Name: morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea
Uploaded: 2019-05-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81770997, 81771016, 81830030); פרויקט המימון המשותף של קרן בייג למדעי הטבע וועדת החינוך של בייג (KZ201810025040); הקרן למדעי הטבע של בייג (7174291); ואת הקרן למדע פוסט-דוקטורט (2016M601067).

כל ההליכים בוצעו בהתאם NRC/ILAR מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (8 ה Edition). פרוטוקול המחקר אושר על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועדת השימוש של האוניברסיטה הרפואית ההון, בייג, סין.
1. בחירת חיות
<ol><li>לכל הניסויים, השתמשו בעכבר זכר מבוגר C57BL/6J (בן 8 שבועות) כמודל החי. הערה: C57BL/...

<ol>
	<li>Lie, A., Skogstad, M., Johnsen, T. S., Engdahl, B., Tambs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+notched+audiograms+in+a+cross-sectional+study+of+12,055+railway+workers.">The prevalence of notched audiograms in a cross-sectional study of 12,055 railway workers.</a> Ear and Hearing. 36 (3), 86-92 (2015).</li><li>Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+transduction,+tuning,+and+synaptic+transmission+in+the+mammalian+cochlea.">Hair cell transduction, tuning, and synaptic transmission in the mammalian cochlea.</a> Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).</li><li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cochlear+frequency+map+for+the+cat:+labeling+auditory-nerve+fibers+of+known+characteristic+frequency.">The cochlear frequency map for the cat: labeling auditory-nerve fibers of known characteristic frequency.</a> Journal of the Acoustical Society of America. 72 (5), 1441-1449 (1982).</li><li>Fettiplace, R., Kim, K. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+mechanoelectrical+transduction+channels+in+hearing.">The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing.</a> Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).</li><li>Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiological+place-frequency+map+of+the+cochlea+in+the+CBA/J+mouse.">A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse.</a> Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).</li><li>Viberg, A., Canlon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+guide+to+plotting+a+cochleogram.">The guide to plotting a cochleogram.</a> Hearing Research. 197 (1-2), 1-10 (2004).</li><li>Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+exposure+modulates+cochlear+inner+hair+cell+ribbon+volumes,+correlating+with+changes+in+auditory+measures+in+the+FVB/nJ+mouse.">Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse.</a> Scientific Reports. 6, 25056 (2016).</li><li>Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+after+noise+exposure:+acceleration+of+cochlear+synaptopathy+in+"recovered"+ears.">Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears.</a> Journal of Neuroscience. 35 (19), 7509-7520 (2015).</li><li>Wichmann, C., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+structure+and+function+of+inner+hair+cell+ribbon+synapses.">Relating structure and function of inner hair cell ribbon synapses.</a> Cell and Tissue Research. 361 (1), 95-114 (2015).</li><li>Matthews, G., Fuchs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+roles+of+ribbon+synapses+in+sensory+neurotransmission.">The diverse roles of ribbon synapses in sensory neurotransmission.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 812-822 (2010).</li><li>Liberman, L. D., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+maturation+of+auditory-nerve+heterogeneity,+as+seen+in+spatial+gradients+of+synapse+morphology+in+the+inner+hair+cell+area.">Postnatal maturation of auditory-nerve heterogeneity, as seen in spatial gradients of synapse morphology in the inner hair cell area.</a> Hearing Research. 339, 12-22 (2016).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximal+number+of+pre-synaptic+ribbons+are+formed+in+cochlear+region+corresponding+to+middle+frequency+in+mice.">Maximal number of pre-synaptic ribbons are formed in cochlear region corresponding to middle frequency in mice.</a> Acta Oto-Laryngologica. 138 (1), 25-30 (2018).</li><li>Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+synaptopathy+in+acquired+sensorineural+hearing+loss:+Manifestations+and+mechanisms.">Cochlear synaptopathy in acquired sensorineural hearing loss: Manifestations and mechanisms.</a> Hearing Research. 349, 138-147 (2017).</li><li>Moser, T., Starr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+neuropathy--neural+and+synaptic+mechanisms.">Auditory neuropathy--neural and synaptic mechanisms.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (3), 135-149 (2016).</li><li>Yu, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Gata3-Mafb+transcriptional+network+directs+post-synaptic+differentiation+in+synapses+specialized+for+hearing.">A Gata3-Mafb transcriptional network directs post-synaptic differentiation in synapses specialized for hearing.</a> Elife. 2, 01341 (2013).</li><li>Buniello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wbp2+is+required+for+normal+glutamatergic+synapses+in+the+cochlea+and+is+crucial+for+hearing.">Wbp2 is required for normal glutamatergic synapses in the cochlea and is crucial for hearing.</a> EMBO Molecular Medicine. 8 (3), 191-207 (2016).</li><li>Gilels, F., Paquette, S. T., Beaulac, H. J., Bullen, A., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+hearing+loss+and+outer+hair+cell+death+in+homozygous+Foxo3+knockout+mice+after+moderate+noise+exposure.">Severe hearing loss and outer hair cell death in homozygous Foxo3 knockout mice after moderate noise exposure.