Name: morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea
Uploaded: 2019-05-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (81770997, 81771016, 81830030); il progetto di finanziamento congiunto della Beijing Natural Science Foundation e del Beijing Education Committee (K-201810025040); la Beijing Natural Science Foundation (7174291); e la China Postdoctoral Science Foundation (2016M601067).

Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con la Guida NRC/ILAR per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (ottava edizione). Il protocollo di studio è stato approvato dal Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università di Medicina Capitale, Pechino, Cina.
1. Selezione degli animali
<ol><li>Per tutti gli esperimenti, utilizzare topi maschi adulti C57BL/6J (8 settimane) come modello animale. NOT:</</c0> I topi C57BL/6J che trasportano una variante d...

<ol>
	<li>Lie, A., Skogstad, M., Johnsen, T. S., Engdahl, B., Tambs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+notched+audiograms+in+a+cross-sectional+study+of+12,055+railway+workers.">The prevalence of notched audiograms in a cross-sectional study of 12,055 railway workers.</a> Ear and Hearing. 36 (3), 86-92 (2015).</li><li>Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+transduction,+tuning,+and+synaptic+transmission+in+the+mammalian+cochlea.">Hair cell transduction, tuning, and synaptic transmission in the mammalian cochlea.</a> Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).</li><li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cochlear+frequency+map+for+the+cat:+labeling+auditory-nerve+fibers+of+known+characteristic+frequency.">The cochlear frequency map for the cat: labeling auditory-nerve fibers of known characteristic frequency.</a> Journal of the Acoustical Society of America. 72 (5), 1441-1449 (1982).</li><li>Fettiplace, R., Kim, K. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+mechanoelectrical+transduction+channels+in+hearing.">The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing.</a> Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).</li><li>Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiological+place-frequency+map+of+the+cochlea+in+the+CBA/J+mouse.">A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse.</a> Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).</li><li>Viberg, A., Canlon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+guide+to+plotting+a+cochleogram.">The guide to plotting a cochleogram.</a> Hearing Research. 197 (1-2), 1-10 (2004).</li><li>Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+exposure+modulates+cochlear+inner+hair+cell+ribbon+volumes,+correlating+with+changes+in+auditory+measures+in+the+FVB/nJ+mouse.">Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse.</a> Scientific Reports. 6, 25056 (2016).</li><li>Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+after+noise+exposure:+acceleration+of+cochlear+synaptopathy+in+"recovered"+ears.">Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears.</a> Journal of Neuroscience. 35 (19), 7509-7520 (2015).</li><li>Wichmann, C., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+structure+and+function+of+inner+hair+cell+ribbon+synapses.">Relating structure and function of inner hair cell ribbon synapses.</a> Cell and Tissue Research. 361 (1), 95-114 (2015).</li><li>Matthews, G., Fuchs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+roles+of+ribbon+synapses+in+sensory+neurotransmission.">The diverse roles of ribbon synapses in sensory neurotransmission.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 812-822 (2010).</li><li>Liberman, L. D., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+maturation+of+auditory-nerve+heterogeneity,+as+seen+in+spatial+gradients+of+synapse+morphology+in+the+inner+hair+cell+area.">Postnatal maturation of auditory-nerve heterogeneity, as seen in spatial gradients of synapse morphology in the inner hair cell area.</a> Hearing Research. 339, 12-22 (2016).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximal+number+of+pre-synaptic+ribbons+are+formed+in+cochlear+region+corresponding+to+middle+frequency+in+mice.">Maximal number of pre-synaptic ribbons are formed in cochlear region corresponding to middle frequency in mice.</a> Acta Oto-Laryngologica. 138 (1), 25-30 (2018).</li><li>Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+synaptopathy+in+acquired+sensorineural+hearing+loss:+Manifestations+and+mechanisms.">Cochlear synaptopathy in acquired sensorineural hearing loss: Manifestations and mechanisms.</a> Hearing Research. 349, 138-147 (2017).</li><li>Moser, T., Starr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+neuropathy--neural+and+synaptic+mechanisms.">Auditory neuropathy--neural and synaptic mechanisms.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (3), 135-149 (2016).