Name: morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea
Uploaded: 2019-05-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81770997, 81771016, 81830030) unterstützt. das gemeinsame Förderprojekt der Beijing Natural Science Foundation und des Beijing Education Committee (KZ201810025040); der Beijing Natural Science Foundation (7174291); und der China Postdoctoral Science Foundation (2016M601067).

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem NRC/ILAR Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (8. Auflage) durchgeführt. Das Studienprotokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der Capital Medical University, Peking, China, genehmigt.
1. Tierauswahl
<ol><li>Für alle Experimente verwenden Sie erwachsene C57BL/6J männliche Mäuse (8 Wochen alt) als Tiermodell. HINWEIS: C57BL/6J-Mäuse, die eine Spleißvariante des Cdh23 tragen, z...

<ol>
	<li>Lie, A., Skogstad, M., Johnsen, T. S., Engdahl, B., Tambs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+notched+audiograms+in+a+cross-sectional+study+of+12,055+railway+workers.">The prevalence of notched audiograms in a cross-sectional study of 12,055 railway workers.</a> Ear and Hearing. 36 (3), 86-92 (2015).</li><li>Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+transduction,+tuning,+and+synaptic+transmission+in+the+mammalian+cochlea.">Hair cell transduction, tuning, and synaptic transmission in the mammalian cochlea.</a> Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).</li><li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cochlear+frequency+map+for+the+cat:+labeling+auditory-nerve+fibers+of+known+characteristic+frequency.">The cochlear frequency map for the cat: labeling auditory-nerve fibers of known characteristic frequency.</a> Journal of the Acoustical Society of America. 72 (5), 1441-1449 (1982).</li><li>Fettiplace, R., Kim, K. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+mechanoelectrical+transduction+channels+in+hearing.">The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing.</a> Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).</li><li>Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiological+place-frequency+map+of+the+cochlea+in+the+CBA/J+mouse.">A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse.</a> Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).</li><li>Viberg, A., Canlon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+guide+to+plotting+a+cochleogram.">The guide to plotting a cochleogram.</a> Hearing Research. 197 (1-2), 1-10 (2004).</li><li>Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+exposure+modulates+cochlear+inner+hair+cell+ribbon+volumes,+correlating+with+changes+in+auditory+measures+in+the+FVB/nJ+mouse.">Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse.</a> Scientific Reports. 6, 25056 (2016).</li><li>Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+after+noise+exposure:+acceleration+of+cochlear+synaptopathy+in+"recovered"+ears.">Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears.</a> Journal of Neuroscience. 35 (19), 7509-7520 (2015).</li><li>Wichmann, C., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+structure+and+function+of+inner+hair+cell+ribbon+synapses.">Relating structure and function of inner hair cell ribbon synapses.</a> Cell and Tissue Research. 361 (1), 95-114 (2015).</li><li>Matthews, G., Fuchs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+roles+of+ribbon+synapses+in+sensory+neurotransmission.">The diverse roles of ribbon synapses in sensory neurotransmission.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 812-822 (2010).</li><li>Liberman, L. D., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+maturation+of+auditory-nerve+heterogeneity,+as+seen+in+spatial+gradients+of+synapse+morphology+in+the+inner+hair+cell+area.">Postnatal maturation of auditory-nerve heterogeneity, as seen in spatial gradients of synapse morphology in the inner hair cell area.</a> Hearing Research. 339, 12-22 (2016).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximal+number+of+pre-synaptic+ribbons+are+formed+in+cochlear+region+corresponding+to+middle+frequency+in+mice.">Maximal number of pre-synaptic ribbons are formed in cochlear region corresponding to middle frequency in mice.</a> Acta Oto-Laryngologica. 138 (1), 25-30 (2018).</li><li>Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+synaptopathy+in+acquired+sensorineural+hearing+loss:+Manifestations+and+mechanisms.">Cochlear synaptopathy in acquired sensorineural hearing loss: Manifestations and mechanisms.</a> Hearing Research. 349, 138-147 (2017).</li><li>Moser, T., Starr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+neuropathy--neural+and+synaptic+mechanisms.">Auditory neuropathy--neural and synaptic mechanisms.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (3), 135-149 (2016).</li><li>Yu, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Gata3-Mafb+transcriptional+network+directs+post-synaptic+differentiation+in+synapses+specialized+for+hearing.">A Gata3-Mafb transcriptional network directs post-synaptic differentiation in synapses specialized for hearing.</a> Elife. 2, 01341 (2013).</li><li>Buniello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wbp2+is+required+for+normal+glutamatergic+synapses+in+the+cochlea+and+is+crucial+for+hearing.">Wbp2 is required for normal glutamatergic synapses in the cochlea and is crucial for hearing.</a> EMBO Molecular Medicine. 8 (3), 191-207 (2016).