Name: morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea
Uploaded: 2019-05-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation i Kina (81770997, 81771016, 81830030); felles finansieringen prosjektet av Beijing Natural Science Foundation og Beijing Education Committee (KZ201810025040); Beijing Natural Science Foundation (7174291); og Kina postdoktor Science Foundation (2016M601067).

Alle prosedyrer ble utført i samsvar med NRC/lignende guide for Stell og bruk av Laboratoriedyr (8th Edition). Studien protokollen ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee of Capital Medical University, Beijing, Kina.
1. Animal utvalg
<ol><li>For alle eksperimenter, bruk voksen C57BL/6J mannlige mus (8 uker gammel) som dyret modellen. Merk: C57BL/6J mus bærer en skjøte variant av Cdh23 utstillingen akselerert senescence i hørselssystemet,...

<ol>
	<li>Lie, A., Skogstad, M., Johnsen, T. S., Engdahl, B., Tambs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+notched+audiograms+in+a+cross-sectional+study+of+12,055+railway+workers.">The prevalence of notched audiograms in a cross-sectional study of 12,055 railway workers.</a> Ear and Hearing. 36 (3), 86-92 (2015).</li><li>Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+transduction,+tuning,+and+synaptic+transmission+in+the+mammalian+cochlea.">Hair cell transduction, tuning, and synaptic transmission in the mammalian cochlea.</a> Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).</li><li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cochlear+frequency+map+for+the+cat:+labeling+auditory-nerve+fibers+of+known+characteristic+frequency.">The cochlear frequency map for the cat: labeling auditory-nerve fibers of known characteristic frequency.</a> Journal of the Acoustical Society of America. 72 (5), 1441-1449 (1982).</li><li>Fettiplace, R., Kim, K. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+mechanoelectrical+transduction+channels+in+hearing.">The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing.</a> Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).</li><li>Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiological+place-frequency+map+of+the+cochlea+in+the+CBA/J+mouse.">A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse.</a> Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).</li><li>Viberg, A., Canlon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+guide+to+plotting+a+cochleogram.">The guide to plotting a cochleogram.</a> Hearing Research. 197 (1-2), 1-10 (2004).</li><li>Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+exposure+modulates+cochlear+inner+hair+cell+ribbon+volumes,+correlating+with+changes+in+auditory+measures+in+the+FVB/nJ+mouse.">Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse.</a> Scientific Reports. 6, 25056 (2016).</li><li>Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+after+noise+exposure:+acceleration+of+cochlear+synaptopathy+in+"recovered"+ears.">Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears.</a> Journal of Neuroscience. 35 (19), 7509-7520 (2015).</li><li>Wichmann, C., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+structure+and+function+of+inner+hair+cell+ribbon+synapses.">Relating structure and function of inner hair cell ribbon synapses.</a> Cell and Tissue Research. 361 (1), 95-114 (2015).</li><li>Matthews, G., Fuchs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+roles+of+ribbon+synapses+in+sensory+neurotransmission.">The diverse roles of ribbon synapses in sensory neurotransmission.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 812-822 (2010).</li><li>Liberman, L. D., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+maturation+of+auditory-nerve+heterogeneity,+as+seen+in+spatial+gradients+of+synapse+morphology+in+the+inner+hair+cell+area.">Postnatal maturation of auditory-nerve heterogeneity, as seen in spatial gradients of synapse morphology in the inner hair cell area.</a> Hearing Research. 339, 12-22 (2016).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximal+number+of+pre-synaptic+ribbons+are+formed+in+cochlear+region+corresponding+to+middle+frequency+in+mice.">Maximal number of pre-synaptic ribbons are formed in cochlear region corresponding to middle frequency in mice.</a> Acta Oto-Laryngologica. 138 (1), 25-30 (2018).</li><li>Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+synaptopathy+in+acquired+sensorineural+hearing+loss:+Manifestations+and+mechanisms.">Cochlear synaptopathy in acquired sensorineural hearing loss: Manifestations and mechanisms.</a> Hearing Research. 349, 138-147 (2017).</li><li>Moser, T., Starr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+neuropathy--neural+and+synaptic+mechanisms.">Auditory neuropathy--neural and synaptic mechanisms.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (3), 135-149 (2016).</li><li>Yu, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Gata3-Mafb+transcriptional+network+directs+post-synaptic+differentiation+in+synapses+specialized+for+hearing.">A Gata3-Mafb transcriptional network directs post-synaptic differentiation in synapses specialized for hearing.</a> Elife. 2, 01341 (2013).</li><li>Buniello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wbp2+is+required+for+normal+glutamatergic+synapses+in+the+cochlea+and+is+crucial+for+hearing.">Wbp2 is required for normal glutamatergic synapses in the cochlea and is crucial for hearing.</a> EMBO Molecular Medicine. 8 (3), 191-207 (2016).