</li><li>Yu, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Gata3-Mafb+transcriptional+network+directs+post-synaptic+differentiation+in+synapses+specialized+for+hearing.">A Gata3-Mafb transcriptional network directs post-synaptic differentiation in synapses specialized for hearing.</a> Elife. 2, 01341 (2013).</li><li>Buniello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wbp2+is+required+for+normal+glutamatergic+synapses+in+the+cochlea+and+is+crucial+for+hearing.">Wbp2 is required for normal glutamatergic synapses in the cochlea and is crucial for hearing.</a> EMBO Molecular Medicine. 8 (3), 191-207 (2016).</li><li>Gilels, F., Paquette, S. T., Beaulac, H. J., Bullen, A., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+hearing+loss+and+outer+hair+cell+death+in+homozygous+Foxo3+knockout+mice+after+moderate+noise+exposure.">Severe hearing loss and outer hair cell death in homozygous Foxo3 knockout mice after moderate noise exposure.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1054 (2017).</li><li>Kane, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+effects+on+age-related+hearing+loss+associated+with+Cdh23+variants+in+mice.">Genetic background effects on age-related hearing loss associated with Cdh23 variants in mice.</a> Hearing Research. 283 (1-2), 80-88 (2012).</li><li>Jiang, X. W., Li, X. R., Zhang, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+of+ribbon+synapses+number+of+cochlear+hair+cells+in+C57BL/6J+mice+with+age+(Delta).">Changes of ribbon synapses number of cochlear hair cells in C57BL/6J mice with age (Delta).</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (10), 19058-19064 (2015).</li><li>Akil, O., Oursler, A., Fan, K., Lustig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+auditory+brainstem+response+testing.">Mouse auditory brainstem response testing.</a> BIO-Protocol. 6 (6), (2016).</li><li>Zhou, X., Jen, P. H. -. S., Seburn, K. L., Frankel, W. N., Zheng, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+brainstem+responses+in+10+inbred+strains+of+mice.">Auditory brainstem responses in 10 inbred strains of mice.</a> Brain Research. 1091 (1), 16-26 (2006).</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+dissection+and+immunofluorescence+of+the+adult+mouse+cochlea.">Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).</li><li>Schmitz, F., Konigstorfer, A., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIBEYE,+a+component+of+synaptic+ribbons:+a+protein's+journey+through+evolution+provides+insight+into+synaptic+ribbon+function.">RIBEYE, a component of synaptic ribbons: a protein's journey through evolution provides insight into synaptic ribbon function.</a> Neuron. 28 (3), 857-872 (2000).</li><li>Suzuki, J., Corfas, G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round-window+delivery+of+neurotrophin+3+regenerates+cochlear+synapses+after+acoustic+overexposure.">Round-window delivery of neurotrophin 3 regenerates cochlear synapses after acoustic overexposure.</a> Scientific Reports. 6, 24907 (2016).</li><li>Rutherford, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+structure+of+inner+ear+ribbon+synapses+with+STED+microscopy.">Resolving the structure of inner ear ribbon synapses with STED microscopy.</a> Synapse. 69 (5), 242-255 (2015).</li><li>Liberman, L. D., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+cochlear+synaptopathy+after+acoustic+overexposure.">Dynamics of cochlear synaptopathy after acoustic overexposure.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 16 (2), 205-219 (2015).</li><li>Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+Foxo3+causes+adult+onset+auditory+neuropathy+and+alters+cochlear+synapse+architecture+in+mice.">Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice.</a> Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).</li><li>Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin-3+regulates+ribbon+synapse+density+in+the+cochlea+and+induces+synapse+regeneration+after+acoustic+trauma.">Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+cochlear+synaptopathy:+an+early-onset+contributor+to+auditory+functional+decline.">Age-related cochlear synaptopathy: an early-onset contributor to auditory functional decline.</a> Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).</li><li>Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+cochlear+neuropathy+is+selective+for+fibers+with+low+spontaneous+rates.">Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).</li><li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adding+insult+to+injury:+cochlear+nerve+degeneration+after+"temporary"+noise-induced+hearing+loss.">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss.</a> Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li><li>Valero, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+cochlear+synaptopathy+in+rhesus+monkeys+(Macaca+mulatta).">Noise-induced cochlear synaptopathy in rhesus monkeys (Macaca mulatta).</a> Hearing Research. 353, 213-223 (2017).</li><li>Viana, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+neuropathy+in+human+presbycusis:+Confocal+analysis+of+hidden+hearing+loss+in+post-mortem+tissue.">Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue.</a> Hearing Research. 327, 78-88 (2015).</li><li>Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerated+synapses+between+postnatal+hair+cells+and+auditory+neurons.">Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (3), 321-329 (2013).</li><li>Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+murine+cochlear+explant+technique+as+an+in+vitro+screening+tool+in+hearing+research.">Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).</li><li>Takeda, S., Mannstr&#246;m, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Aging+and+Noise+Exposure+on+Auditory+Brainstem+Responses+and+Number+of+Presynaptic+Ribbons+in+Inner+Hair+Cells+of+C57BL/6J+Mice.">Effects of Aging and Noise Exposure on Auditory Brainstem Responses and Number of Presynaptic Ribbons in Inner Hair Cells of C57BL/6J Mice.</a> Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).</li><li>Mehraei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+brainstem+response+latency+in+noise+as+a+marker+of+cochlear+synaptopathy.">Auditory brainstem response latency in noise as a marker of cochlear synaptopathy.</a> Journal of Neuroscience. 36 (13), 3755-3764 (2016).</li></ol>

Dal momento che la sinaptopatia cocleare è stata caratterizzata per la prima volta in topi adulti con uno spostamento di soglia temporanea (TTS) indotto da 8-u201216 kHz rumore della banda di ottava a 100 dB SPL per 2 h31, i ricercatori hanno sempre più studiato gli effetti della sinaptopatia in vari mammiferi, comprese le scimmie e gli esseri umani32,33. Oltre all'esposizione al rumore, sono state associate diverse altre condizioni alla...

Le frequenze nell'intervallo di circa 20-u201220.000 Hz possono essere percepite come stimoli uditivi dagli esseri umani. L'udito umano è normalmente più sensibile vicino a 1.000 Hz, dove il livello medio di pressione sonora è di 20 - Pa nei giovani adulti (cioè, 0 decibel del livello di pressione sonora [dB SPL]). In alcune condizioni patologiche, la perdita dell'udito è limitata a frequenze specifiche. Ad esempio, nelle prime fasi della perdita dell'udito indotta dal rumore (NIHL), è possibile osservare una "notch" (cioè l'elevazione della soglia uditiva) nell'audiogramma a 4 kHz1. Lungo la partizione cocleare dei mammiferi, le sue gradazioni di rigidità e massa producono una mappa di frequenza esponenziale, con rilevamento del suono ad alta frequenza alla base della coclea e rilevamento a bassa frequenza all'apice2. Infatti, c'è una mappa posto-frequenza cocleare lungo la membrana basilare, che porta a quella che è conosciuta come organizzazione tonotopica2,3. Ogni dato posto sulla membrana basilare ha la più alta sensibilità ad una sola particolare frequenza sonora, che di solito è chiamata la frequenza caratteristica3,4, anche se si possono osservare anche risposte ad altre frequenze.
Fino ad oggi, sono stati impiegati vari modelli murini per studiare la normale funzione, i processi patologici e l'efficacia terapeutica nel sistema uditivo. Una conoscenza precisa dei parametri fisiologici nella coclea del topo è un prerequisito per tali studi di perdita dell'udito. La coclea del topo è anatomicamente divisa in curve apicali, medie e basali, che corrispondono a diverse regioni di frequenza. Etichettando gli afferenti del nervo uditivo presso il nucleo cocleare per analizzare i corrispondenti siti di innervazione periferica nella coclea, M'ller et al. sono riusciti a stabilire la mappa della frequenza del luogo cocleare nel normale topo5vivo . Nell'intervallo di 7,2–61,8 kHz, che corrisponde a posizioni comprese tra il 90% e il 10% dell'intera lunghezza della membrana basilare, la mappa della frequenza di posizionamento cocleare del topo può essere descritta da una semplice funzione di regressione lineare, suggerendo una relazione tra distanza normalizzata dalla base cocleare e dal logaritmo della frequenza caratteristica5. Nei topi di laboratorio, la mappa luogo-frequenza può essere utilizzata per esplorare la relazione tra soglie uditive all'interno di specifiche gamme di frequenza e cocleogrammi che mostrano il numero di cellule ciliate mancanti nelle regioni relative lungo la membrana basilare6. È importante sottolineare che la mappa luogo-frequenza fornisce un sistema di posizionamento per l'indagine di danni strutturali minimi, come danni alle sinapsi del nastro delle cellule ciliate in specifiche posizioni di frequenza cocleare nei topi con trauma uditivo periferico7 ,8.
