.</a> Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).</li><li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cochlear+frequency+map+for+the+cat:+labeling+auditory-nerve+fibers+of+known+characteristic+frequency.">The cochlear frequency map for the cat: labeling auditory-nerve fibers of known characteristic frequency.</a> Journal of the Acoustical Society of America. 72 (5), 1441-1449 (1982).</li><li>Fettiplace, R., Kim, K. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+mechanoelectrical+transduction+channels+in+hearing.">The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing.</a> Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).</li><li>Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiological+place-frequency+map+of+the+cochlea+in+the+CBA/J+mouse.">A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse.</a> Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).</li><li>Viberg, A., Canlon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+guide+to+plotting+a+cochleogram.">The guide to plotting a cochleogram.</a> Hearing Research. 197 (1-2), 1-10 (2004).</li><li>Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+exposure+modulates+cochlear+inner+hair+cell+ribbon+volumes,+correlating+with+changes+in+auditory+measures+in+the+FVB/nJ+mouse.">Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse.</a> Scientific Reports. 6, 25056 (2016).</li><li>Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+after+noise+exposure:+acceleration+of+cochlear+synaptopathy+in+"recovered"+ears.">Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears.</a> Journal of Neuroscience. 35 (19), 7509-7520 (2015).</li><li>Wichmann, C., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+structure+and+function+of+inner+hair+cell+ribbon+synapses.">Relating structure and function of inner hair cell ribbon synapses.</a> Cell and Tissue Research. 361 (1), 95-114 (2015).</li><li>Matthews, G., Fuchs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+roles+of+ribbon+synapses+in+sensory+neurotransmission.">The diverse roles of ribbon synapses in sensory neurotransmission.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 812-822 (2010).</li><li>Liberman, L. D., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+maturation+of+auditory-nerve+heterogeneity,+as+seen+in+spatial+gradients+of+synapse+morphology+in+the+inner+hair+cell+area.">Postnatal maturation of auditory-nerve heterogeneity, as seen in spatial gradients of synapse morphology in the inner hair cell area.</a> Hearing Research. 339, 12-22 (2016).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximal+number+of+pre-synaptic+ribbons+are+formed+in+cochlear+region+corresponding+to+middle+frequency+in+mice.">Maximal number of pre-synaptic ribbons are formed in cochlear region corresponding to middle frequency in mice.</a> Acta Oto-Laryngologica. 138 (1), 25-30 (2018).</li><li>Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+synaptopathy+in+acquired+sensorineural+hearing+loss:+Manifestations+and+mechanisms.">Cochlear synaptopathy in acquired sensorineural hearing loss: Manifestations and mechanisms.</a> Hearing Research. 349, 138-147 (2017).</li><li>Moser, T., Starr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+neuropathy--neural+and+synaptic+mechanisms.">Auditory neuropathy--neural and synaptic mechanisms.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (3), 135-149 (2016).</li><li>Yu, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Gata3-Mafb+transcriptional+network+directs+post-synaptic+differentiation+in+synapses+specialized+for+hearing.">A Gata3-Mafb transcriptional network directs post-synaptic differentiation in synapses specialized for hearing.</a> Elife. 2, 01341 (2013).</li><li>Buniello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wbp2+is+required+for+normal+glutamatergic+synapses+in+the+cochlea+and+is+crucial+for+hearing.">Wbp2 is required for normal glutamatergic synapses in the cochlea and is crucial for hearing.</a> EMBO Molecular Medicine. 8 (3), 191-207 (2016).</li><li>Gilels, F., Paquette, S. T., Beaulac, H. J., Bullen, A., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+hearing+loss+and+outer+hair+cell+death+in+homozygous+Foxo3+knockout+mice+after+moderate+noise+exposure.">Severe hearing loss and outer hair cell death in homozygous Foxo3 knockout mice after moderate noise exposure.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1054 (2017).</li><li>Kane, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+effects+on+age-related+hearing+loss+associated+with+Cdh23+variants+in+mice.">Genetic background effects on age-related hearing loss associated with Cdh23 variants in mice.</a> Hearing Research. 283 (1-2), 80-88 (2012).</li><li>Jiang, X. W., Li, X. R., Zhang, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+of+ribbon+synapses+number+of+cochlear+hair+cells+in+C57BL/6J+mice+with+age+(Delta).">Changes of ribbon synapses number of cochlear hair cells in C57BL/6J mice with age (Delta).</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (10), 19058-19064 (2015).