Name: morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea
Uploaded: 2019-05-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea at JoVE.com

この研究は、中国国立自然科学財団(81770997、81771016、81830030)によって支援されました。北京自然科学財団と北京教育委員会(KZ201810025040)の共同資金プロジェクト。北京自然科学財団(7174291);。中国ポストドクター科学財団(2016M601067)。

すべての手順は、実験動物のケアと使用のためのNRC/ILARガイド(第8版)に従って行われました。研究プロトコルは、首都医科大学、北京、中国の機関動物ケアと使用委員会によって承認されました。
1. 動物の選択
<ol><li>すべての実験のために、動物モデルとして成人C57BL/6Jオスマウス(生後8週間)を使用する。 注:Cdh23のスプライス変異体を運ぶC57BL/6Jマ...

<ol>
	<li>Lie, A., Skogstad, M., Johnsen, T. S., Engdahl, B., Tambs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+notched+audiograms+in+a+cross-sectional+study+of+12,055+railway+workers.">The prevalence of notched audiograms in a cross-sectional study of 12,055 railway workers.</a> Ear and Hearing. 36 (3), 86-92 (2015).</li><li>Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+transduction,+tuning,+and+synaptic+transmission+in+the+mammalian+cochlea.">Hair cell transduction, tuning, and synaptic transmission in the mammalian cochlea.</a> Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).</li><li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cochlear+frequency+map+for+the+cat:+labeling+auditory-nerve+fibers+of+known+characteristic+frequency.">The cochlear frequency map for the cat: labeling auditory-nerve fibers of known characteristic frequency.</a> Journal of the Acoustical Society of America. 72 (5), 1441-1449 (1982).</li><li>Fettiplace, R., Kim, K. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+mechanoelectrical+transduction+channels+in+hearing.">The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing.</a> Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).</li><li>Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiological+place-frequency+map+of+the+cochlea+in+the+CBA/J+mouse.">A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse.</a> Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).</li><li>Viberg, A., Canlon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+guide+to+plotting+a+cochleogram.">The guide to plotting a cochleogram.</a> Hearing Research. 197 (1-2), 1-10 (2004).</li><li>Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+exposure+modulates+cochlear+inner+hair+cell+ribbon+volumes,+correlating+with+changes+in+auditory+measures+in+the+FVB/nJ+mouse.">Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse.</a> Scientific Reports. 6, 25056 (2016).</li><li>Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+after+noise+exposure:+acceleration+of+cochlear+synaptopathy+in+"recovered"+ears.">Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears.</a> Journal of Neuroscience. 35 (19), 7509-7520 (2015).</li><li>Wichmann, C., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+structure+and+function+of+inner+hair+cell+ribbon+synapses.">Relating structure and function of inner hair cell ribbon synapses.</a> Cell and Tissue Research. 361 (1), 95-114 (2015).</li><li>Matthews, G., Fuchs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+roles+of+ribbon+synapses+in+sensory+neurotransmission.">The diverse roles of ribbon synapses in sensory neurotransmission.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 812-822 (2010).</li><li>Liberman, L. D., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+maturation+of+auditory-nerve+heterogeneity,+as+seen+in+spatial+gradients+of+synapse+morphology+in+the+inner+hair+cell+area.">Postnatal maturation of auditory-nerve heterogeneity, as seen in spatial gradients of synapse morphology in the inner hair cell area.</a> Hearing Research. 339, 12-22 (2016).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximal+number+of+pre-synaptic+ribbons+are+formed+in+cochlear+region+corresponding+to+middle+frequency+in+mice.">Maximal number of pre-synaptic ribbons are formed in cochlear region corresponding to middle frequency in mice.</a> Acta Oto-Laryngologica. 138 (1), 25-30 (2018).</li><li>Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+synaptopathy+in+acquired+sensorineural+hearing+loss:+Manifestations+and+mechanisms.">Cochlear synaptopathy in acquired sensorineural hearing loss: Manifestations and mechanisms.</a> Hearing Research. 349, 138-147 (2017).</li><li>Moser, T., Starr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+neuropathy--neural+and+synaptic+mechanisms.">Auditory neuropathy--neural and synaptic mechanisms.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (3), 135-149 (2016).</li><li>Yu, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Gata3-Mafb+transcriptional+network+directs+post-synaptic+differentiation+in+synapses+specialized+for+hearing.">A Gata3-Mafb transcriptional network directs post-synaptic differentiation in synapses specialized for hearing.</a> Elife. 2, 01341 (2013).</li><li>Buniello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wbp2+is+required+for+normal+glutamatergic+synapses+in+the+cochlea+and+is+crucial+for+hearing.">Wbp2 is required for normal glutamatergic synapses in the cochlea and is crucial for hearing.</a> EMBO Molecular Medicine. 8 (3), 191-207 (2016).</li><li>Gilels, F., Paquette, S. T., Beaulac, H. J., Bullen, A., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+hearing+loss+and+outer+hair+cell+death+in+homozygous+Foxo3+knockout+mice+after+moderate+noise+exposure.">Severe hearing loss and outer hair cell death in homozygous Foxo3 knockout mice after moderate noise exposure.