Nella coclea mammifera, le sinapsi del nastro sono costituite da un nastro pressinaptico, una proiezione ad alta densità di elettroni che lega un alone di vesciche sinaptiche pronte per il rilascio contenenti glutammato all'interno dell'IHC e una densità post-sinaptica sul terminale nervoso del SGN con recettori del glutammato9. Durante la trasduzione del suono cocleare, la deflessione del fascio di cellule ciliate provoca la depolarizzazione dell'IHC, che porta al rilascio del glutammato dagli IHC nei terminali afferenti post-rattici, attivando così il percorso uditivo. L'attivazione di questo percorso porta alla trasformazione dei segnali meccanici indotti dal suono in un codice di tasso nel SGN10. Infatti, la sinapsi a nastro IHC è altamente specializzata per la trasmissione sonora instancabile a velocità di centinaia di Hertz con alta precisione temporale, ed è di fondamentale importanza per i meccanismi pressinaptici della codifica del suono. Studi precedenti hanno rivelato che le sinapsi del nastro variano notevolmente in dimensioni e numero in diverse regioni di frequenza nella coclea del topo adulto11,12, probabilmente riflettendo l'adattamento strutturale alla particolare codifica del suono per esigenze di sopravvivenza. Recentemente, studi sperimentali sugli animali hanno dimostrato che la sinaptopatia cocleare contribuisce a molteplici forme di ipovedenti, tra cui perdita dell'udito indotta dal rumore, perdita dell'udito legata all'età e perdita ereditaria dell'udito13, 14.Pertanto, i metodi per identificare i cambiamenti correlati nel numero, nella struttura e nella funzione sinaptica in specifiche regioni di frequenza sono stati sempre più utilizzati negli studi sullo sviluppo uditivo e sulle malattie dell'orecchio interno, utilizzando modelli generati tramite manipolazione sperimentale di variabili genetiche o ambientali15,16,17.
Nel rapporto corrente, presentiamo un protocollo per analizzare il numero sinaptico, la struttura e la funzione in una specifica regione di frequenza della membrana basilare nei topi adulti. La localizzazione della frequenza cocleare viene eseguita utilizzando una determinata mappa luogo-frequenza in combinazione con un cocleogramma. Le normali caratteristiche morfologiche delle sinapsi cocleari sono valutate tramite immunostaining presilnaptico e post-sinaptico. Lo stato funzionale delle sinapsi a nastro cocleare è determinato in base alle ampiezze soprasoglia dell'onda ABR I. Con piccole alterazioni, questo protocollo può essere utilizzato per esaminare condizioni fisiologiche o patologiche in altri modelli animali, tra cui ratti, porcellini d'India e gerbilli.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:828px;" width="828">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ketamine hydrochloride</td>
			<td style="width:304px;">Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China</td>
			<td style="width:141px;">H35020148</td>
			<td style="width:167px;">100mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>X-1251</td>
			<td>10mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TDT physiology apparatus</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA</td>
			<td colspan="2">Auditory Physiology System III</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SigGen/BioSig software</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA</td>
			<td colspan="2">Auditory Physiology System III</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electric Pad</td>
			<td>Pet Fun</td>
			<td>11072931136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps 3#</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada</td>
			<td>0203-3-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps 5#</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada</td>
			<td>0209-5-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereo dissection microscope</td>
			<td>Nikon Corp., Tokyo, Japan</td>
			<td>SMZ1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat serum</td>
			<td>ZSGB-BIO, Beijing,China</td>
			<td>ZLI-9021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4</td>
			<td>Millipore Corp., Billerica, MA, USA</td>