</li><li>Akil, O., Oursler, A., Fan, K., Lustig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+auditory+brainstem+response+testing.">Mouse auditory brainstem response testing.</a> BIO-Protocol. 6 (6), (2016).</li><li>Zhou, X., Jen, P. H. -. S., Seburn, K. L., Frankel, W. N., Zheng, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+brainstem+responses+in+10+inbred+strains+of+mice.">Auditory brainstem responses in 10 inbred strains of mice.</a> Brain Research. 1091 (1), 16-26 (2006).</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+dissection+and+immunofluorescence+of+the+adult+mouse+cochlea.">Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).</li><li>Schmitz, F., Konigstorfer, A., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIBEYE,+a+component+of+synaptic+ribbons:+a+protein's+journey+through+evolution+provides+insight+into+synaptic+ribbon+function.">RIBEYE, a component of synaptic ribbons: a protein's journey through evolution provides insight into synaptic ribbon function.</a> Neuron. 28 (3), 857-872 (2000).</li><li>Suzuki, J., Corfas, G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round-window+delivery+of+neurotrophin+3+regenerates+cochlear+synapses+after+acoustic+overexposure.">Round-window delivery of neurotrophin 3 regenerates cochlear synapses after acoustic overexposure.</a> Scientific Reports. 6, 24907 (2016).</li><li>Rutherford, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+structure+of+inner+ear+ribbon+synapses+with+STED+microscopy.">Resolving the structure of inner ear ribbon synapses with STED microscopy.</a> Synapse. 69 (5), 242-255 (2015).</li><li>Liberman, L. D., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+cochlear+synaptopathy+after+acoustic+overexposure.">Dynamics of cochlear synaptopathy after acoustic overexposure.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 16 (2), 205-219 (2015).</li><li>Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+Foxo3+causes+adult+onset+auditory+neuropathy+and+alters+cochlear+synapse+architecture+in+mice.">Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice.</a> Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).</li><li>Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin-3+regulates+ribbon+synapse+density+in+the+cochlea+and+induces+synapse+regeneration+after+acoustic+trauma.">Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+cochlear+synaptopathy:+an+early-onset+contributor+to+auditory+functional+decline.">Age-related cochlear synaptopathy: an early-onset contributor to auditory functional decline.</a> Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).</li><li>Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+cochlear+neuropathy+is+selective+for+fibers+with+low+spontaneous+rates.">Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).</li><li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adding+insult+to+injury:+cochlear+nerve+degeneration+after+"temporary"+noise-induced+hearing+loss.">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss.</a> Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li><li>Valero, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+cochlear+synaptopathy+in+rhesus+monkeys+(Macaca+mulatta).">Noise-induced cochlear synaptopathy in rhesus monkeys (Macaca mulatta).</a> Hearing Research. 353, 213-223 (2017).</li><li>Viana, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+neuropathy+in+human+presbycusis:+Confocal+analysis+of+hidden+hearing+loss+in+post-mortem+tissue.">Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue.</a> Hearing Research. 327, 78-88 (2015).</li><li>Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerated+synapses+between+postnatal+hair+cells+and+auditory+neurons.">Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (3), 321-329 (2013).</li><li>Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+murine+cochlear+explant+technique+as+an+in+vitro+screening+tool+in+hearing+research.">Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).</li><li>Takeda, S., Mannstr&#246;m, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Aging+and+Noise+Exposure+on+Auditory+Brainstem+Responses+and+Number+of+Presynaptic+Ribbons+in+Inner+Hair+Cells+of+C57BL/6J+Mice.">Effects of Aging and Noise Exposure on Auditory Brainstem Responses and Number of Presynaptic Ribbons in Inner Hair Cells of C57BL/6J Mice.</a> Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).</li><li>Mehraei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+brainstem+response+latency+in+noise+as+a+marker+of+cochlear+synaptopathy.">Auditory brainstem response latency in noise as a marker of cochlear synaptopathy.</a> Journal of Neuroscience. 36 (13), 3755-3764 (2016).</li></ol>

Depuis la synaptopathie cochléaire a d'abord été caractérisée chez les souris adultes avec un changement de seuil temporaire (TTS) induit par 8-u201216 kHz bruit de bande d'octave à 100 dB SPL pour 2 h31, les chercheurs ont de plus en plus étudié les effets de la synaptopathie dans divers mammifères, y compris les singes et les humains32,33. En plus de l'exposition au bruit, plusieurs autres affections ont été associées à la s...