</li><li>Gilels, F., Paquette, S. T., Beaulac, H. J., Bullen, A., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+hearing+loss+and+outer+hair+cell+death+in+homozygous+Foxo3+knockout+mice+after+moderate+noise+exposure.">Severe hearing loss and outer hair cell death in homozygous Foxo3 knockout mice after moderate noise exposure.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1054 (2017).</li><li>Kane, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+effects+on+age-related+hearing+loss+associated+with+Cdh23+variants+in+mice.">Genetic background effects on age-related hearing loss associated with Cdh23 variants in mice.</a> Hearing Research. 283 (1-2), 80-88 (2012).</li><li>Jiang, X. W., Li, X. R., Zhang, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+of+ribbon+synapses+number+of+cochlear+hair+cells+in+C57BL/6J+mice+with+age+(Delta).">Changes of ribbon synapses number of cochlear hair cells in C57BL/6J mice with age (Delta).</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (10), 19058-19064 (2015).</li><li>Akil, O., Oursler, A., Fan, K., Lustig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+auditory+brainstem+response+testing.">Mouse auditory brainstem response testing.</a> BIO-Protocol. 6 (6), (2016).</li><li>Zhou, X., Jen, P. H. -. S., Seburn, K. L., Frankel, W. N., Zheng, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+brainstem+responses+in+10+inbred+strains+of+mice.">Auditory brainstem responses in 10 inbred strains of mice.</a> Brain Research. 1091 (1), 16-26 (2006).</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+dissection+and+immunofluorescence+of+the+adult+mouse+cochlea.">Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).</li><li>Schmitz, F., Konigstorfer, A., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIBEYE,+a+component+of+synaptic+ribbons:+a+protein's+journey+through+evolution+provides+insight+into+synaptic+ribbon+function.">RIBEYE, a component of synaptic ribbons: a protein's journey through evolution provides insight into synaptic ribbon function.</a> Neuron. 28 (3), 857-872 (2000).</li><li>Suzuki, J., Corfas, G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round-window+delivery+of+neurotrophin+3+regenerates+cochlear+synapses+after+acoustic+overexposure.">Round-window delivery of neurotrophin 3 regenerates cochlear synapses after acoustic overexposure.</a> Scientific Reports. 6, 24907 (2016).</li><li>Rutherford, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+structure+of+inner+ear+ribbon+synapses+with+STED+microscopy.">Resolving the structure of inner ear ribbon synapses with STED microscopy.</a> Synapse. 69 (5), 242-255 (2015).</li><li>Liberman, L. D., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+cochlear+synaptopathy+after+acoustic+overexposure.">Dynamics of cochlear synaptopathy after acoustic overexposure.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 16 (2), 205-219 (2015).</li><li>Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+Foxo3+causes+adult+onset+auditory+neuropathy+and+alters+cochlear+synapse+architecture+in+mice.">Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice.</a> Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).</li><li>Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin-3+regulates+ribbon+synapse+density+in+the+cochlea+and+induces+synapse+regeneration+after+acoustic+trauma.">Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+cochlear+synaptopathy:+an+early-onset+contributor+to+auditory+functional+decline.">Age-related cochlear synaptopathy: an early-onset contributor to auditory functional decline.</a> Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).</li><li>Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+cochlear+neuropathy+is+selective+for+fibers+with+low+spontaneous+rates.">Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).</li><li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adding+insult+to+injury:+cochlear+nerve+degeneration+after+"temporary"+noise-induced+hearing+loss.">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss.</a> Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li><li>Valero, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+cochlear+synaptopathy+in+rhesus+monkeys+(Macaca+mulatta).">Noise-induced cochlear synaptopathy in rhesus monkeys (Macaca mulatta).</a> Hearing Research. 353, 213-223 (2017).</li><li>Viana, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+neuropathy+in+human+presbycusis:+Confocal+analysis+of+hidden+hearing+loss+in+post-mortem+tissue.">Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue.</a> Hearing Research. 327, 78-88 (2015).</li><li>Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerated+synapses+between+postnatal+hair+cells+and+auditory+neurons.">Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (3), 321-329 (2013).</li><li>Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+murine+cochlear+explant+technique+as+an+in+vitro+screening+tool+in+hearing+research.">Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).</li><li>Takeda, S., Mannstr&#246;m, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Aging+and+Noise+Exposure+on+Auditory+Brainstem+Responses+and+Number+of+Presynaptic+Ribbons+in+Inner+Hair+Cells+of+C57BL/6J+Mice.">Effects of Aging and Noise Exposure on Auditory Brainstem Responses and Number of Presynaptic Ribbons in Inner Hair Cells of C57BL/6J Mice.</a> Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).</li><li>Mehraei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+brainstem+response+latency+in+noise+as+a+marker+of+cochlear+synaptopathy.">Auditory brainstem response latency in noise as a marker of cochlear synaptopathy.</a> Journal of Neuroscience. 36 (13), 3755-3764 (2016).</li></ol>