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1054 (2017).</li><li>Kane, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+effects+on+age-related+hearing+loss+associated+with+Cdh23+variants+in+mice.">Genetic background effects on age-related hearing loss associated with Cdh23 variants in mice.</a> Hearing Research. 283 (1-2), 80-88 (2012).</li><li>Jiang, X. W., Li, X. R., Zhang, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+of+ribbon+synapses+number+of+cochlear+hair+cells+in+C57BL/6J+mice+with+age+(Delta).">Changes of ribbon synapses number of cochlear hair cells in C57BL/6J mice with age (Delta).</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (10), 19058-19064 (2015).</li><li>Akil, O., Oursler, A., Fan, K., Lustig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+auditory+brainstem+response+testing.">Mouse auditory brainstem response testing.</a> BIO-Protocol. 6 (6), (2016).</li><li>Zhou, X., Jen, P. H. -. S., Seburn, K. L., Frankel, W. N., Zheng, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+brainstem+responses+in+10+inbred+strains+of+mice.">Auditory brainstem responses in 10 inbred strains of mice.</a> Brain Research. 1091 (1), 16-26 (2006).</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+dissection+and+immunofluorescence+of+the+adult+mouse+cochlea.">Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).</li><li>Schmitz, F., Konigstorfer, A., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIBEYE,+a+component+of+synaptic+ribbons:+a+protein's+journey+through+evolution+provides+insight+into+synaptic+ribbon+function.">RIBEYE, a component of synaptic ribbons: a protein's journey through evolution provides insight into synaptic ribbon function.</a> Neuron. 28 (3), 857-872 (2000).</li><li>Suzuki, J., Corfas, G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round-window+delivery+of+neurotrophin+3+regenerates+cochlear+synapses+after+acoustic+overexposure.">Round-window delivery of neurotrophin 3 regenerates cochlear synapses after acoustic overexposure.</a> Scientific Reports. 6, 24907 (2016).</li><li>Rutherford, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+structure+of+inner+ear+ribbon+synapses+with+STED+microscopy.">Resolving the structure of inner ear ribbon synapses with STED microscopy.</a> Synapse. 69 (5), 242-255 (2015).</li><li>Liberman, L. D., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+cochlear+synaptopathy+after+acoustic+overexposure.">Dynamics of cochlear synaptopathy after acoustic overexposure.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 16 (2), 205-219 (2015).</li><li>Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+Foxo3+causes+adult+onset+auditory+neuropathy+and+alters+cochlear+synapse+architecture+in+mice.">Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice.</a> Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).</li><li>Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin-3+regulates+ribbon+synapse+density+in+the+cochlea+and+induces+synapse+regeneration+after+acoustic+trauma.">Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+cochlear+synaptopathy:+an+early-onset+contributor+to+auditory+functional+decline.">Age-related cochlear synaptopathy: an early-onset contributor to auditory functional decline.</a> Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).</li><li>Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+cochlear+neuropathy+is+selective+for+fibers+with+low+spontaneous+rates.">Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).</li><li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adding+insult+to+injury:+cochlear+nerve+degeneration+after+"temporary"+noise-induced+hearing+loss.">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss.</a> Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li><li>Valero, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+cochlear+synaptopathy+in+rhesus+monkeys+(Macaca+mulatta).">Noise-induced cochlear synaptopathy in rhesus monkeys (Macaca mulatta).</a> Hearing Research. 353, 213-223 (2017).</li><li>Viana, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+neuropathy+in+human+presbycusis:+Confocal+analysis+of+hidden+hearing+loss+in+post-mortem+tissue.">Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue.</a> Hearing Research. 327, 78-88 (2015).</li><li>Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerated+synapses+between+postnatal+hair+cells+and+auditory+neurons.">Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (3), 321-329 (2013).</li><li>Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+murine+cochlear+explant+technique+as+an+in+vitro+screening+tool+in+hearing+research.">Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).</li><li>Takeda, S., Mannstr&#246;m, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Aging+and+Noise+Exposure+on+Auditory+Brainstem+Responses+and+Number+of+Presynaptic+Ribbons+in+Inner+Hair+Cells+of+C57BL/6J+Mice.">Effects of Aging and Noise Exposure on Auditory Brainstem Responses and Number of Presynaptic Ribbons in Inner Hair Cells of C57BL/6J Mice.</a> Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).</li><li>Mehraei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+brainstem+response+latency+in+noise+as+a+marker+of+cochlear+synaptopathy.">Auditory brainstem response latency in noise as a marker of cochlear synaptopathy.</a> Journal of Neuroscience. 36 (13), 3755-3764 (2016).</li></ol>