Les fréquences de l'ordre d'environ 20'u201220,000 Hz peuvent être perçues comme des stimuli auditifs par les humains. L'audition humaine est normalement plus sensible près de 1 000 Hz, où le niveau moyen de pression sonore est de 20 degrés Pa chez les jeunes adultes (c.-à-d. 0 décibels de niveau de pression sonore [dB SPL]). Dans certaines conditions pathologiques, la perte auditive est limitée à des fréquences spécifiques. Par exemple, dans les premiers stades de la perte auditive causée par le bruit (NIHL), une « encoche » (c.-à-d. l'élévation du seuil auditif) peut être observée dans l'audiogramme à 4 kHz1. Le long de la partition cochléaire des mammifères, ses gradations de rigidité et de masse produisent une carte de fréquence exponentielle, avec détection sonore à haute fréquence à la base de la cochlée et détection à basse fréquence au sommet2. En effet, il existe une carte cochléaire de la fréquence des lieux le long de la membrane basilaire, menant à ce qu'on appelle l'organisation tonotopic2,3. Chaque endroit donné sur la membrane basilaire a la plus grande sensibilité à une seule fréquence sonore particulière, qui est généralement appelée la fréquence caractéristique3,4, bien que des réponses à d'autres fréquences peuvent également être observées.
À ce jour, divers modèles de souris ont été utilisés pour étudier la fonction normale, les processus pathologiques et l'efficacité thérapeutique dans le système auditif. La connaissance précise des paramètres physiologiques dans la cochlée de souris est une condition préalable à de telles études de la perte auditive. La cochlée de souris est anatomiquement divisée en tours apaïques, moyens et basaux, qui correspondent à différentes régions de fréquence. En étiquetant les afferents de nerf auditif au noyau cochléaire pour analyser leurs emplacements périphériques correspondants d'innervation dans la cochlée,M. et autres ont réussi à établir la carte cochléaire de lieu-fréquence dans la souris normale in vivo 5. Dans l'intervalle de 7,2 à 61,8 kHz, ce qui correspond à des positions comprises entre 90 % et 10 % de la longueur complète de la membrane basilaire, la carte cochléaire de la fréquence cochléaire de la souris peut être décrite par une simple fonction de régression linéaire, suggérant une relation entre les distance normalisée de la base cochléaire et du logarithme de la fréquence caractéristique5. Chez les souris de laboratoire, la carte place-fréquence peut être utilisée pour explorer la relation entre les seuils auditifs dans des plages de fréquences spécifiques et les cochléogrammes montrant le nombre de cellules ciliées manquantes dans les régions relatives le long de la membrane basilaire6. Fait important, la carte place-fréquence fournit un système de positionnement pour l'étude des dommages structurels minimaux, tels que des dommages aux synapses de ruban des cellules de cheveux à des endroits spécifiques de fréquence cochléaire chez les souris avec le trauma auditif périphérique7 ,8.