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1054 (2017).</li><li>Kane, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+effects+on+age-related+hearing+loss+associated+with+Cdh23+variants+in+mice.">Genetic background effects on age-related hearing loss associated with Cdh23 variants in mice.</a> Hearing Research. 283 (1-2), 80-88 (2012).</li><li>Jiang, X. W., Li, X. R., Zhang, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+of+ribbon+synapses+number+of+cochlear+hair+cells+in+C57BL/6J+mice+with+age+(Delta).">Changes of ribbon synapses number of cochlear hair cells in C57BL/6J mice with age (Delta).</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (10), 19058-19064 (2015).</li><li>Akil, O., Oursler, A., Fan, K., Lustig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+auditory+brainstem+response+testing.">Mouse auditory brainstem response testing.</a> BIO-Protocol. 6 (6), (2016).</li><li>Zhou, X., Jen, P. H. -. S., Seburn, K. L., Frankel, W. N., Zheng, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+brainstem+responses+in+10+inbred+strains+of+mice.">Auditory brainstem responses in 10 inbred strains of mice.</a> Brain Research. 1091 (1), 16-26 (2006).</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+dissection+and+immunofluorescence+of+the+adult+mouse+cochlea.">Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).</li><li>Schmitz, F., Konigstorfer, A., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIBEYE,+a+component+of+synaptic+ribbons:+a+protein's+journey+through+evolution+provides+insight+into+synaptic+ribbon+function.">RIBEYE, a component of synaptic ribbons: a protein's journey through evolution provides insight into synaptic ribbon function.</a> Neuron. 28 (3), 857-872 (2000).</li><li>Suzuki, J., Corfas, G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round-window+delivery+of+neurotrophin+3+regenerates+cochlear+synapses+after+acoustic+overexposure.">Round-window delivery of neurotrophin 3 regenerates cochlear synapses after acoustic overexposure.</a> Scientific Reports. 6, 24907 (2016).</li><li>Rutherford, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+structure+of+inner+ear+ribbon+synapses+with+STED+microscopy.">Resolving the structure of inner ear ribbon synapses with STED microscopy.</a> Synapse. 69 (5), 242-255 (2015).</li><li>Liberman, L. D., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+cochlear+synaptopathy+after+acoustic+overexposure.">Dynamics of cochlear synaptopathy after acoustic overexposure.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 16 (2), 205-219 (2015).</li><li>Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+Foxo3+causes+adult+onset+auditory+neuropathy+and+alters+cochlear+synapse+architecture+in+mice.">Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice.</a> Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).</li><li>Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin-3+regulates+ribbon+synapse+density+in+the+cochlea+and+induces+synapse+regeneration+after+acoustic+trauma.">Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+cochlear+synaptopathy:+an+early-onset+contributor+to+auditory+functional+decline.">Age-related cochlear synaptopathy: an early-onset contributor to auditory functional decline.</a> Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).</li><li>Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+cochlear+neuropathy+is+selective+for+fibers+with+low+spontaneous+rates.">Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).</li><li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adding+insult+to+injury:+cochlear+nerve+degeneration+after+"temporary"+noise-induced+hearing+loss.">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss.</a> Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li><li>Valero, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+cochlear+synaptopathy+in+rhesus+monkeys+(Macaca+mulatta).">Noise-induced cochlear synaptopathy in rhesus monkeys (Macaca mulatta).</a> Hearing Research. 353, 213-223 (2017).</li><li>Viana, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+neuropathy+in+human+presbycusis:+Confocal+analysis+of+hidden+hearing+loss+in+post-mortem+tissue.">Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue.</a> Hearing Research. 327, 78-88 (2015).</li><li>Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerated+synapses+between+postnatal+hair+cells+and+auditory+neurons.">Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (3), 321-329 (2013).</li><li>Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+murine+cochlear+explant+technique+as+an+in+vitro+screening+tool+in+hearing+research.">Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).</li><li>Takeda, S., Mannstr&#246;m, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Aging+and+Noise+Exposure+on+Auditory+Brainstem+Responses+and+Number+of+Presynaptic+Ribbons+in+Inner+Hair+Cells+of+C57BL/6J+Mice.">Effects of Aging and Noise Exposure on Auditory Brainstem Responses and Number of Presynaptic Ribbons in Inner Hair Cells of C57BL/6J Mice.</a> Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).</li><li>Mehraei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+brainstem+response+latency+in+noise+as+a+marker+of+cochlear+synaptopathy.">Auditory brainstem response latency in noise as a marker of cochlear synaptopathy.</a> Journal of Neuroscience. 36 (13), 3755-3764 (2016).</li></ol>