מאז synaptopathy שבלול התאפיין לראשונה בעכברים למבוגרים עם שינוי סף זמני (TTS) המושרה על ידי 8 \ u201216 kHz הלהקה רעש ב 100 dB SPL עבור 2 h31, חוקרים חקרו יותר ויותר את ההשפעות של synaptopathy במגוון יונקים, כולל קופים ובני אדם32,33. בנוסף לחשיפה רעש, מספר תנאים אחרים המשויכ?...

תדרים בטווח של כ 20 \ u201220, 000 הרץ ניתן להיתפס כגירויים שמיעתי על ידי בני אדם. השמיעה האנושית היא בדרך כלל רגיש ביותר בקרבת 1,000 Hz, שבו רמת הלחץ הממוצע הקול הוא 20 μPa במבוגרים צעירים (כלומר, 0 דציבלים של רמת לחץ קול [dB SPL]). בכמה מצבים פתולוגיים, אובדן שמיעה מוגבל לתדרים ספציפיים. לדוגמה, בשלבים המוקדמים של אובדן שמיעה המושרה רעש (NIHL), "חריץ" (כלומר, שמיעה העלאת הסף) ניתן לצפות audiogram ב 4 kHz1. לאורך מחיצת שבלול היונקים, ההדרגתיות של נוקשות והמסה לייצר מפת תדר מעריכי, עם זיהוי צליל בתדר גבוה בבסיס של שבלול ואיתור תדר נמוך בקודקוד2. אכן, יש מפה בתדר המקום שבלול לאורך קרום בזיאר, המוביל מה שמכונה tonotopic הארגון2,3. כל מקום נתון על קרום בזיאר יש את הרגישות הגבוהה ביותר רק אחד תדר צליל מסוים, אשר מכונים בדרך כלל את התדר האופייני3,4, למרות התגובות תדרים אחרים ניתן גם לצפות.
עד כה, מודלים של עכברים שונים המועסקים לחקור פונקציה נורמלית, תהליכים פתולוגיים, ויעילות טיפולית במערכת השמיעה. ידע מדויק של הפרמטרים הפיזיולוגיים של שבלול העכבר הוא תנאי מוקדם עבור מחקרים כאלה של אובדן שמיעה. שבלול העכבר מחולק אנטומית לתוך הפונה הבסיס, באמצע, ו בסיס, המתאימות אזורי תדר שונים. על-ידי תיוג עצבי שמיעתי בתוך הגרעין שבלול לנתח אתרים המתאימים שלהם אינבציה היקפית ב שבלול, מולר ואח ' הצליח להקים את מפת תדר שבלול המקום בעכבר רגיל ב vivo5. במרווח של 7.2 – 61.8 kHz, אשר מתאים למיקומים בין 90% ו 10% מהאורך המלא של קרום בזיאר, העכבר שבלול מקום המפה תדר ניתן לתאר על ידי פונקציה רגרסיה פשוטה ליניארית, מציע קשר בין ה מרחק מנורמל מבסיס שבלול והלוגריתם של התדר האופייני5. בעכברי מעבדה, מפת תדר המקום ניתן להשתמש כדי לחקור את הקשר בין סף שמיעה בתוך טווחי תדרים ספציפיים ושבלול מראה את המספרים של תאי שיער חסרים באזורים יחסיים לאורך קרום בזיאר6. חשוב להניח, מפת תדר המקום מספקת מערכת מיקום לחקירה של נזק מבני מינימלי, כגון נזק הסינפסות רצועת הכלים של תאי השיער במקומות ספציפיים תדר שבלול בעכברים עם טראומה שמיעתי היקפית7 ,8.
ב שבלול היונקים, הסינפסות של הסרט מורכבת מסרט טרום סינפטיות, הקרנה צפופה באלקטרון המההילה הילה של שלפוחיות סינפטית מוכנות שחרור המכיל גלוטמט בתוך ה-IHC, ודחיסות פוסט-סינפטית במסוף העצבים של SGN עם קולטני גלוטמט9. במהלך התמרה צליל שבלול, הטיה של החבילה של תא השיער התוצאות ב-IHC depolarization, אשר מוביל גלוטמט לשחרר מ-Ihc אל המסופים הפוסט-סינפטיות, ובכך הפעלת מסלול השמיעה. הפעלת מסלול זה מובילה לטרנספורמציה של אותות מכניים המושרה הקול לתוך קוד תעריף ב-SGN10. אכן, הסרט ה-IHC סינפסה מתמחה במיוחד לשידורי צליל בשיעור של מאות הרץ עם דיוק גבוה בזמן, והוא בעל חשיבות קריטית למנגנון טרום-סינפטית של קידוד קול. מחקרים קודמים גילו כי הסינפסות הסרט להשתנות מאוד בגודל ומספר באזורים תדירות שונים בעכבר למבוגרים שבלול11,12, כנראה המשקף הסתגלות מבנית קידוד צליל מסוים עבור צרכי הישרדות. לאחרונה, ניסויים בבעלי חיים ניסיוניים הוכיחו כי synaptopathy שבלול תורמת לצורות מרובות של ליקויי שמיעה, כולל אובדן שמיעה המושרה רעש, הקשורות לגיל אובדן שמיעה, ואובדן שמיעה תורשתי13, 14. לפיכך, שיטות לזיהוי שינויים בקורלציה במספר סינפטית, מבנה ותפקוד באזורי תדר ספציפיים המועסקים יותר ויותר במחקרים של פיתוח שמיעה ומחלת האוזן הפנימית, באמצעות מודלים שנוצרו באמצעות מניפולציה ניסויית של משתנים גנטיים או סביבתיים15,16,17.