Dans la cochlée des mammifères, les synapses de ruban sont composées d'un ruban présynaptique, d'une projection dense d'électrons qui attache un halo de vésicules synaptiques prêtes à libérer contenant du glutamate au sein du CSI, et d'une densité postsynaptique sur le terminal nerveux du SGN avec des récepteurs de glutamate9. Pendant la transduction cochléaire de bruit, la déviation du faisceau de cellules de cheveux a comme conséquence la dépolarisation d'IHC, qui mène à la libération de glutamate des IHCs sur les bornes afferents postsynaptic, activant de ce fait la voie auditive. L'activation de cette voie conduit à la transformation des signaux mécaniques induits par le son en un code de taux dans le SGN10. En effet, la synapse ruban IHC est hautement spécialisée pour la transmission sonore infatigable à des taux de centaines de Hertz avec une haute précision temporelle, et est d'une importance critique pour les mécanismes presynaptiques de codage sonore. Des études antérieures ont révélé que les synapses de ruban varient considérablement en taille et en nombre à différentes régions de fréquence dans la cochlée adulte de souris11,12, reflétant probablement l'adaptation structurale au codage sonore particulier pour besoins de survie. Récemment, des études expérimentales sur les animaux ont démontré que la synaptopathie cochléaire contribue à de multiples formes de déficiences auditives, y compris la perte auditive causée par le bruit, la perte auditive liée à l'âge et la perte auditive héréditaire13, 14. Ainsi, les méthodes d'identification des changements corrélés dans le nombre, la structure et la fonction synaptiques à des régions de fréquence spécifiques ont été de plus en plus employées dans les études du développement auditif et de la maladie de l'oreille interne, utilisant des modèles générés par l'intermédiaire manipulation expérimentale des variables génétiques ou environnementales15,16,17.
Dans le rapport actuel, nous présentons un protocole pour analyser le nombre synaptique, la structure, et la fonction à une région spécifique de fréquence de la membrane basilaire chez les souris adultes. La localisation de la fréquence cochléaire est effectuée à l'aide d'une carte de fréquence de lieu donnée en combinaison avec un cochléogramme. Les caractéristiques morphologiques normales des synapses de ruban cochléaire sont évaluées par immunostaining presynaptic et postsynaptic. L'état fonctionnel des synapses de ruban cochléaire est déterminé en fonction des amplitudes supraseuils de l'onde I de l'ABR. Avec des altérations mineures, ce protocole peut être utilisé pour examiner les conditions physiologiques ou pathologiques dans d'autres modèles animaux, y compris les rats, les cobayes et les gerbilles.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:828px;" width="828">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ketamine hydrochloride</td>
			<td style="width:304px;">Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China</td>
			<td style="width:141px;">H35020148</td>
			<td style="width:167px;">100mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>X-1251</td>
			<td>10mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TDT physiology apparatus</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA</td>
			<td colspan="2">Auditory Physiology System III</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SigGen/BioSig software</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA</td>
			<td colspan="2">Auditory Physiology System III</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electric Pad</td>
			<td>Pet Fun</td>
			<td>11072931136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps 3#</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada</td>
			<td>0203-3-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps 5#</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada</td>
			<td>0209-5-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereo dissection microscope</td>
			<td>Nikon Corp., Tokyo, Japan</td>
			<td>SMZ1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat serum</td>
			<td>ZSGB-BIO, Beijing,China</td>
			<td>ZLI-9021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4</td>