コクレアシナプトパシーは、2時間31の100 dB SPLで8\u201216 kHzオクターブ帯域ノイズによって誘発された一時的閾値シフト(TTS)を有する成体マウスで最初に特徴付けられたので、研究者は、様々なシナプトパシーの効果をますます調査してきました。サルやヒトを含む哺乳類32,33.騒音暴露に加えて、いくつかの他の条件は、他のいくつ?...

約20\u201220,000 Hzの範囲の周波数は、人間によって聴覚刺激として知覚することができる。人間の聴覚は通常、1,000 Hz付近で最も敏感であり、若年成人の平均音圧レベルは20μPa(すなわち、音圧レベル[dB SPL]の0デシベル)である。いくつかの病理学的状態では、難聴は特定の周波数に制限されます。例えば、騒音性難聴(NIHL)の初期段階では、「ノッチ」(すなわち、聴力閾値の上昇)を4kHz1のオーディオグラムで観察することができる。哺乳類の人工内来の人工内陸部に沿って、剛性と質量のグラデーションは指数関数的な周波数マップを生成し、高周波音検出を人工内陸部の基部に、頂点2で低周波検出します。確かに、基底膜に沿って内々の場所周波数マップがあり、トノトピック組織2、3として知られているものにつながる。基底膜上の各所定の場所は、通常、特性周波数3、4と呼べられている1つの特定の音周波数に対してのみ最高の感度を有するが、他の周波数に対する応答も観察することができる。
現在までに、聴覚系における正常な機能、病理学的プロセス、および治療効果を調べるには、様々なマウスモデルが用いられてきた。マウスの菌管内の生理学的パラメータの正確な知識は、難聴のこのような研究のための前提条件です。マウスのコクレアは、解剖学的に異なる周波数領域に対応する頂点、中間、基底ターンに分割されます。Müllerらは、内膜核における聴覚神経アフェントを標識して、その対応する末梢内性部位を分析することにより、生体内の通常マウスに内因性の場所周波数マップを確立することに成功した。7.2~61.8kHzの間隔で、バジラー膜の全長の90%から10%の間の位置に相当する、マウスの心状位頻度マップは、単純な線形回帰関数によって記述することができ、との関係を示唆する特徴周波数5の内陸部ベースと対数からの正規化された距離。実験室マウスでは、場所周波数マップを使用して、特定の周波数範囲内の聴覚閾値と、バジラー膜6に沿った相対領域における欠損毛細胞の数を示すコクレオグラムとの関係を調べることができる。重要なことに、場所周波数マップは、末梢聴覚外傷を有するマウスの特定の内気周波数位置における毛髪細胞のリボンシナプスへの損傷など、最小限の構造的損傷を調査するための測位システムを提供する7 、8.
哺乳類の交響合管では、リボンシナプスは、シナプス前のリボン、IHC内のグルタミン酸を含む放出準備のシナプス小胞のハローをつなぎ合う電子密度の突起、およびSGNの神経末端上のポストシナプス密度で構成されています。グルタミン酸受容体9.人工内波音伝達の間、毛細胞束のたわみはIHC脱分極を引き起こし、IHCから後のアフェレント末端へのグルタミン酸放出を引き起こし、それによって聴覚経路を活性化する。この経路の活性化は、SGN10のレートコードに音誘発機械的信号の変換につながります.確かに、IHCリボンシナプスは、高い時間精度で数百ヘルツの速度で不確定な音伝送に非常に特化しており、音符号化の前シナプス機構にとって非常に重要です。これまでの研究では、リボンシナプスは、成人マウスの異なる周波数領域でサイズと数が大きく異なることを明らかにしている11,12,特定のサウンドコーディングに構造的適応を反映する可能性が高い生存の必要性。最近、実験動物実験は、内膜シナプトパシーが、騒音性難聴、加齢性難聴、遺伝性難聴を含む複数の形態の聴覚障害に寄与することを実証している。14.従って、特定の頻度領域におけるシナプス数、構造、および機能の相関変化を同定する方法は、聴覚発達および内耳疾患の研究においてますます採用され、より生成されたモデルを用いて遺伝的または環境変数の実験的操作15,16,17.
本報告では、成体マウスにおける基底膜の特定の周波数領域におけるシナプス数、構造、機能を解析するためのプロトコルを提示する。コクレア周波数局在化は、特定の場所周波数マップを使用して、コクレオグラムと組み合わせて行われます。人工内科の正常な形態学的特徴は、シナプス前および後シナプス免疫染色によって評価される。コクレアリボンシナプスの機能状態は、ABR波Iの超閾値振幅に基づいて決定される。わずかな変更では、このプロトコルは、ラット、モルモット、および細菌を含む他の動物モデルにおける生理学的または病理学的状態を調べるために使用することができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:828px;" width="828">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ketamine hydrochloride</td>
			<td style="width:304px;">Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China</td>
			<td style="width:141px;">H35020148</td>
			<td style="width:167px;">100mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>X-1251</td>