Da die Cochlea-Synaptopathie erstmals bei erwachsenen Mäusen mit einer temporären Schwellenverschiebung (TTS) charakterisiert wurde, die durch 8-u201216 kHz Oktavbandrauschen bei 100 dB SPL für 2 h31induziert wurde, haben Forscher die Auswirkungen der Synaptopathie in verschiedenen Säugetiere, einschließlich Affen und Menschen32,33. Neben der Lärmexposition wurden mehrere andere Erkrankungen mit cochlea-Synaptopathie in Verbindung ge...

Frequenzen im Bereich von ca. 20bis220.000 Hz können vom Menschen als akustische Reize wahrgenommen werden. Das menschliche Gehör ist normalerweise am empfindlichsten in der Nähe von 1.000 Hz, wobei der durchschnittliche Schalldruckpegel bei jungen Erwachsenen bei 20 Pa liegt (d. h. 0 Dezibel Schalldruckpegel [dB SPL]). Unter bestimmten pathologischen Bedingungen ist der Hörverlust auf bestimmte Frequenzen beschränkt. Beispielsweise kann in den frühen Stadien des lärminduzierten Hörverlusts (NIHL) eine "Notch" (d. h. eine Höhe des Hörschwellenwerts) im Audiogramm bei 4 kHz1beobachtet werden. Entlang der Cochlea-Partition des Säugetiers erzeugen ihre Abstufungen von Steifigkeit und Masse eine exponentielle Frequenzkarte mit hochfrequenter Schallerkennung an der Basis der Cochlea und Niederfrequenz-Detektion an der Spitze2. Tatsächlich gibt es entlang der Basilarmembran eine Cochlea-Ortsfrequenzkarte, die zu der so genannten tonotopischen Organisation2,3führt. Jeder angegebene Platz auf der Basilarmembran hat die höchste Empfindlichkeit gegenüber nur einer bestimmten Schallfrequenz, die in der Regel als charakteristische Frequenz3,4bezeichnet wird, obwohl auch Reaktionen auf andere Frequenzen beobachtet werden können.
Bis heute wurden verschiedene Mausmodelle verwendet, um die normale Funktion, pathologische Prozesse und die therapeutische Wirksamkeit im Hörsystem zu untersuchen. Die genaue Kenntnis physiologischer Parameter in der Mauscochlea ist Voraussetzung für solche Studien zum Hörverlust. Die Maus-Cochlea ist anatomisch in apikale, mittlere und basale Drehungen unterteilt, die unterschiedlichen Frequenzbereichen entsprechen. Durch die Kennzeichnung von auditiven Nervenaffeen am Cochlea-Kern zur Analyse der entsprechenden peripheren Innervationsstellen in der Cochlea gelang es Müller et al. die Erstellung der Cochlea-Ortsfrequenzkarte in der normalen Maus in vivo5. Im Intervall von 7,2–61,8 kHz, was Positionen zwischen 90% und 10% der gesamten Länge der Basilarmembran entspricht, kann die Maus-Cochlea-Ortfrequenzkarte durch eine einfache lineare Regressionsfunktion beschrieben werden, was auf eine Beziehung zwischen normalisierter Abstand von der Cochlea-Basis und dem Logarithmus der Charakteristischen Frequenz5. Bei Labormäusen kann die Ortsfrequenzkarte verwendet werden, um den Zusammenhang zwischen Hörschwellen innerhalb bestimmter Frequenzbereiche und Cochleogrammen zu untersuchen, die die Anzahl fehlender Haarzellen in relativen Regionen entlang der Basilarmembran6zeigen. Wichtig ist, dass die Ortsfrequenzkarte ein Positionierungssystem für die Untersuchung minimaler struktureller Schäden bietet, wie z. B. Schäden an den Bandsynapsen von Haarzellen an bestimmten Cochlea-Frequenzorten bei Mäusen mit peripherem Hörtrauma7 ,8.
In der Säugetier-Cochlea bestehen Bandsynapsen aus einem präsynaptischen Band, einer elektronendichten Projektion, die einen Halo von freilos reifen synaptischen Vesikeln, die Glutamat im IHC enthalten, und einer postsynaptischen Dichte am Nerventerminal des SGN mit Glutamatrezeptoren9. Bei der Cochlea-Schalltransduktion führt die Ablenkung des Haarzellbündels zu einer IHC-Depolarisation, die zu einer Glutamatfreisetzung von IHCs auf die postsynaptischen affetischen Klemmen führt und so den Gehörweg aktiviert. Die Aktivierung dieses Weges führt zur Umwandlung schallinduzierter mechanischer Signale in einen Ratencode in der SGN10. Tatsächlich ist die IHC-Bandsynapse hochspezialisiert für unermüdliche Schallübertragung mit Raten von Hunderten von Hertz mit hoher zeitlicher Präzision und ist von entscheidender Bedeutung für präsynaptische Mechanismen der Klangcodierung. Frühere Studien haben gezeigt, dass Bandsynapsen stark in Größe und Anzahl in verschiedenen Frequenzregionen in der erwachsenen Maus Cochlea11,12, wahrscheinlich reflektieren strukturelle Anpassung an die besondere Klangkodierung für Überlebensbedürfnisse. In jüngster Zeit haben experimentelle Tierstudien gezeigt, dass die Cochlea-Synaptopathie zu mehreren Formen von Hörstörungen beiträgt, einschließlich lärmbedingter Hörverluste, altersbedingter Hörverlust und erblichem Hörverlust13, 14. So wurden Methoden zur Identifizierung korrelierter Veränderungen der synaptischen Anzahl, Struktur und Funktion in bestimmten Frequenzregionen zunehmend in Studien zur auditiven Entwicklung und Der Inneren Ohrenkrankheit eingesetzt, indem Modelle verwendet wurden, die über experimentelle Manipulation von genetischen oder Umweltvariablen15,16,17.