			<td>Millipore Corp., Billerica, MA, USA</td>
			<td>MAB397</td>
			<td>mouse&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified Mouse Anti-CtBP2</td>
			<td>BD Biosciences, Billerica, MA, USA</td>
			<td>612044</td>
			<td>mouse&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>A21124</td>
			<td>goat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>A21131</td>
			<td>goat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting medium containing DAPI</td>
			<td>ZSGB-BIO, Beijing,China</td>
			<td>ZLI-9557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal fluorescent microscopy</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>TCS SP8 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image Pro Plus software</td>
			<td>Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA</td>
			<td>version 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Professional diagnostic pocket otoscope</td>
			<td>Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,China</td>
			<td>HS-OT10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle electrode</td>
			<td>Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi&#39;an,China</td>
			<td>1029</td>
			<td>20 mm, 28 G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Closed-field speaker</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA</td>
			<td>CF1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea

Les cellules ciliées intérieures cochléaires (IHC) transmettent des signaux acoustiques aux neurones de ganglion en spirale (SGN) par des synapses de ruban. Plusieurs études expérimentales ont indiqué que les synapses de cellules capillaires peuvent être les cibles initiales dans la perte d'audition neuro-sensorielle (SNHL). Ces études ont proposé le concept de « synaptopathie » cochléaire, qui se réfère aux altérations du nombre, de la structure ou de la fonction de synapse de ruban qui ont comme conséquence la transmission synaptique anormale entre iHCs et SGNs. Bien que la synaptopathie cochléaire soit irréversible, elle n'affecte pas le seuil auditif. Dans les modèles expérimentaux induits par le bruit, des dommages limités aux synapses du CSI dans certaines régions de fréquence sont utilisés pour identifier les facteurs environnementaux qui causent spécifiquement la synaptopathie, ainsi que les conséquences physiologiques de déranger cette oreille interne. circuit. Ici, nous présentons un protocole pour analyser la morphologie synaptique cochléaire et fonctionner à une région de fréquence spécifique chez les souris adultes. Dans ce protocole, la localisation cochléaire des régions de fréquence spécifiques est effectuée à l'aide de cartes de fréquence synaptique en conjonction avec des données de cochléogramme, après quoi les caractéristiques morphologiques des synapses de ruban sont évaluées par l'intermédiaire synaptique Immunomarquage. L'état fonctionnel des synapses de ruban est alors déterminé basé sur les amplitudes de la réponse auditive de tronc cérébral (ABR) vague I. Le présent rapport démontre que cette approche peut être utilisée pour approfondir notre compréhension de la pathogénie et des mécanismes du dysfonctionnement synaptique dans la cochlée, qui peut aider au développement de nouvelles interventions thérapeutiques.

Des essais auditifs d'ABR ont été exécutés pour 10 souris de C57BL/6J (8 semaines d'âge) sous l'anesthésie. Les APR ont été obtenus à l'aide de stimuli de tonalité à 4, 8, 16, 32 et 48 kHz. Le seuil auditif de chaque animal a été détecté visuellement en distinguant au moins une forme d'onde claire dans l'ABR. Toutes les souris ont exhibé des seuils d'ABR en réponse aux éclats de tonalité, s'étendant entre 25 et 70 dB SPL selon la fréquence du stimulus. Nos résultats ont indiqué que le seuil d'audit...

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Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

Ce manuscrit décrit un protocole expérimental pour évaluer les caractéristiques morphologiques et l'état fonctionnel des synapses de ruban chez les souris normales. Le modèle actuel convient également aux modèles à synaptopathie cochléaire induits par le bruit et liés à l'âge. Les résultats corrélatifs des études précédentes de souris sont également discutés.