			<td>10mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TDT physiology apparatus</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA</td>
			<td colspan="2">Auditory Physiology System III</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SigGen/BioSig software</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA</td>
			<td colspan="2">Auditory Physiology System III</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electric Pad</td>
			<td>Pet Fun</td>
			<td>11072931136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps 3#</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada</td>
			<td>0203-3-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps 5#</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada</td>
			<td>0209-5-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereo dissection microscope</td>
			<td>Nikon Corp., Tokyo, Japan</td>
			<td>SMZ1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat serum</td>
			<td>ZSGB-BIO, Beijing,China</td>
			<td>ZLI-9021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4</td>
			<td>Millipore Corp., Billerica, MA, USA</td>
			<td>MAB397</td>
			<td>mouse&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified Mouse Anti-CtBP2</td>
			<td>BD Biosciences, Billerica, MA, USA</td>
			<td>612044</td>
			<td>mouse&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>A21124</td>
			<td>goat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>A21131</td>
			<td>goat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting medium containing DAPI</td>
			<td>ZSGB-BIO, Beijing,China</td>
			<td>ZLI-9557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal fluorescent microscopy</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>TCS SP8 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image Pro Plus software</td>
			<td>Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA</td>
			<td>version 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Professional diagnostic pocket otoscope</td>
			<td>Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,China</td>
			<td>HS-OT10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle electrode</td>
			<td>Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi&#39;an,China</td>
			<td>1029</td>
			<td>20 mm, 28 G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Closed-field speaker</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA</td>
			<td>CF1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea

内毛細胞(IH)は、リボンシナプスを介してスパイラル神経節ニューロン(SNS)に音響信号を伝達します。いくつかの実験的研究は、毛髪細胞シナプスが感音難聴(SNHL)の初期ターゲットである可能性があることを示しています。このような研究は、IHCとSGN間の異常なシナプス伝達をもたらすリボンシナプス数、構造、または機能の変化を指す人工内科的な「シナプトパシー」の概念を提案している。内膜シナプトパシーは不可逆的であるが、聴覚閾値には影響しない。騒音誘発実験モデルでは、特定の周波数領域におけるIHCシナプスへの制限損傷が、シナプトパシーを特異的に引き起こす環境要因と、この内耳を乱す生理的影響を同定するために用いられる。回路。ここでは、成体マウスにおける特定の周波数領域における人工内科形態および機能を解析するためのプロトコルを提示する。このプロトコルでは、特定の周波数領域の人工的な局在化は、コクレオグラムデータと組み合わせて場所周波数マップを使用して行われ、その後、リボンシナプスの形態学的特性がシナプスを介して評価される免疫染色。リボンシナプスの機能状態は、聴覚脳幹応答(ABR)波Iの振幅に基づいて決定される。本報告は、このアプローチが、新しい治療介入の開発に役立つ可能性のある人工内接管機能不全の病因およびメカニズムに対する理解を深めるために使用できることを示している。

ABR聴力検査は、麻酔下で10匹のC57BL/6Jマウス(生後8週間)について行った。Aバーは4、8、16、32、48kHzのトーンバースト刺激を用いて引き起こされた。各動物の聴覚閾値は、ABRで少なくとも1つの明確な波形を区別することによって視覚的に検出された。すべてのマウスは、刺激の頻度に応じて25〜70 dB SPLの間のトーンバーストに応答してABR閾値を示した。その結果、聴覚閾値が16kHz(...

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Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

本原稿は、正常マウスにおけるリボンシナプスの形態学的特徴および機能状態を評価するための実験プロトコルについて説明する。本モデルは、騒音誘発および加齢性共生性シナプトパシー制限モデルにも適している。以前のマウス研究の相関結果についても議論する。