			<td>MAB397</td>
			<td>mouse&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified Mouse Anti-CtBP2</td>
			<td>BD Biosciences, Billerica, MA, USA</td>
			<td>612044</td>
			<td>mouse&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>A21124</td>
			<td>goat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>A21131</td>
			<td>goat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting medium containing DAPI</td>
			<td>ZSGB-BIO, Beijing,China</td>
			<td>ZLI-9557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal fluorescent microscopy</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>TCS SP8 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image Pro Plus software</td>
			<td>Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA</td>
			<td>version 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Professional diagnostic pocket otoscope</td>
			<td>Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,China</td>
			<td>HS-OT10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle electrode</td>
			<td>Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi&#39;an,China</td>
			<td>1029</td>
			<td>20 mm, 28 G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Closed-field speaker</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA</td>
			<td>CF1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea

Le cellule ciliate interne cocleari (IHC) trasmettono segnali acustici ai neuroni gangliari a spirale (SGN) attraverso le sinapsi a nastro. Diversi studi sperimentali hanno indicato che le sinapsi delle cellule dei capelli possono essere gli obiettivi iniziali nella perdita dell'udito neurosensoriale (SNHL). Tali studi hanno proposto il concetto di cocleare "sinaptopatia", che si riferisce ad alterazioni nel numero di sinapsi del nastro, struttura o funzione che si traducono in una trasmissione sinaptica anormale tra IHong e SGR. Mentre la sinaptopatia cocleare è irreversibile, non influisce sulla soglia uditiva. Nei modelli sperimentali indotti dal rumore, vengono impiegati danni limitati alle sinapsi IHC in determinate regioni di frequenza per identificare i fattori ambientali che causano specificamente la sinaptopatia, nonché le conseguenze fisiologiche di disturbare questo orecchio interno Circuito. Qui, presentiamo un protocollo per l'analisi della morfologia sinaptica cocleare e la funzione in una regione di frequenza specifica nei topi adulti. In questo protocollo, la localizzazione cocleare di specifiche aree di frequenza viene eseguita utilizzando mappe di frequenza dei luogo in combinazione con i dati del cocleare, a seguito del quale le caratteristiche morfologiche delle sinapsi del nastro vengono valutate tramite Immunostaining. Lo stato funzionale delle sinapsi del nastro viene quindi determinato in base alle ampiezze dell'onda I di risposta del tronco encefalico uditivo (ABR). La presente relazione dimostra che questo approccio può essere utilizzato per approfondire la nostra comprensione della patogenesi e dei meccanismi della disfunzione sinaptica nella coclea, che può aiutare nello sviluppo di nuovi interventi terapeutici.

I test dell'udito ABR sono stati eseguiti per 10 topi C57BL/6J (8 settimane di età) in anestesia. Gli ADR sono stati suscitati utilizzando stimoli di scoppio tono a 4, 8, 16, 32 e 48 kHz. La soglia uditiva di ogni animale è stata rilevata visivamente distinguendo almeno una chiara forma d'onda nell'ABR. Tutti i topi hanno mostrato soglie ABR in risposta a raffiche di tono, che vanno da 25 a 70 dB SPL a seconda della frequenza dello stimolo. I nostri risultati hanno indicato che la soglia uditiva era più bassa a 16 kHz...

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Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

Questo manoscritto descrive un protocollo sperimentale per valutare le caratteristiche morfologiche e lo stato funzionale delle sinapsi del nastro nei topi normali. Il modello attuale è adatto anche per modelli con sinaptopatia cocleare indotta dal rumore e legati all'età. Vengono inoltre discussi i risultati correlati dei precedenti studi sul mouse.