Évaluation morphologique et fonctionnelle des synapses de ruban aux régions spécifiques de fréquence de la Cochlea de souris

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

Le rapport principal est vraiment l’importance de souligner avec précision la région de fréquence spécifique de la membrane basilaire dans la plupart des modèles, où les nombres de synapse modifiés et la fonction peuvent être analysées. La localisation cochléaire des régions de fréquences spécifiques est effectuée de manière fiable à l’aide de cartes de fréquences de lieu en conjonction avec les données cochléogrammes. Le microscope donne un aperçu de plusieurs études de recherche.Il soutient l’idée que la neuropathie cochléaire est les événements initiaux primaires précédant spécifiquement la perte d’audition, l’acouphène, et l’hyperacusis. Après avoir confirmé un manque de réponse au pincement d’orteil dans une souris mâle adulte de huit semaines anesthésiée de huit semaines C57 noire 6J. Placez la souris sur un coussin chauffant de 37 degrés Celsius dans une pièce électriquement et acoustiquement blindée.Ensuite, placez une électrode d’enregistrement d’aiguille sous-dermique de 20 millimètres de calibre 28, avec la profondeur de trois millimètres sous la peau au sommet du crâne. Une électrode de référence dans la région parotide ipsilateral, au-dessous de la pinna de l’oreille mesurée et d’une électrode moulue dans la région parotide contralatérale. Placez un haut-parleur de champ fermé équipé d’un tube en plastique de deux centimètres avec une pointe en forme de cône à côté de la souris et placez la pointe dans le conduit auditif externe.Pour une réponse auditive du tronc cérébral, ou enregistrement ABR, générer des pépins de tonalité à des niveaux de pression sonore décroissants de 90 à 10 décibels, en cinq à 10 décibels étapes de niveau de pression sonore. Au cours de cette étape, les réponses sont amplifiées, filtrées et moyennes. À chaque fréquence, déterminez le seuil ABR, qui est le niveau minimal de pression sonore qui se traduit par un enregistrement ABR fiable avec une ou plusieurs ondes distinguables qui peuvent être clairement identifiées par inspection visuelle.Après l’enregistrement ABR, exposer le bulla du côté ventral et ouvrir le bulla avec des ciseaux pointus pour accéder à la cochlée. À l’aide de forceps fins, enlever les os temporels et couper l’artère des stapes. Retirez ensuite les stapes de la fenêtre ovale et rompez la membrane de la fenêtre ronde.Faites pivoter doucement la pointe d’une aiguille de calibre 27 de 13 millimètres pour faire un petit trou au sommet de la cochlée, avant d’utiliser une pipette fine à pointe pour rincer doucement 4% de paraformaldéhyde à travers la fenêtre dans les espaces périlymphatiques. Ensuite, rincez les os trois fois pendant cinq minutes par lavage avec du PBS frais et froid de 0,1 molaire par lavage. Suivi de la décalcification des os avec 10%EDTA pendant quatre heures à température ambiante et 20 rotations par minute sur un shaker horizontal.À la fin de l’incubation, transférer un os temporel décalcifié en PBS molaire frais de 0,1 molar sous un microscope dissectant. Utilisez 3 et 5 forceps Dumont et une aiguille de calibre 27 pour disséquer à leur tour les régions cochlées apical, moyennes et basales. Utilisez une lame de rasoir pour faire une petite série de coupures le long du ligament spirale et enlever la membrane tectoriale et la membrane de Reissner.Disséquer davantage l’épithélium auditif restant, y compris le limbe en spirale, en virages cochléaires individuels pour des préparations entières de montage. Ensuite, utilisez l’objectif d’huile 40X d’un microscope léger pour mesurer la longueur de la membrane basilaire avec l’échelle de 250 micromètres placée dans le morceau d’oeil. Il peut être ajusté le long de la stéréocilia des cellules cils intérieures.Après la dissection, placez chaque tour cochléaire en tubes de centrifugeuse individuels de 2,5 millilitres. Bloquez toute liaison non spécifique avec 10% de sérum de chèvre en PBS en 0,1%Triton X-100 pendant une heure à température ambiante sur un rotateur. À la fin de l’incubation, utilisez la pointe de pipette de 200 microlitres pour enlever la solution au microscope à dissection.Incuber les spécimens avec les anticorps primaires d’intérêt dilués dans 5% sérum de chèvre et PBS dans 0,1%Triton X-100 pendant la nuit à 4 degrés Celsius sur un rotateur. Le lendemain matin, rincez les échantillons de tissus trois fois pendant cinq minutes avec du PBS molaire froid de 0,1 par lavage pour enlever tout anticorps primaire résiduel. Ensuite, étiquetez les spécimens avec les anticorps secondaires appropriés dilués dans 5% sérum de chèvre dans PBS dans 0,1%Triton X-100 pendant deux à trois heures à température ambiante sur le rotateur, protégé de la lumière.