Im aktuellen Bericht stellen wir ein Protokoll zur Analyse der synaptischen Anzahl, Struktur und Funktion in einem bestimmten Frequenzbereich der Basilarmembran bei erwachsenen Mäusen vor. Die Cochlea-Frequenzlokalisierung wird mit einer bestimmten Orts-Frequenz-Karte in Kombination mit einem Cochleogramm durchgeführt. Die normalen morphologischen Eigenschaften von Cochlea-Band-Synapsen werden mittels präsynaptischer und postsynaptischer Immunostainierung bewertet. Der Funktionszustand von Cochlea-Band-Synapsen wird anhand der suprathresholdamplituden der ABR-Welle I bestimmt. Bei geringfügigen Änderungen kann dieses Protokoll verwendet werden, um physiologische oder pathologische Bedingungen in anderen Tiermodellen, einschließlich Ratten, Meerschweinchen und Keimen, zu untersuchen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:828px;" width="828">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ketamine hydrochloride</td>
			<td style="width:304px;">Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China</td>
			<td style="width:141px;">H35020148</td>
			<td style="width:167px;">100mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>X-1251</td>
			<td>10mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TDT physiology apparatus</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA</td>
			<td colspan="2">Auditory Physiology System III</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SigGen/BioSig software</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA</td>
			<td colspan="2">Auditory Physiology System III</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electric Pad</td>
			<td>Pet Fun</td>
			<td>11072931136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps 3#</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada</td>
			<td>0203-3-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps 5#</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada</td>
			<td>0209-5-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereo dissection microscope</td>
			<td>Nikon Corp., Tokyo, Japan</td>
			<td>SMZ1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat serum</td>
			<td>ZSGB-BIO, Beijing,China</td>
			<td>ZLI-9021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4</td>
			<td>Millipore Corp., Billerica, MA, USA</td>
			<td>MAB397</td>
			<td>mouse&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified Mouse Anti-CtBP2</td>
			<td>BD Biosciences, Billerica, MA, USA</td>
			<td>612044</td>
			<td>mouse&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>A21124</td>
			<td>goat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>A21131</td>
			<td>goat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting medium containing DAPI</td>
			<td>ZSGB-BIO, Beijing,China</td>
			<td>ZLI-9557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal fluorescent microscopy</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>TCS SP8 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image Pro Plus software</td>
			<td>Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA</td>
			<td>version 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Professional diagnostic pocket otoscope</td>
			<td>Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,China</td>
			<td>HS-OT10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle electrode</td>
			<td>Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi&#39;an,China</td>
			<td>1029</td>
			<td>20 mm, 28 G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Closed-field speaker</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA</td>
			<td>CF1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea

Cochlea-Innenhaarzellen (IHCs) übertragen akustische Signale über Bandsynapsen an Spiralganglionneuronen (SGNs). Mehrere experimentelle Studien haben gezeigt, dass Haarzellsynapsen die ersten Ziele bei sensorineuralem Hörverlust (SNHL) sein können. Solche Studien haben das Konzept der Cochlea "Synaptopathie" vorgeschlagen, die sich auf Veränderungen der Bandsynapse Zahl, Struktur oder Funktion, die in abnormale synaptische Übertragung zwischen IHCs und SGNs führen bezieht. Während Cochlea-Synaptopathie irreversibel ist, wirkt sie sich nicht auf die Hörschwelle aus. In lärminduzierten Versuchsmodellen wird eine eingeschränkte Schädigung von IHC-Synapsen in ausgewählten Frequenzregionen eingesetzt, um die Umweltfaktoren zu identifizieren, die speziell Synaptopathie verursachen, sowie die physiologischen Folgen der Störung dieses Innenohrs. bahn. Hier stellen wir ein Protokoll zur Analyse der synaptischen Morphologie und Funktion der Cochlea-Synaptik bei erwachsenen Mäusen vor. In diesem Protokoll wird die Cochlea-Lokalisierung bestimmter Frequenzregionen mittels Ortsfrequenzkarten in Verbindung mit Cochleogramm-Daten durchgeführt, woraufhin die morphologischen Eigenschaften von Bandsynapsen mittels synaptischer Immunostaining. Der Funktionelle Status von Bandsynapsen wird dann auf der Grundlage der Amplituden der auditiven Brainstem Response (ABR) Welle I bestimmt. Der vorliegende Bericht zeigt, dass dieser Ansatz genutzt werden kann, um unser Verständnis der Pathogenese und Mechanismen der synaptischen Dysfunktion in der Cochlea zu vertiefen, die bei der Entwicklung neuartiger therapeutischer Interventionen helfen können.

ABR-Hörtests wurden an 10 C57BL/6J-Mäusen (8 Wochen alt) unter Anästhesie durchgeführt. ABRs wurden mit Tonburstreizen bei 4, 8, 16, 32 und 48 kHz ausgelöst. Die Hörschwelle jedes Tieres wurde visuell durch die Unterscheidung von mindestens einer klaren Wellenform im ABR festgestellt. Alle Mäuse wiesen ABR-Schwellenwerte als Reaktion auf Tonausbrüche auf, die je nach Frequenz des Stimulus zwischen 25 und 70 dB SPL lagen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Hörschwelle mit 16 kHz am niedrigsten war (<strong class...

Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea at JoVE.com

Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

Dieses Manuskript beschreibt ein experimentelles Protokoll zur Bewertung der morphologischen Eigenschaften und des Funktionellen Status von Bandsynapsen bei normalen Mäusen. Das vorliegende Modell eignet sich auch für lärminduzierte und altersbedingte Cochlea-Synaptopathie-eingeschränkte Modelle. Die korrelativen Ergebnisse früherer Mausstudien werden ebenfalls diskutiert.

Morphologische und funktionelle Bewertung von Bandsynapsen an bestimmten Frequenzregionen der Maus cochlea

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

Der primäre Bericht ist wirklich betonen Wichtig, die spezifische Frequenzregion der Basilarmembran in den meisten Modellen genau zu lokalisieren, wo Synapsenzahlen verändert und Funktion analysiert werden kann. Die Cochlea-Lokalisierung der spezifischen Frequenzbereiche erfolgt zuverlässig mit Frequenzkarten in Verbindung mit Cochleogramm-Daten. Das Mikroskop gibt Einblick in mehrere Forschungsstudien.Es unterstützt die Vorstellung, dass die Cochlea-Neuropathie die primären Anfangsereignisse ist, die speziell vor Hörverlust, Tinnitus und Hyperacusis stehen. Nach der Bestätigung einer mangelnden Reaktion auf Zehenkneifen in einem anästhesierten acht Wochen alten Erwachsenen C57 schwarz 6J männliche Maus. Platzieren Sie die Maus auf einem 37 Grad Celsius-Heizkissen in einem elektrisch und akustisch abgeschirmten Raum.Als nächstes legen Sie eine subdermale 20 Millimeter 28 Gauge Nadel AufnahmeElektrode, mit der Tiefe von drei Millimetern unter der Haut an der Scheitelpunkt des Schädels. Eine Referenzelektrode im ipsilateralen Ohrspeicheldrüsenbereich, unterhalb der Pinna des gemessenen Ohrs und einer Bodenelektrode im kontralateralen Ohrspeicheldrüsenbereich. Legen Sie einen geschlossenen Feldlautsprecher mit einem zwei Zentimeter großen Kunststoffrohr mit einer kegelförmigen Spitze neben die Maus und passen Sie die Spitze in den äußeren Gehörgang.Für eine auditive Brainstem-Reaktion, oder ABR-Aufnahme, erzeugen Tonpips bei abnehmenden Schalldruckpegeln von 90 bis 10 Dezibel, in fünf bis 10 Dezibel Schalldruckpegelschritten. Während dieses Schritts werden die Antworten verstärkt, gefiltert und gemittelt. Bestimmen Sie bei jeder Frequenz den ABR-Schwellenwert, d. h. den minimalen Schalldruckpegel, der zu einer zuverlässigen ABR-Aufnahme mit einer oder mehreren unterscheidbaren Wellen führt, die durch visuelle Inspektion eindeutig identifiziert werden können.Nach der ABR-Aufnahme die Bulla von der ventralen Seite aussetzen und die Bulla mit einer scharfen Schere öffnen, um Zugang zur Cochlea zu erhalten. Entfernen Sie mit feinen Zangen die zeitlichen Knochen und trennen Sie die Schlagschlagsader. Entfernen Sie dann die Bänder aus dem ovalen Fenster und brechen Sie die runde Fenstermembran.Drehen Sie die Spitze einer 13-Millimeter-27-Messnadel vorsichtig, um ein kleines Loch an der Spitze der Cochlea zu bilden, bevor Sie mit einer fein gekippten Pipette 4% Paraformaldehyd sanft durch das Fenster in die perilymphatischen Räume spülen. Als nächstes spülen Sie die Knochen dreimal für fünf Minuten pro Wäsche mit kalt frischen 0,1 Molaren PBS pro Wäsche. Gefolgt von der Entkalkung der Knochen mit 10%EDTA für vier Stunden bei Raumtemperatur und 20 Umdrehungen pro Minute auf einem horizontalen Shaker.Übertragen Sie am Ende der Inkubation einen entkalkten Temporalknochen unter einem Sezierendes Mikroskop in frische0,1 Mol-PBS. Verwenden Sie 3 und 5 Dumont Zangen und eine 27 Gauge Nadel, um die apikalen, mittleren und basalen Cochlea-Regionen nacheinander zu sezieren. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um eine kleine Reihe von Schnitten entlang des Spiralbandes zu machen und die tektoriale Membran und Reissners Membran zu entfernen.Das verbleibende auditive Epithel, einschließlich des spiralförmigen Limbus, wird weiter in einzelne Cochlea-Drehungen für ganze Mount-Präparate zerlegt. Verwenden Sie dann das 40-fache Ölobjektiv eines Lichtmikroskops, um die Basilarmembranlänge mit einer Skala von 250 Mikrometern im Augenstück zu messen. Es kann entlang der Stereocilia der inneren Haarzellen eingestellt werden.Nach der Zerlegung jede Cochlea-Drehung in einzelne 2,5 Milliliter Zentrifugenröhren geben. Blockieren Sie jede unspezifische Bindung mit 10%Ziegenserum in PBS in 0.1%Triton X-100 für eine Stunde bei Raumtemperatur auf einem Rotator. Verwenden Sie am Ende der Inkubation 200 Mikroliter Pipettenspitze, um die Lösung unter einem Seziermikroskop zu entfernen.Inkubieren Sie die Proben mit den primären Antikörpern von Interesse in 5%Ziegenserum und PBS in 