בדוח הנוכחי, אנו מציגים פרוטוקול לניתוח מספר סינפטית, מבנה, ותפקוד באזור תדר מסוים של קרום בזיאר בעכברים למבוגרים. לוקליזציה של תדר שבלול מבוצעת באמצעות מפת תדר מקום נתון בשילוב עם cochleogram. מאפיינים נורמליים מורפולוגית של הסינפסות בסרט שבלול מוערכים באמצעות מערכת החיסונית הפוסט-סינפטית. הסטטוס הפונקציונלי של הסינפסות סרט שבלול נקבע על בסיס המוני suprathreshold של גל ABR I. באמצעות שינויים קלים, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לבחון תנאים פיזיולוגיים או פתולוגיים במודלים של בעלי חיים אחרים, כולל חולדות, שרקנים, וגרבילים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:828px;" width="828">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ketamine hydrochloride</td>
			<td style="width:304px;">Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China</td>
			<td style="width:141px;">H35020148</td>
			<td style="width:167px;">100mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>X-1251</td>
			<td>10mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TDT physiology apparatus</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA</td>
			<td colspan="2">Auditory Physiology System III</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SigGen/BioSig software</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA</td>
			<td colspan="2">Auditory Physiology System III</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electric Pad</td>
			<td>Pet Fun</td>
			<td>11072931136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps 3#</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada</td>
			<td>0203-3-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps 5#</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada</td>
			<td>0209-5-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereo dissection microscope</td>
			<td>Nikon Corp., Tokyo, Japan</td>
			<td>SMZ1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat serum</td>
			<td>ZSGB-BIO, Beijing,China</td>
			<td>ZLI-9021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4</td>
			<td>Millipore Corp., Billerica, MA, USA</td>
			<td>MAB397</td>
			<td>mouse&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified Mouse Anti-CtBP2</td>
			<td>BD Biosciences, Billerica, MA, USA</td>
			<td>612044</td>
			<td>mouse&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>A21124</td>
			<td>goat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>A21131</td>
			<td>goat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting medium containing DAPI</td>
			<td>ZSGB-BIO, Beijing,China</td>
			<td>ZLI-9557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal fluorescent microscopy</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>TCS SP8 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image Pro Plus software</td>
			<td>Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA</td>
			<td>version 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Professional diagnostic pocket otoscope</td>
			<td>Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,China</td>
			<td>HS-OT10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle electrode</td>
			<td>Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi&#39;an,China</td>
			<td>1029</td>
			<td>20 mm, 28 G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Closed-field speaker</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA</td>
			<td>CF1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea

שבלול תאים שיער פנימי (IHCs) לשדר אותות אקוסטיים לולייניות גנגליון נוירונים (SGNs) דרך הסינפסות רצועת הכלים. מספר מחקרים ניסיוניים הראו כי הסינפסות תא השיער עשוי להיות המטרות הראשוניות באובדן שמיעה sensorineural (SNHL). מחקרים כאלה הציעו את המושג של שבלול "synaptopathy", אשר מתייחס שינויים מספר סינפסה בסרט, מבנה, או פונקציה שתוצאתה שידור סינפטית נורמלי בין IHCs ו SGNs. בעוד synaptopathy שבלול הוא בלתי הפיך, זה לא משפיע על סף השמיעה. במודלים ניסיוניים המושרה ברעש, נזק מוגבל לסינפסות IHC באזורי תדר נבחרים מועסק כדי לזהות את הגורמים הסביבתיים הגורמים במיוחד לsynaptopathy, כמו גם להשלכות הפיזיולוגיות של הפרעה לאוזן הפנימית הזו מעגל. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לניתוח מורפולוגיה סינפטית שבלול ותפקוד באזור תדר ספציפי בעכברים למבוגרים. בפרוטוקול זה, לוקליזציה של שבלול של אזורים בתדר ספציפי מבוצעת באמצעות מפות מקום תדר בשילוב עם נתונים cochleogram, בעקבות המאפיינים מורפולוגית של סינפסות הסרט מוערכים באמצעות סינפטית חיסוני. הסטטוס התפקודי של הסינפסות ברצועת הכלים נקבע לאחר מכן על בסיס המוני של תגובת המוח השמיעה (ABR) גל I. הדו ח הנוכחי ממחיש כי גישה זו יכולה לשמש כדי להעמיק את ההבנה שלנו של הפתוגנזה ומנגנונים של תפקוד סינפטית ב שבלול, אשר עשוי לסייע בפיתוח התערבויות טיפוליות הרומן.

ABR בדיקות שמיעה בוצעו עבור 10 C57BL/6J עכברים (8 שבועות של גיל) תחת הרדמה. ABRs היתה היתה באמצעות גירויים פרץ טון ב 4, 8, 16, 32, ו 48 kHz. סף השמיעה של כל חיה זוהה באופן חזותי על ידי הבחנה לפחות אחת צורת גל ברורה ב ABR. כל העכברים הציגו ספי ABR בתגובה התפרצויות טון, נע בין 25 ו 70 dB SPL בהתאם לתדירות של הגירוי. התוצאות ...

Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea at JoVE.com

Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

כתב יד זה מתאר פרוטוקול ניסיוני להערכת מאפיינים מורפולוגיים ומעמד פונקציונלי של הסינפסות של רצועת הכלים בעכברים נורמליים. המודל הנוכחי מתאים גם לרעש המושרה והקשורות לגיל synaptopathy מודלים מוגבלים. גם התוצאות של לימודי העכבר הקודמים נדונו.

מורפולוגית ופונקציונלית הערכה של הסרט סינפסות בתדר ספציפי אזורים של העכבר שבלול

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

הדו"ח העיקרי הוא באמת להדגיש את החשיבות של איתור מדויק של אזור התדירות הספציפית של קרום הבזיליקום ברוב המודלים, שבו מספרי הסינפסה השתנו ותפקוד ניתן לנתח. לוקליזציה שברוך של אזורי התדרים הספציפיים מבוצעת באופן אמין באמצעות, למקם מפות תדירות בשילוב עם נתוני שבך. המיקרוסקופ מספק תובנה למספר מחקרים.זה תומך ברעיון כי נוירופתיה שברוך הוא האירועים הראשוניים העיקריים במיוחד לפני אובדן שמיעה, טינטון, hyperacusis. לאחר שאישר חוסר תגובה לצביטת בוהן בעכבר מבוגר מבוגר בן שמונה שבועות C57 שחור 6J. מניחים את העכבר על כרית חום של 37 מעלות צלזיוס בחדר מוגן חשמלית ואקוסטית.לאחר מכן, מניחים תת עורי 20 מילימטר 28 מד מחט הקלטת אלקטרודה, עם עומק של שלושה מילימטרים מתחת לעור בקודקוד של הגולגולת. אלקטרודה התייחסות באזור parotid ipsilateral, מתחת לפינה של האוזן נמדד אלקטרודה הקרקע באזור פרוטיד contralateral. מניחים רמקול שדה סגור המצויד בצינור פלסטיק באורך שני ס"מ עם קצה בצורת חרוט ליד העכבר ומתאימים את הקצה לתעלת האוזן החיצונית.עבור תגובת גזע מוח שמיעתי, או הקלטת ABR, ליצור פיפס צליל בהפחתת רמות לחץ הקול מ 90 עד 10 דציבלים, ב 5 עד 10 צעדים ברמת לחץ קול דציבלים. במהלך שלב זה, התגובות מוגברות, מסוננים וממוצעים. בכל תדר, לקבוע את סף ABR, שהוא רמת לחץ הקול המינימלי שתוותה הקלטת ABR אמינה עם גל אחד או יותר להבחין שניתן לזהות בבירור על ידי בדיקה חזותית.לאחר הקלטת ABR, לחשוף את הבולה מהצד הגחון ולפתוח את הבולה עם מספריים חדים כדי לקבל גישה cochlea. באמצעות מטלפים עדין, להסיר את עצמות הזמן ולנתק את עורק stapes. לאחר מכן הסר את stapes מהחלון הסגלגל ולקרוע את קרום החלון העגול.סובב בעדינות את קצה מחט מד 13 מילימטר 27 כדי לעשות חור קטן על פסוק של cochlea, לפני השימוש פיפטה הטה בסדר לשטוף בעדינות 4% paraformaldehyde דרך החלון לתוך החללים perilymphatic. לאחר מכן, לשטוף את העצמות שלוש פעמים במשך חמש דקות לכל לשטוף עם קר טרי 0.1 PBS טוחן לכל לשטוף. ואחריו מדבקה של העצמות עם 10% EDTA במשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר ו 20 סיבובים לדקה על שייקר אופקי.בסוף הדגירה, מעבירים עצם זמנית מדבקת ל-PBS רענן 0.1 טוחן תחת מיקרוסקופ ניתוח. השתמש 3 ו 5 מדפים Dumont ומחט מד 27 לנתח את אזורי שבלול אפי, אמצע, ובזלת בתורו. השתמש בסכין גילוח כדי לבצע סדרה קטנה של חתכים לאורך הרצועה הספירלית ולהסיר קרום tectorial ואת הממברנה של רייסנר.עוד לנתח את האפיתל השמיעתי הנותר, כולל לימבוס ספירלי, לתוך שרוך בודדים פונה להכנות הר שלם. לאחר מכן השתמש במטרה שמן 40X של מיקרוסקופ אור כדי למדוד את אורך קרום הבזיליקום עם סולם 250 מיקרומטר ממוקם בחתיכת העין. זה יכול להיות מותאם לאורך stereocilia של תאי השיער הפנימיים.לאחר הניתוח, מניחים כל שרוך הופכים לצינורות צנטריפוגה בודדים של 2.5 מיליליטר. חסום כל כריכה לא ספציפית עם סרום עיזים 10% ב- PBS ב- 0.1% טריטון X-100 למשך שעה בטמפרטורת החדר על מסובב. בסוף הדגירה, השתמש 200 טיפ פיפטה microliter כדי להסיר את הפתרון תחת מיקרוסקופ ניתוח.