マウスコクレアの特定周波数領域におけるリボンシナプスの形態学的および機能的評価

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

第一のレポートは、シナプス数が変化し、機能を分析することができるほとんどのモデルで、バジラー膜の特定の周波数領域を正確に見つけることの本当にストレスの重要性です。特定の周波数領域の人工内在化は、コクレオグラムデータと連動して周波数マップを配置して、確実に行われる。顕微鏡は、いくつかの研究研究への洞察を提供します。人工内耳神経障害は、特に難聴、耳鳴り、および過敏症に先行する主要な初期事象であるという考えを支持する。麻酔付き8週齢の成人C57黒6Jオスマウスでつま先ピンチへの応答の欠如を確認した後。電気的に、音響的に遮蔽された部屋の37°Cのヒートパッドの上にマウスを置きます。次に、皮下20ミリメートル28ゲージ針の記録電極を、頭蓋骨の頂点の皮膚の下に3ミリメートルの深さで置きます。イプシラショナル・パローシド領域における参照電極を、対側耳膜領域における測定された耳と接地電極の下に示す。マウスの横にコーン状の先端を持つ2センチメートルのプラスチックチューブを装備した閉じたフィールドスピーカーを配置し、外耳道にチップをフィットさせます。聴覚脳幹応答、またはABR記録の場合、音圧レベルを90から10デシベルに減少させるトーンピップを5~10デシベルの音圧レベルステップで生成します。このステップでは、応答が増幅、フィルター処理、および平均化されます。各周波数で、ABRしきい値を決定し、視覚的な検査によって明確に識別できる1つ以上の識別可能な波を持つ信頼性の高いABR記録をもたらす最小の音圧レベルです。ABRの記録の後、腹側からブラを露出し、鋭いはさみでブラを開いて、コクレアにアクセスします。細かい鉗子を使用して、側頭骨を取り除き、動脈のテープを切断する。その後、楕円形の窓からテープを取り出し、丸い窓膜を破裂させます。13ミリメートル27ゲージ針の先端をそっと回転させて、内江の頂点に小さな穴を開け、細かいチップピペットを使用して窓から4%パラホルムアルデヒドをリンパ管腔に静かに洗い流します。次に、洗浄ごとに冷たい新鮮な0.1モルPBSで1回5分間骨を3回洗い流します。続いて、室温で4時間10%EDTA、水平シェーカーで毎分20回転の骨を脱灰する。インキュベーションの終了時に、解剖顕微鏡下で、デカルシウム化された側頭骨を新鮮な0.1モルPBSに移します。3 と 5 デュモン鉗子と 27 ゲージの針を使用して、補助的な、中間の、そして基底の内耳の領域を順番に解剖します。カミソリの刃を使用して、スパイラル靭帯に沿って小さな一連の切り傷を行い、テクトリアル膜とレイスナーの膜を取り除きます。さらに、スパイラルリムスを含む残りの聴覚上皮を、全体のマウント調製のために個々の人工内膜に解剖する。次に、光顕微鏡の40X油の目的を使用して、眼球に配置された250マイクロメートルスケールでバジラー膜の長さを測定します。これは、内側の毛細胞の立体に沿って調整することができます。解剖後、各人工内毛を個々の2.5ミリリットル遠心管に入れます。0.1%トリトンX-100で10%ヤギ血清をローテーターの室温で1時間ブロックします。インキュベーションの終わりに、解剖顕微鏡の下で溶液を取り除くために200マイクロリットルピペット先端を使用する。目的の一次抗体を含む試料を、5%ヤギ血清とPBSで0.1%トリトンX-100で一晩4度でローテーターでインキュベートします。翌朝、洗浄ごとに冷たい0.1モルPBSで組織サンプルを5分間3回洗い流し、残留一次抗体を除去します。次に、試料に適切な二次抗体をPBSで5%ヤギ血清に希釈し、0.1%トリトンX-100で、ローテーターの室温で2〜3時間、光から保護したラベルを付けます。インキュベーションの終わりに、サンプルを0.1モルPBSで3回洗浄し、0.1モルPBSを含む個々の35ミリメートルプレートに試料を移します。DAPIを補った取り付け媒体をスライドに一滴置き、試料をPBSから取り付け媒体に移します。カバースリップの1つの端を各スライドに置き、カバースリップが穏やかに落ちるように解放します。その後、スライドボックスのスライドを摂氏4度で一晩乾かします。標本を画像化するには、適切なレーザーと63X高解像度オイル浸漬レンズを備えた共焦点顕微鏡を使用して、各人工内線ターンから8マイクロメータ共焦点Zスタックを取得します。シナプスパンクタ数の場合、0.3マイクロメートルのステップサイズを持つZスタックを内側のヘアセルの全長にまたがるように設定し、シナプスパンクタのすべてを画像化し、Zスタック内の画像を含むパンクタをマージしてZアクセス投影を取得します。マージされたイメージを適切なイメージ処理ソフトウェア プログラムにインポートします。特定の周波数領域の各 Z スタックのシナプスの合計カウントを DAPI 正の内側のヘア セルの数で割り、各セルのシナプスパンクタの数を計算します。