Valutazione morfologica e funzionale delle sinapsi del nastro nelle specifiche regioni di frequenza della Coclea del topo

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

Il rapporto primario è davvero l'importanza dello stress di localizzare accuratamente la regione di frequenza specifica della membrana basilare nella maggior parte dei modelli, dove i numeri sinapsi alterati e la funzione possono essere analizzati. La localizzazione cocleare delle regioni di frequenza specifiche viene eseguita in modo affidabile utilizzando mappe di frequenza di posizione in combinazione con i dati del cocleogramma. Il microscopio fornisce informazioni su diversi studi di ricerca.Supporta l'idea che la neuropatia cocleare sia il principale evento iniziale che precede specificamente la perdita dell'udito, l'acufene e l'iperacusia. Dopo aver confermato la mancanza di risposta al dito del piedi in un topo maschio C57 nero 6J adulto di otto settimane anestetizzato. Posizionare il mouse su un tappetino termico di 37 gradi celsius in una stanza schermata elettricamente e acusticamente.Quindi, posizionare un elettrodo di registrazione dell'ago subdermico calibro 20 millimetri 28, con la profondità di tre millimetri sotto la pelle al vertice del cranio. Un elettrodo di riferimento nella regione del parotido ipsilaterale, al di sotto dell'apice dell'orecchio misurato e un elettrodo di terra nella regione parotidica conlaterale. Posizionare un altoparlante a campo chiuso dotato di un tubo di plastica di due centimetri con una punta a forma di cono accanto al mouse e inserire la punta nel condotto uditivo esterno.Per una risposta uditivo al tronco encefalico, o registrazione ABR, generare pip di tono a livelli di pressione sonora decrescente da 90 a 10 decibel, in passaggi del livello di pressione sonora da cinque a 10 decibel. Durante questo passaggio, le risposte vengono amplificate, filtrate e mediate. Ad ogni frequenza, determinare la soglia ABR, che è il livello minimo di pressione sonora che si traduce in una registrazione ABR affidabile con una o più onde distinguibili che possono essere chiaramente identificate dall'ispezione visiva.Dopo la registrazione ABR, esporre il bulla dal lato ventrale e aprire il bulla con forbici affilate per ottenere l'accesso alla cochlea. Usando forcep fini, rimuovere le ossa temporali e retare l'arteria delle stapes. Quindi rimuovere le staffe dalla finestra ovale e rompere la membrana della finestra rotonda.Ruotare delicatamente la punta di un ago calibro 27 di 13 millimetri per fare un piccolo foro all'apice della cochlea, prima di utilizzare una pipetta a punta fine per sciacquare delicatamente la paraformaldeide del 4% attraverso la finestra negli spazi perilimphatici. Quindi, sciacquare le ossa tre volte per cinque minuti per lavaggio con PBS molare fresco freddo 0,1 per lavaggio. Seguito dalla decalcificazione delle ossa con 10%EDTA per quattro ore a temperatura ambiente e 20 rotazioni al minuto su uno shaker orizzontale.Al termine dell'incubazione, trasferire un osso temporale decalcificato in PBS molare fresco 0,1 al microscopio sezionato. Utilizzare 3 e 5 pini Dumont e un ago calibro 27 per sezionare le regioni apicali, centrali e basali della coclea a turno. Utilizzare una lama di rasoio per effettuare una piccola serie di tagli lungo il legamento a spirale e rimuovere la membrana tectoriale e la membrana di Reissner.Sezionare ulteriormente l'epitelio uditivo rimanente, incluso il limbo a spirale, in singole curve cocleari per preparati a montaggio intero. Quindi utilizzare l'obiettivo dell'olio 40X di un microscopio leggero per misurare la lunghezza della membrana basilare con scala di 250 micrometri posizionata nell'oculare. Può essere regolato lungo la stereocilia delle cellule ciliate interne.Dopo la dissezione, posizionare ogni cocleare trasformarsi in singoli tubi di centrifuga da 2,5 millilitri. Bloccare qualsiasi legame non specifico con siero di capra al 10% in PBS nello 0,1%Triton X-100 per un'ora a temperatura ambiente su un rotatore. Al termine dell'incubazione, utilizzare la punta della pipetta da 200 microliter per rimuovere la soluzione al microscopio a dissezione.Incubare i campioni con gli anticorpi primari di interesse diluiti nel siero di capra al 5% e PBS nello 0,1%Tritone X-100 durante la notte a 4 gradi Celsius su un rotatore. La mattina successiva, sciacquare i campioni di tessuto tre volte per cinque minuti con PBS molare freddo 0,1 per lavaggio