הדגירה את הדגימות עם הנוגדנים העיקריים של עניין מדולל 5% סרום עזים PBS ב 0.1% טריטון X-100 לילה ב 4 מעלות צלזיוס על מסובב. למחרת בבוקר, לשטוף את דגימות הרקמה שלוש פעמים במשך חמש דקות עם קר 0.1 PBS טוחן לכל לשטוף כדי להסיר כל נוגדן ראשוני שיורית. לאחר מכן תייג את הדגימות בנוגדנים המשניים המתאימים מדוללים בסרום עיזים 5% ב- PBS ב- 0.1% טריטון X-100 למשך שעתיים עד שלוש שעות בטמפרטורת החדר על המסובב, מוגן מפני אור.בסוף הדגירה, לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם 0.1 PBS טוחן כפי שהוכח ולהעביר את הדגימות לתוך צלחות בודדות 35 מילימטר המכיל 0.1 PBS טוחן. מקם טיפה של אמצעי הרכבה בתוספת DAPI על השקופית והעבר את הדגימות מ- PBS למדיום ההרכבה. מניחים קצה אחד של החלקת כיסוי על כל שקופית ומשחררים כדי לאפשר לתלשולי הכיסוי ליפול בעדינות.ואז לייבש את השקופיות בתיבת שקופיות בארבע מעלות צלזיוס לילה. כדי לדמיין את הדגימות, השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי עם הלייזרים המתאימים ועדשת טבילת שמן ברזולוציה גבוהה פי 63 כדי לרכוש שמונה ערימות קונפוקל Z מיקרומטר מכל סיבוב בשבך. לספירת נקודות סינפטית, קבעו את ערימות ה-Z בגודל של 0.3 מיקרומטר כדי להתפרס על כל אורך תאי השיער הפנימיים, וערכו את כל הנקב הסינפטי שניתן יהיה לדמיין ולמזג את הנקב המכיל תמונות בערימה Z כדי לקבל את הקרנת הגישה Z.יבא את התמונות הממוזגות לתוכנה מתאימה לעיבוד תמונה. חלק את הספירות הכוללות הסינפטיות בכל מחסנית Z באזורי תדירות ספציפיים במספר תאי השיער הפנימיים החיוביים של DAPI כדי לחשב את מספר הנקב הסינפטי עבור כל תא. בכל אזור תדר ספציפי, ממוצע כל puncta סינפטית בשלוש תמונות של שדות מיקרוסקופיים שונים, המכיל תשעה עד 11 תאי שיער פנימיים.כדי להמחיש טוב יותר את הארכיטקטורה הציטוסקלטלית ואת לוקליזציה סינפטית, השתמש בכלי המברשת כדי להעריך באופן חזותי את המבנה הסינפטי ואת ההפצה של תאי השיער הפנימיים הבודדים. כדי לבדוק את ההקפדה על סרטים פרה-סינפטיים ותיקונים של קולטן פוסט-סינפטי, השתמש בכלי כתובית מלבנית כדי לחלץ את שטח הווקסל סביב הסרטים ולהשתמש בחיתוך תמונות כדי לבודד את הסרטים הבודדים. לאחר מכן לחץ על גודל תמונה ותמונה כדי לרכוש מערך תמונות ממוזערות של הקרנות זעירות אלה שניתן להשתמש בהן כדי לזהות סינפסות משוכות לעומת סרטים יתומים.כל עשרת העכברים בניסוי מייצג זה הציגו סף ABR בתגובה להתפרצויות טון הנעות בין 25 ל -70 דציבלים לכל רמת לחץ קול בהתאם לתדירות הגירוי. סף השמיעה לניסוי זה היה הנמוך ביותר ב 16 קילוהרץ המתאים כ 43% מהמרחק מן הצוק שבך, מה שמרמז כי הרגישות האקוסטית מופחתת באופן משמעותי באזורים שבקלים אחרים. הרכבים שלמים של האפיתל השמיעתי נותאו לשלושה חלקים והאורך נמדד ומומר למרחק האחוזים שלהם מהפסגת ברכיכה.מיקום התדר על קרום הבזיליקום של כל סיבוב בשבך מחושב באמצעות פונקציה לוגריתמית. באוזניים רגילות של עכברים בוגרים, immunostaining מגלה זוגות בשילוב של סרטים סינפטיים ותאי קולטן גלוטמט. לימוד פני השטח של קרום הבזלת של תאי השיער הפנימיים, עם שמונה עד 20 זוגות לכל תא.למרות שהרוב המכריע של הפנצטה מופיעים כזוגות בשילוב באוזניים רגילות, סרטים יתומים נצפים לעתים רחוקות בהגדלות גבוהות. מספר הסינפסות הפנימיות של רצועת הכלים של תאי השיער הוא הגבוה ביותר באזור 16 קילוהרץ ומצטמצם באופן משמעותי ככל שההרחקה ממיקום זה גדלה. הדבר החשוב ביותר לזכור במהלך הליך זה הוא כי יש להבטיח את השלמות של קרום בזל שבליל.אנחנו צריכים להדגיש את הדיוק עד מיומנות טכנית הוא הגיע. בעקבות הליך זה, הריפוי הגנטי יכול להתבצע כדי לענות אם נוירופתיה cochlear ניתן לתקן על ידי מדד זה. מדד זה הוא טכניקה רחבה יותר לחקר נוירופתיה שבשבך, אשר אם האירועים הראשוניים העיקריים לקשר עם אובדן שמיעה, טינטון, hyperacusis.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Neuroscience