À la fin de l’incubation, lavez les échantillons trois fois avec 0,1 PBS molaire tel que démontré et transférez les spécimens dans des plaques individuelles de 35 millimètres contenant 0,1 molaire PBS. Placez une goutte de milieu de montage complété par DAPI sur la lame et transférez les spécimens de PBS au milieu de montage. Placez un bord d’un couvercle glisser sur chaque glissière et relâchez pour laisser le couvercle glisser doucement.Ensuite, séchez les glissières dans une boîte à glissière à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Pour l’image des spécimens, utilisez un microscope confocal avec les lasers appropriés et 63X lentille d’immersion d’huile haute résolution pour acquérir huit micromètres confocal Z piles de chaque tour cochléaire. Pour les comptes de ponction synaptique, réglez les piles Z avec la taille de l’étape de 0,3 micromètre pour couvrir toute la longueur des cellules cils intérieures, en assurant que toutes les ponctions synaptiques peuvent être photographiées et fusionner la ponction contenant des images dans une pile Z pour obtenir la projection d’accès Z.Importez les images fusionnées dans un logiciel de traitement d’image approprié. Divisez le nombre total synaptique dans chaque pile Z à des régions de fréquence spécifiques par le nombre de cellules cils intérieures positives DAPI pour calculer le nombre de ponctions synaptiques pour chaque cellule. À chaque région de fréquence spécifique, la moyenne de toutes les ponctions synaptiques dans trois images de différents champs microscopiques, contenant neuf à 11 cellules cils intérieures.Pour mieux visualiser l’architecture cytosquelettique et la localisation synaptique, utilisez l’outil brosse pour évaluer visuellement la structure synaptique et la distribution des cellules cils intérieures individuelles. Pour inspecter la juxtaposition de rubans présynaptiques et de timbres récepteurs postsynaptiques, utilisez l’outil rectangulaire de chapiteau extraire l’espace voxel autour des rubans et utiliser la coupe d’image pour isoler les rubans individuels. Cliquez ensuite sur la taille de l’image et de l’image pour acquérir un tableau miniature de ces projections miniatures qui peuvent être utilisées pour identifier les synapses appariées par rapport aux rubans orphelins.Les dix souris de cette expérience représentative présentaient des seuils ABR en réponse à des éclats de tonalité allant de 25 à 70 décibels par niveau de pression sonore selon la fréquence du stimulus. Le seuil auditif de cette expérience était le plus bas à 16 kilohertz correspondant à environ 43 % de la distance par rapport à l’apex cochléaire, ce qui suggère que la sensibilité acoustique est considérablement réduite dans d’autres régions cochléaires. Les montures entières de l’épithélium auditif sont disséquées en trois morceaux et les longueurs sont mesurées et converties en leur pourcentage de distance par rapport à l’apex cochléaire.L’emplacement de fréquence sur la membrane basilaire de chaque tour cochléaire est calculé à l’aide de la fonction logarithmique. Dans les oreilles normales des souris adultes, l’immunostaining révèle des paires juxtaposées de rubans synaptiques et de patchs récepteurs du glutamate. Étude de la surface de la membrane basolateral des cellules cils intérieures, avec huit à 20 paires par cellule.Bien que la grande majorité des ponctions apparaissent comme des paires juxtaposées dans les oreilles normales, les rubans orphelins sont rarement observés à des grossissements élevés. Le nombre de synapses intérieures de ruban de cellules de cheveux est le plus élevé à la région de 16 kilohertz et diminue sensiblement pendant que la distance de cet endroit augmente. La chose la plus importante à retenir au cours de cette procédure est qu’il faut garantir l’intégrité de la membrane basale cochléaire.Nous devons insister sur l’exactitude jusqu’à ce que la compétence technique soit atteinte. Après cette procédure, la thérapie génique peut être effectuée pour répondre si la neuropathie cochléaire peut être réparée par cette mesure. Cette mesure est la technique plus large pour explorer la neuropathie cochléaire, qui si les événements initiaux primaires associent à avoir la perte d’audition, l’acouphène, et l’hyperacusis.

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