</li><li>Gilels, F., Paquette, S. T., Beaulac, H. J., Bullen, A., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+hearing+loss+and+outer+hair+cell+death+in+homozygous+Foxo3+knockout+mice+after+moderate+noise+exposure.">Severe hearing loss and outer hair cell death in homozygous Foxo3 knockout mice after moderate noise exposure.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1054 (2017).</li><li>Kane, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+effects+on+age-related+hearing+loss+associated+with+Cdh23+variants+in+mice.">Genetic background effects on age-related hearing loss associated with Cdh23 variants in mice.</a> Hearing Research. 283 (1-2), 80-88 (2012).</li><li>Jiang, X. W., Li, X. R., Zhang, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+of+ribbon+synapses+number+of+cochlear+hair+cells+in+C57BL/6J+mice+with+age+(Delta).">Changes of ribbon synapses number of cochlear hair cells in C57BL/6J mice with age (Delta).</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (10), 19058-19064 (2015).</li><li>Akil, O., Oursler, A., Fan, K., Lustig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+auditory+brainstem+response+testing.">Mouse auditory brainstem response testing.</a> BIO-Protocol. 6 (6), (2016).</li><li>Zhou, X., Jen, P. H. -. S., Seburn, K. L., Frankel, W. N., Zheng, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+brainstem+responses+in+10+inbred+strains+of+mice.">Auditory brainstem responses in 10 inbred strains of mice.</a> Brain Research. 1091 (1), 16-26 (2006).</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+dissection+and+immunofluorescence+of+the+adult+mouse+cochlea.">Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).</li><li>Schmitz, F., Konigstorfer, A., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIBEYE,+a+component+of+synaptic+ribbons:+a+protein's+journey+through+evolution+provides+insight+into+synaptic+ribbon+function.">RIBEYE, a component of synaptic ribbons: a protein's journey through evolution provides insight into synaptic ribbon function.</a> Neuron. 28 (3), 857-872 (2000).</li><li>Suzuki, J., Corfas, G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round-window+delivery+of+neurotrophin+3+regenerates+cochlear+synapses+after+acoustic+overexposure.">Round-window delivery of neurotrophin 3 regenerates cochlear synapses after acoustic overexposure.</a> Scientific Reports. 6, 24907 (2016).</li><li>Rutherford, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+structure+of+inner+ear+ribbon+synapses+with+STED+microscopy.">Resolving the structure of inner ear ribbon synapses with STED microscopy.</a> Synapse. 69 (5), 242-255 (2015).</li><li>Liberman, L. D., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+cochlear+synaptopathy+after+acoustic+overexposure.">Dynamics of cochlear synaptopathy after acoustic overexposure.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 16 (2), 205-219 (2015).</li><li>Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+Foxo3+causes+adult+onset+auditory+neuropathy+and+alters+cochlear+synapse+architecture+in+mice.">Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice.</a> Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).</li><li>Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin-3+regulates+ribbon+synapse+density+in+the+cochlea+and+induces+synapse+regeneration+after+acoustic+trauma.">Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+cochlear+synaptopathy:+an+early-onset+contributor+to+auditory+functional+decline.">Age-related cochlear synaptopathy: an early-onset contributor to auditory functional decline.</a> Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).</li><li>Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+cochlear+neuropathy+is+selective+for+fibers+with+low+spontaneous+rates.">Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).</li><li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adding+insult+to+injury:+cochlear+nerve+degeneration+after+"temporary"+noise-induced+hearing+loss.">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss.</a> Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li><li>Valero, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+cochlear+synaptopathy+in+rhesus+monkeys+(Macaca+mulatta).">Noise-induced cochlear synaptopathy in rhesus monkeys (Macaca mulatta).</a> Hearing Research. 353, 213-223 (2017).</li><li>Viana, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+neuropathy+in+human+presbycusis:+Confocal+analysis+of+hidden+hearing+loss+in+post-mortem+tissue.">Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue.</a> Hearing Research. 327, 78-88 (2015).</li><li>Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerated+synapses+between+postnatal+hair+cells+and+auditory+neurons.">Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (3), 321-329 (2013).</li><li>Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+murine+cochlear+explant+technique+as+an+in+vitro+screening+tool+in+hearing+research.">Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).</li><li>Takeda, S., Mannstr&#246;m, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Aging+and+Noise+Exposure+on+Auditory+Brainstem+Responses+and+Number+of+Presynaptic+Ribbons+in+Inner+Hair+Cells+of+C57BL/6J+Mice.">Effects of Aging and Noise Exposure on Auditory Brainstem Responses and Number of Presynaptic Ribbons in Inner Hair Cells of C57BL/6J Mice.</a> Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).</li><li>Mehraei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+brainstem+response+latency+in+noise+as+a+marker+of+cochlear+synaptopathy.">Auditory brainstem response latency in noise as a marker of cochlear synaptopathy.</a> Journal of Neuroscience. 36 (13), 3755-3764 (2016).</li></ol>