0.1%Triton X-100 über Nacht bei 4 Grad Celsius auf einem Rotator verdünnt. Spülen Sie die Gewebeproben am nächsten Morgen dreimal für fünf Minuten mit kalten 0,1 Molaren PBS pro Wäsche, um alle verbleibenden primärantikörper zu entfernen. Dann beschriften Sie die Proben mit den entsprechenden Sekundärantikörpern, die in 5%Ziegenserum in PBS in 0,1%Triton X-100 verdünnt sind, für zwei bis drei Stunden bei Raumtemperatur am Rotator, geschützt vor Licht.Waschen Sie die Proben am Ende der Inkubation dreimal mit 0,1 Mol-PBS, wie gezeigt, und übertragen Sie die Proben in einzelne 35-Millimeter-Platten mit 0,1 Mol-PBS. Legen Sie einen Tropfen DAPI-Ergänzungsmontagemedium auf den Schlitten und übertragen Sie die Proben von PBS auf das Montagemedium. Legen Sie eine Kante eines Deckels auf jeden Schlitten und lösen Sie, damit die Abdeckungsrutschen sanft fallen.Dann trocknen Sie die Rutschen in einer Rutschenbox bei vier Grad Celsius über Nacht. Um die Proben abzubilden, verwenden Sie ein konfokales Mikroskop mit den entsprechenden Lasern und 63X hochauflösende Öl-Tauchlinse, um acht Mikrometer konfokale Z-Stacks aus jeder Cochlea-Drehung zu erfassen. Für synaptische Punktzeichen, stellen Sie die Z-Stacks mit der 0,3 Mikrometer Schrittgröße, um die gesamte Länge der inneren Haarzellen zu überspannen, um zu versichern, dass alle synaptischen Puncta abgebildet werden können und die Punktzeichen mit Bildern in einem Z-Stack zusammenführen, um die Z-Zugriffsprojektion zu erhalten.Importieren Sie die zusammengeführten Bilder in ein entsprechendes Bildverarbeitungssoftwareprogramm. Teilen Sie die synaptischen Gesamtanzahl in jedem Z-Stack in bestimmten Frequenzbereichen durch die Anzahl der DAPI-positiven inneren Haarzellen, um die Anzahl der synaptischen Punktzeichen für jede Zelle zu berechnen. In jedem bestimmten Frequenzbereich durchschnittlich alle synaptischen Puncta in drei Bildern von verschiedenen mikroskopischen Feldern, die neun bis elf innere Haarzellen enthalten.Um die zytoskelettale Architektur und die synaptische Lokalisation besser zu visualisieren, verwenden Sie das Pinselwerkzeug, um die synaptische Struktur und Verteilung der einzelnen inneren Haarzellen visuell zu bewerten. Um die Gegenüberstellung von präsynaptischen Bändern und postsynaptischen Rezeptor-Patches zu inspizieren, verwenden Sie das rechteckige Festzeltwerkzeug, extrahieren Sie den Voxelraum um die Bänder und verwenden Sie das Bildschneiden, um die einzelnen Bänder zu isolieren. Klicken Sie dann auf Bild und Bildgröße, um ein Miniaturarray dieser Miniaturprojektionen zu erhalten, mit denen gekoppelte Synapsen im Vergleich zu verwaisten Multibändern identifiziert werden können.Alle zehn Mäuse in diesem repräsentativen Experiment wiesen ABR-Schwellenwerte als Reaktion auf Tonausbrüche zwischen 25 und 70 Dezibel pro Schalldruckpegel in Abhängigkeit von der Frequenz des Stimulus auf. Die Hörschwelle für dieses Experiment war mit 16 Kilohertz am niedrigsten, was einem Abstand von etwa 43 % zum Cochlea-Spitzenwert entspricht, was darauf hindeutet, dass die akustische Empfindlichkeit in anderen Cochlea-Regionen signifikant reduziert wird. Ganze Halterungen des auditiven Epithels werden in drei Teile zerlegt und die Längen werden gemessen und in ihren prozentualen Abstand von der Cochlea-Spitze umgewandelt.Die Frequenzposition auf der Basilarmembran jeder Cochlea-Drehung wird mit hilfe der logarithmischen Funktion berechnet. In normalen Ohren von erwachsenen Mäusen zeigt die Immunfärbung nebeneinander einander gegenübergestellte Paare von synaptischen Bändern und Glutamatrezeptor-Pflastern. Untersuchung der Oberfläche der basolateralen Membran der inneren Haarzellen mit acht bis 20 Paaren pro Zelle.Obwohl die überwiegende Mehrheit der Punktzeichen als nebeneinander gestellte Paare in normalen Ohren erscheinen, werden verwaiste Bänder selten bei hohen Vergrößerungen beobachtet. Die Anzahl der inneren Haarzellbandsynapsen ist am höchsten in der 16-Kilohertz-Region und nimmt mit zunehmender Entfernung von dieser Position deutlich ab. Das Wichtigste, was man sich bei diesem Eingriff merken sollte, ist, dass man die Integrität der Cochlea-Basalmembran garantieren muss.Wir müssen die Genauigkeit betonen, bis die technischen Fähigkeiten erreicht sind. Nach diesem Verfahren kann die Gentherapie durchgeführt werden, um zu beantworten, ob die Cochlea-Neuropathie durch diese Maßnahme repariert werden kann. Diese Maßnahme ist eine breitere Technik zur Erforschung der Cochlea-Neuropathie, die, wenn die primären Anfangsereignisse mit Hörverlust, Tinnitus und Hyperacusis in Verbindung gebracht werden.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Neuroscience