per rimuovere eventuali anticorpi primari residui. Etichettare quindi i campioni con gli anticorpi secondari appropriati diluiti nel siero di capra al 5% in PBS nello 0,1%Tritone X-100 per due o tre ore a temperatura ambiente sul rotatore, protetto dalla luce.Al termine dell'incubazione, lavare i campioni tre volte con PBS molare 0,1 come dimostrato e trasferire i campioni in singole piastre da 35 millimetri contenenti 0,1 PBS molare. Posizionare una goccia di supporto di montaggio integrato DAPI sullo scivolo e trasferire i campioni dal PBS al mezzo di montaggio. Posizionare un bordo di un coperchio scivolare su ogni diapositiva e rilasciare per lasciare che il coperchio scivoli delicatamente.Quindi asciugare le diapositive in una casella di scorrimento a quattro gradi Celsius durante la notte. Per immaginire i campioni, utilizzare un microscopio confocale con i laser appropriati e l'obiettivo ad immersione dell'olio ad alta risoluzione 63X per acquisire otto pile Z confocali micrometriche da ogni giro cocleare. Per i conteggi di puncta sinaptici, impostare le pile Z con la dimensione del passo di 0,3 micrometri per coprire l'intera lunghezza delle cellule ciliate interne, assicurando che tutta la puncta sinaptica possa essere imageizzata e unire la puncta contenente immagini in una pila Z per ottenere la proiezione di accesso Z.Importare le immagini unite in un programma software di elaborazione delle immagini appropriato. Dividi i conteggi totali sinaptici in ogni pila Z in specifiche regioni di frequenza per il numero di cellule ciliate interne positive DAPI per calcolare il numero di puncta sinaptici per ogni cellula. Ad ogni specifica regione di frequenza, media tutta la puncta sinaptica in tre immagini di diversi campi microscopici, contenente da nove a 11 cellule ciliate interne.Per visualizzare meglio l'architettura citoscheletricha e la localizzazione sinaptica, utilizzare lo strumento pennello per valutare visivamente la struttura sinaptica e la distribuzione delle singole cellule ciliate interne. Per ispezionare la giustapposizione di nastri setnaptici e patch del recettore postsinaptico, utilizzare lo strumento tendone rettangolare estrarre lo spazio voxel intorno ai nastri e utilizzare il taglio delle immagini per isolare i singoli nastri. Quindi fare clic sulle dimensioni dell'immagine e dell'immagine per acquisire una matrice di miniature di queste proiezioni in miniatura che possono essere utilizzate per identificare le sinapsi accoppiate rispetto alle barre multifunzione orfane.Tutti e dieci i topi in questo esperimento rappresentativo hanno mostrato soglie ABR in risposta a raffiche di tono che vanno da 25 a 70 decibel per livello di pressione sonora a seconda della frequenza dello stimolo. La soglia uditrice per questo esperimento era più bassa a 16 kilohertz corrispondente a circa il 43% della distanza dall'apice cocleare, suggerendo che la sensibilità acustica è significativamente ridotta in altre regioni cocleari. Interi supporti dell'epitelio uditivo sono sezionati in tre pezzi e le lunghezze vengono misurate e convertite nella loro distanza percentuale dall'apice cocleare.La posizione di frequenza sulla membrana basilare di ogni giro cocleare viene calcolata utilizzando la funzione logaritmica. Nelle orecchie normali dei topi adulti, l'immunostaining rivela coppie giustapposti di nastri sinaptici e cerotti del recettore del glutammato. Studio della superficie della membrana basolaterale delle cellule ciliate interne, con da otto a 20 paia per cellula.Sebbene la stragrande maggioranza dei puncta appaia come coppie giustapposti nelle orecchie normali, i nastri orfani sono raramente osservati ad alti ingrandimenti. Il numero di sinapsi interne del nastro dei capelli è più alto nella regione di 16 kilohertz e diminuisce significativamente con l'aumentare della distanza da questa posizione. La cosa più importante da ricordare durante questa procedura è che si deve garantire l'integrità della membrana basale cocleare.Dobbiamo sottolineare l'accuratezza fino a quando non si raggiungerà la competenza tecnica. Seguendo questa procedura, la terapia genica può essere eseguita per rispondere se la neuropatia cocleare può essere riparata da questa misura. Questa misura è una tecnica più ampia per esplorare la neuropatia cocleare, che se gli eventi iniziali primari si associano ad avere perdita dell'udito, acufene e iperacusia.

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