Siden cochlear synaptopathy først ble karakterisert i voksen mus med en midlertidig terskel forskyvning (TTS) indusert av 8 \ u201216 kHz oktav band støy på 100 dB SPL for 2 h31, forskere har i økende grad undersøkt virkningene av synaptopathy i ulike pattedyr, inkludert aper og mennesker32,33. I tillegg til støyeksponering, flere andre forhold har vært forbundet med cochlear synaptopathy (f. eks, aldring, bruk av ototoxic narkotika...

Frekvenser i området ca 20 \ u201220, kan 000 Hz oppfattes som hørsels stimuli av mennesker. Menneskelig hørsel er normalt mest følsom nær 1 000 Hz, hvor gjennomsnittlig lydtrykksnivå er 20 μPa hos unge voksne (dvs. 0 desibel med lydtrykksnivå [dB SPL]). I noen patologiske tilstander er hørselstap begrenset til bestemte frekvenser. For eksempel, i de tidlige stadier av støy-indusert hørselstap (NIHL), en "hakk" (dvs., hørsel terskel høyde) kan observeres i audiogram ved 4 kHz1. Langs det pattedyr cochlea-partisjonen produserer dens graderinger av stivhet og masse et eksponentiell frekvens kart med høyfrekvent lyd deteksjon ved bunnen av cochlea og lavfrekvent deteksjon på Apex2. Ja, det er et cochleaimplantat-kart langs basilar membranen, noe som fører til det som er kjent som tonotopic Organization2,3. Hvert gitt sted på basilar membranen har den høyeste følsomheten til bare en bestemt lyd frekvens, som vanligvis kalles den karakteristiske frekvensen3,4, selv om svar på andre frekvenser kan også observeres.
Til dags dato har ulike musemodeller vært ansatt for å undersøke normal funksjon, patologiske prosesser og terapeutisk effekt i hørselssystemet. Presis kunnskap om fysiologiske parametre i musen cochlea er en forutsetning for slike studier av hørselstap. Musen cochlea er anatomisk delt inn i apikale, midtre og basale svinger, som tilsvarer ulike frekvensområder. Ved å merke hørselsnerven afferents på cochlea-kjernen for å analysere de tilsvarende perifere innervasjon IDene i sneglehuset, ble Müller et al. lyktes i å etablere et steds frekvens kart i den normale musen in vivo5. I intervallet på 7,2-61.8 kHz, som tilsvarer posisjoner mellom 90% og 10% av hele lengden av basilar membranen, kan musen cochlear steds frekvens kart beskrives av en enkel lineær regresjon funksjon, noe som tyder på en sammenheng mellom normalisert avstand fra cochlear base og logaritmen av den karakteristiske frekvensen5. I laboratoriemus kan steds frekvens kartet brukes til å utforske forholdet mellom hørsels terskler innenfor bestemte frekvensområder og cochleograms som viser antall manglende hårceller i relative områder langs basilar membranen6. Viktigere er det sted-frekvens kartet gir et posisjoneringssystem for etterforskning av minimale strukturelle skader, for eksempel skade på båndet synapser av hårceller på bestemte cochlear frekvens steder i mus med perifer hørsels traume7 ,8.
I pattedyr cochlea, bånd synapser består av et presynaptiske nerve bånd, en elektron-tett projeksjon som tethers en Halo av release-klar Synaptic blemmer som inneholder glutamat i IHC, og en postsynaptic tetthet på nerve terminalen i SGN med glutamat reseptorer9. Når du Transduction cochlear, resulterer hår celle bunten i IHC depolarization, som fører til glutamat utgivelse fra IHCs på de postsynaptic afferente terminalene, og dermed aktivere hørsels Tien. Aktivering av denne veien fører til transformasjon av lyd-indusert mekaniske signaler til en rate kode i SGN10. Faktisk er IHC Ribbon synapse svært spesialisert for Indefatigable lydoverføring til priser for hundrevis av Hertz med høy Temporal presisjon, og er av avgjørende betydning for presynaptiske nerve mekanismer for lydkoding. Tidligere studier har avdekket at båndet synapser varierer sterkt i størrelse og tall på ulike frekvensområder i voksen Mouse cochlea11,12, sannsynligvis reflekterer strukturell tilpasning til den spesielle lydkodingen for behov for overlevelse. Nylig har eksperimentelle dyrestudier vist at cochlear synaptopathy bidrar til flere former for hørselshemninger, inkludert støy indusert hørselstap, alders relatert hørselstap og arvelig hørselstap13, 14. dermed har metoder for å identifisere korrelert endringer i Synaptic nummer, struktur og funksjon på bestemte frekvensområder blitt stadig mer brukt i studier av hørsels utvikling og indre øret sykdom, ved hjelp av modeller som genereres via eksperimentell manipulering av genetiske eller miljømessige variabler15,16,17.