Unit 1

The Special Senses

SCIENTISTS IN ACTION

Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse

הקלטות Postsynaptic ב דנדריטים מביא פנייה שבלול תאים שיער פנימית: שחרור Multivesicular ניטור ב סינפסה סרט

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the ...

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

יציקה של כלי דם במוח העכבר למבוגרים הדמיה 3D ו ניתוח מורפולוגי

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

פעילות telomerase באזורים שונים של מוח עכבר: הטלומרז לא רדיואקטיבי חזור הגברה פרוטוקול Assay (TRAP)

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

הערכה תפקודית ומורפולוגי של סרעפת עצבוב על ידי סרעפת מנוע נוירונים

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

ניתוח ברזולוציה גבוהה כמותי immunogold של קולטני קרום ב סינפסות רצועת הכלים רשתית

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

ההר שלם Dissection וImmunofluorescence של מבוגרי עכבר השבלול

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

בידוד Immunomagnetic מהירה, מדויקת של העכבר הראשי oligodendrocytes להפוך

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

הערכה תפקודית של חוש הריח מסלולים ב ראשנים של צפרדע רפואית חי

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

לשעבר Vivo הדמיה של סידן לתא ספציפי איתות על הסינפסה התלת-צדדי של הסרעפת העכבר

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Stimulus-specific Cortical Visual Evoked Potential Morphological Patterns

גירוי מדויק של קליפת העין הקורטיקלית פוטנציאל מורפולוגיים

This paper presents a methodology for the recording and analysis of cortical visual evoked potentials (CVEPs) in response to various visual stimuli using ...