各特定の周波数領域で、9〜11の内側の毛細胞を含む異なる顕微鏡フィールドの3つの画像でシナプス穿刺のすべてを平均する。細胞骨格アーキテクチャとシナプスの局在をより良く視覚化するには、ブラシツールを使用して、個々の内側の毛細胞のシナプス構造と分布を視覚的に評価します。シナプス前リボンと心内受容体パッチの並置を検査するには、長方形のマーキーツールを使用して、リボンの周りのボクセル空間を抽出し、画像切断を使用して個々のリボンを分離します。次に、[イメージとイメージサイズ] をクリックして、ペアのシナプスと孤立したリボンを識別するために使用できるこれらのミニチュア投影のサムネイル配列を取得します。この代表的な実験のマウスの10匹は、刺激の頻度に応じて音圧レベルあたり25〜70デシベルのトーンバーストに応答してABR閾値を示した。この実験の聴力閾値は、人工内頂部からの距離の約43%に相当する16キロヘルツで最低であり、音響感度が他の人工内江領域で有意に低下することを示唆した。聴覚上皮の全体の台紙は3つの部分に分剖され、長さは測定され、人工内頂部からのパーセント距離に変換される。各人工内膜ターンのバジル膜上の周波数位置は対数関数を用いて計算される。成体マウスの正常な耳では、免疫染色はシナプスリボンとグルタミン酸受容体パッチの並置ペアを明らかにする。細胞の内側のバソアテラ膜の表面を、細胞あたり8〜20組で研究する。パンクタの大部分は正常な耳に並置されたペアとして見えますが、孤児のリボンは高倍率で観察される頻度は低くなります。内側のヘアセルリボンシナプスの数は、16キロヘルツ領域で最も多く、この場所からの距離が増加するにつれて大幅に減少します。この手順の間に覚えておかなければならない最も重要なことは、人工内膜の基礎膜の完全性を保証しなければならないということです。技術的な熟練度に達するまで、正確性を強調する必要があります。この手順に従って、遺伝子治療は、この尺度によって人工内痛神経障害を修復できるかどうかに答えるために行うことができる。この尺度は、人工内耳神経障害を探索するためのより広い技術であり、主要な初期事象が難聴、耳鳴り、および過敏症を有することに関連する場合である。

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Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse

蝸牛内有毛細胞に接触求心性樹状突起でのシナプス後録音：リボンシナプスでのモニタリングの多胞体のリリース

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the ...

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

3Dイメージングと形態素解析のための成体マウスの脳血管キャスティング

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

マウス脳のさまざまな領域におけるテロメラーゼ活性：非放射性テロメラーゼリピート増幅プロトコル（TRAP）アッセイ

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

横隔運動ニューロンによってダイヤフラム神経支配の機能的および形態学的評価

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

網膜リボンシナプスにおける膜受容体の高分解能定量的イムノゴールド分析

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

成体マウス蝸牛のホールマウント解剖および免疫蛍光

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

マウスの主なオリゴデンドロ サイトの特異的・迅速免疫分離

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

生きているアフリカツメガエルのオタマジャクシ嗅覚経路の機能評価

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivoセル固有カルシウム マウス ダイヤフラムの三者のシナプスでシグナル伝達のイメージング

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Stimulus-specific Cortical Visual Evoked Potential Morphological Patterns

刺激特異的皮質視覚誘発潜在的形態パターン

This paper presents a methodology for the recording and analysis of cortical visual evoked potentials (CVEPs) in response to various visual stimuli using ...