I den gjeldende rapporten, presenterer vi en protokoll for å analysere Synaptic nummer, struktur og funksjon i et bestemt frekvensområde av basilar membran i voksen mus. Cochlear frekvens lokalisering utføres ved hjelp av et gitt sted-frekvens kart i kombinasjon med en cochleogram. De normale morfologiske karakteristikkene av cochlear bånd synapser evalueres via presynaptiske nerve og postsynaptic immunostaining. Den funksjonelle status for cochlear Ribbon synapser bestemmes basert på suprathreshold amplituder av ABR bølge I. Med mindre endringer, kan denne protokollen brukes til å undersøke fysiologiske eller patologiske tilstander i andre dyremodeller, inkludert rotter, marsvin og gerbils.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:828px;" width="828">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ketamine hydrochloride</td>
			<td style="width:304px;">Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China</td>
			<td style="width:141px;">H35020148</td>
			<td style="width:167px;">100mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>X-1251</td>
			<td>10mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TDT physiology apparatus</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA</td>
			<td colspan="2">Auditory Physiology System III</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SigGen/BioSig software</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA</td>
			<td colspan="2">Auditory Physiology System III</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electric Pad</td>
			<td>Pet Fun</td>
			<td>11072931136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps 3#</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada</td>
			<td>0203-3-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps 5#</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada</td>
			<td>0209-5-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereo dissection microscope</td>
			<td>Nikon Corp., Tokyo, Japan</td>
			<td>SMZ1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat serum</td>
			<td>ZSGB-BIO, Beijing,China</td>
			<td>ZLI-9021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4</td>
			<td>Millipore Corp., Billerica, MA, USA</td>
			<td>MAB397</td>
			<td>mouse&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified Mouse Anti-CtBP2</td>
			<td>BD Biosciences, Billerica, MA, USA</td>
			<td>612044</td>
			<td>mouse&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>A21124</td>
			<td>goat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>A21131</td>
			<td>goat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting medium containing DAPI</td>
			<td>ZSGB-BIO, Beijing,China</td>
			<td>ZLI-9557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal fluorescent microscopy</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>TCS SP8 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image Pro Plus software</td>
			<td>Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA</td>
			<td>version 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Professional diagnostic pocket otoscope</td>
			<td>Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,China</td>
			<td>HS-OT10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle electrode</td>
			<td>Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi&#39;an,China</td>
			<td>1029</td>
			<td>20 mm, 28 G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Closed-field speaker</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA</td>
			<td>CF1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea

Cochlear indre hårceller (IHCs) overfører akustiske signaler til spiral Ganglion neurons (SGNs) gjennom bånd synapser. Flere eksperimentelle studier har indikert at hår celle synapser kan være de første målene i sensorineural hørselstap (SNHL). Slike studier har foreslått begrepet cochlear "synaptopathy", som refererer til endringer i bånd synapse nummer, struktur eller funksjon som resulterer i unormal Synaptic overføring mellom IHCs og SGNs. Selv om cochlear synaptopathy er irreversibel, påvirker det ikke hørsels terskelen. I støy induserte eksperimentelle modeller er begrenset skade på IHC synapser i utvalgte frekvensområder benyttet for å identifisere de miljømessige faktorene som spesielt forårsaker synaptopathy, så vel som de fysiologiske konsekvensene av å forstyrre dette indre øret krets. Her presenterer vi en protokoll for å analysere cochlear Synaptic morfologi og funksjon på et bestemt frekvensområde i voksen mus. I denne protokollen utføres cochlear lokalisering av spesifikke frekvensområder ved hjelp av steds frekvens kart i forbindelse med cochleogram data, som følger de morfologiske karakteristikkene av bånd synapser evalueres via Synaptic immunostaining. Den funksjonelle status bånd synapser bestemmes deretter basert på amplituder av hørbar hjernestammen respons (ABR) bølge I. Den nåværende rapporten viser at denne tilnærmingen kan brukes til å utdype vår forståelse av patogenesen og mekanismer av Synaptic dysfunksjon i sneglehuset, som kan hjelpe i utviklingen av romanen terapeutiske intervensjoner.

ABR hørselstester ble utført for 10 C57BL/6J mus (8 ukers alder) under anestesi. ABRs ble elicited ved hjelp av tone burst stimuli ved 4, 8, 16, 32 og 48 kHz. Hørsels terskelen til hvert dyr ble visuelt oppdaget ved å skille minst én klar bølgeform i ABR. Alle mus utstilt ABR terskler som svar på tone serieopptak, varierer mellom 25 og 70 dB SPL avhengig av hyppigheten av stimulans. Resultatene indikerte at hørsels terskelen var lavest på 16 kHz (figur 1), tilsvarende omtrent 43% av...

Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea at JoVE.com

Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

Dette manuskriptet beskriver en eksperimentell protokoll for evaluering av morfologiske egenskaper og funksjonell status for bånd synapser i normale mus. Den nåværende modellen egner seg også for støy-indusert og alder-relaterte cochlear synaptopathy-begrensede modeller. De correlative resultatene av tidligere mus studier er også diskutert.

Morfologiske og funksjonell evaluering av Ribbon synapser på spesifikke frekvens regioner av Mouse cochlea