Unit 1

The Special Senses

SCIENTISTS IN ACTION

Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse

Postsynaptische Recordings am afferenten Dendriten Kontaktaufnahme mit Cochlear inneren Haarzellen: Monitoring multivesikulären Veröffentlichung in einem Ribbon Synapse

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Zerebrovaskuläre Casting der erwachsenen Maus für 3D-Imaging und morphologische Analyse

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase-Aktivität in den verschiedenen Regionen der Maus Gehirn: Nicht-radioaktive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP)-Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

Funktionellen und morphologischen Bewertung der Membran Innervation durch phrenicus Motoneuronen

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Hochauflösende Quantitative Immungold-Analyse von Membranrezeptoren auf der Netzhaut Ribbon Synapsen

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Ganze Berge Dissection und Immunfluoreszenz der erwachsenen Maus Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Schnelle und spezifische Immunomagnetic Isolierung der Maus primären Oligodendrozyten

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Funktionsauswertung olfaktorische Wege im Leben Xenopus Kaulquappen

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex-Vivo Bildgebung von zellspezifische Kalzium Signalisierung an den dreigliedrigen Synapse der Maus Membran

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Stimulus-specific Cortical Visual Evoked Potential Morphological Patterns

Stimulusspezifische cortical Visual Evokierte potenzielle morphologische Muster

This paper presents a methodology for the recording and analysis of cortical visual evoked potentials (CVEPs) in response to various visual stimuli using ...