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

Den primære rapporten er virkelig stress viktig av nøyaktig å finne den spesifikke frekvensområdet av basilærmembranen i de fleste modeller, hvor synapse tall endret og funksjon kan analyseres. Cochlea lokalisering av de spesifikke frekvensområdene utføres pålitelig ved hjelp av, plasser frekvenskart sammen med cochleogramdata. Mikroskopet gir innsikt i flere forskningsstudier.Det støtter forestillingen om at cochlea neuropathy er de primære første hendelsene spesielt før hørselstap, tinnitus og hyperacusis. Etter å ha bekreftet mangel på respons på tå klemme i en bedøvet åtte uker gammel voksen C57 svart 6J mannligmus. Plasser musen på en 37 graders celsius varmepute i et elektrisk og akustisk skjermet rom.Deretter plasserer du en subdermal 20 millimeter 28 gauge nål som registrerer elektrode, med dybden på tre millimeter under huden på skallens toppunkt. En referanseelektrode i ipsilateral parotid-regionen, under pinna av målt øre og en jordelektrode i den kontralaterale parotidregionen. Plasser en lukket felthøyttaler utstyrt med et to centimeter plastrør med en kjegleformet spiss ved siden av musen og sett spissen inn i den ytre øregangen.For en auditiv hjernestammerespons, eller ABR-opptak, generere tone pips ved å redusere lydtrykknivåer fra 90 til 10 desibel, i fem til 10 desibel lydtrykk nivå trinn. I løpet av dette trinnet forsterkes svarene, filtreres og gjennomsnittes. Ved hver frekvens bestemmer du ABR-terskelen, som er det minimale lydtrykksnivået som resulterer i et pålitelig ABR-opptak med en eller flere skillebølger som tydelig kan identifiseres ved visuell inspeksjon.Etter ABR-opptaket, utsett bulla fra ventral side og åpne bulla med skarp saks for å få tilgang til sneglehuset. Ved hjelp av fine tang, fjern de timelige beinene og bryte stiftene arterien. Fjern deretter stiftene fra det ovale vinduet og ruptur den runde vindusmembranen.Roter forsiktig spissen av en 13 millimeter 27 gauge nål for å lage et lite hull på toppen av sneglehuset, før du bruker en fin tippet pipette for å forsiktig skylle 4% paraformaldehyd gjennom vinduet inn i de perilymphatic mellomrom. Skyll deretter beinene tre ganger i fem minutter per vask med kald frisk 0,1 molar PBS per vask. Etterfulgt av avkalking av bein med 10% EDTA i fire timer ved romtemperatur og 20 rotasjoner per minutt på en horisontal shaker.På slutten av inkubasjonen, overfør et avkalket temporalt bein til frisk 0,1 molar PBS under et disseksjonsmikroskop. Bruk 3 og 5 Dumont pinsett og en 27 gauge nål for å dissekere de aksiske, midtre og basale sneglehuset i sin tur. Bruk et barberblad til å lage en liten serie kutt langs spiralligamentet og fjerne tectorial membran og Reissners membran.Videre dissekere gjenværende auditive epitel, inkludert spirallemmen, til individuelle cochlea svinger for hele mount preparater. Bruk deretter 40X oljemålet til et lett mikroskop for å måle basilærmembranlengde med 250 mikrometerskala plassert i øyestykket. Det kan justeres langs stereocilia av de indre hårcellene.Etter disseksjon, plasser hver cochlear bli til individuelle 2,5 milliliter sentrifuge rør. Blokker eventuell uspesifikk binding med 10 % geiteserum i PBS hos 0,1 %Triton X-100 i én time ved romtemperatur på en rotator. På slutten av inkubasjonen, bruk 200 mikroliter pipettespiss for å fjerne løsningen under et disseksjonsmikroskop.Inkuber prøvene med de primære antistoffene av interesse fortynnet i 5% geitserum og PBS i 0,1% Triton X-100 over natten ved 4 grader Celsius på en rotator. Neste morgen, skyll vevsprøvene tre ganger i fem minutter med kaldt 0,1 molar PBS per vask for å fjerne eventuelle gjenværende primære antistoffer. Merk deretter prøvene med passende sekundære antistoffer fortynnet i 5% geiteserum i PBS i 0,1% Triton X-100 i to til tre timer ved romtemperatur på rotatoren, beskyttet mot lys.Ved slutten av inkubasjonen vask prøvene tre ganger med 0,1 molar PBS som demonstrert og overfør prøvene til individuelle 35 millimeter plater som inneholder 0,1 molar PBS. Plasser en dråpe DAPI-supplert monteringsmedium på lysbildet og overfør prøvene fra PBS til monteringsmediet. Plasser den ene kanten av et deksel som glir på hvert lysbilde og slipp for å la dekselet gli forsiktig.Tørk deretter lysbildene i en lysbildeboks ved fire grader Celsius over natten. For å se bort prøvene, bruk et konfokalt mikroskop med passende lasere og 63X høyoppløselig oljesenkingslinse for å skaffe åtte mikrometer confocal Z-stabler fra hver cochleasving. For synaptiske punktpunkttellinger angir du Z-stablene med 0,3 mikrometertrinnstørrelsen for å strekke seg over hele lengden på indre hårceller, slik at alle synaptiske punktpunktene kan avbildes og slå sammen puncta som inneholder bilder i en Z-stabel for å oppnå Z-tilgangsprojeksjonen.Importer de sammenslåtte bildene til et passende bildebehandlingsprogram. Del de synaptiske totaltellingene i hver Z-stabel på bestemte frekvensområder med antall DAPI-positive indre hårceller for å beregne antall synaptiske punktpunkt for hver celle. Ved hvert bestemt frekvensområde, gjennomsnittlig alle synaptiske punktpunkt i tre bilder av forskjellige mikroskopiske felt, som inneholder ni til 11 indre hårceller.For bedre å visualisere cytoskeletal arkitektur og synaptisk lokalisering, bruk børsteverktøyet til å visuelt vurdere den synaptiske strukturen og fordelingen av de enkelte indre hårcellene. For å inspisere sammenstillingen av presynaptiske bånd og postsynaptiske reseptorpatcher, bruk det rektangulære markeringsverktøyet trekke ut voxel-rommet rundt båndene og bruke bildeskjæring til å isolere de enkelte båndene. Klikk deretter bilde- og bildestørrelse for å skaffe et miniatyrbilde av disse miniatyrprojeksjonene som kan brukes til å identifisere sammenkoblede synapser kontra foreldreløse bånd.Alle ti musene i dette representative eksperimentet viste ABR-terskler som svar på toneutbrudd som varierer mellom 25 og 70 desibel per lydtrykksnivå avhengig av hyppigheten av stimulansen. Hørselsterskelen for dette eksperimentet var lavest ved 16 kilohertz tilsvarende ca. 43 % av avstanden fra cochlea-toppunktet, noe som tyder på at den akustiske følsomheten reduseres betydelig i andre cochlearegioner. Hele mounts av det auditive epitelet dissekeres i tre stykker og lengdene måles og omdannes til deres prosentavstand fra cochlea-toppunktet.Frekvensplasseringen på basilærmembranen til hver cochleasving beregnes ved hjelp av logaritmisk funksjon. I normale ører av voksne mus avslører immunstaining sammenstilte par synaptiske bånd og glutamatreseptorpatcher. Studere overflaten av basolateral membran av de indre hårcellene, med åtte til 20 par per celle.Selv om det store flertallet av puncta vises som sidestilte par i normale ører, blir foreldreløse bånd sjelden observert ved høye forstørrelser. Antall indre hår celle bånd synapser er høyest på 16 kilohertz regionen og reduseres betydelig som avstanden fra dette stedet øker. Det viktigste å huske under denne prosedyren er at man må garantere integriteten til cochlea basal membran.Vi må understreke nøyaktigheten til tekniske ferdigheter er nådd. Etter denne prosedyren kan genterapien utføres for å svare på om cochleanevropati kan repareres av dette tiltaket. Dette tiltaket er bredere teknikk for å utforske cochlea neuropati, som hvis de primære innledende hendelsene forbinder med å ha hørselstap, tinnitus og hyperacusis.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Neuroscience

Unit 1

The Special Senses

SCIENTISTS IN ACTION

Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the ...

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Cerebrovaskulær Støping av Adult Mouse for 3D Imaging og morfologisk analyse

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase aktivitet i de ulike regionene i Mouse Brain: ikke-radioaktive Telomerase Gjenta Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

Funksjonell og Morfologisk Vurdering av Membran Innervasjon av phrenic motoriske nerveceller

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Høy oppløsning Kvantitativ immungull Analyse av membranreseptorer på retina Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Hele Mount Dissection og Immunfluorescens av Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Rask og spesifikk Immunomagnetic isolasjon av musen primære Oligodendrocytes

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Funksjonell evaluering av Olfactory stier i levende Xenopus rumpetroll

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Bilde av celle-spesifikke kalsium signalisering på tre Synapse av musen membranen

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Stimulus-specific Cortical Visual Evoked Potential Morphological Patterns

Stimulans-spesifikke kortikale Visual fremkalt potensiell morfologiske mønstre

This paper presents a methodology for the recording and analysis of cortical visual evoked potentials (CVEPs) in response to various visual stimuli using ...