Name: morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea
Uploaded: 2019-05-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (81770997, 81771016, 81830030); o projeto de financiamento conjunto da Fundação de ciências naturais de Pequim e do Comitê de educação de Pequim (KZ201810025040); Fundação de ciências naturais de Pequim (7174291); e a Fundação de ciência pós-doutorado da China (2016M601067).

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o guia NRC/ILAR para o cuidado e uso de animais de laboratório (8ª edição). O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade de medicina de capital, Pequim, China.
1. seleção animal
<ol><li>Para todos os experimentos, use camundongos adultos C57BL/6J machos (8 semanas de idade) como modelo animal. Nota: Camundongos C57BL/6J portadores de uma variante de Sp...

<ol>
	<li>Lie, A., Skogstad, M., Johnsen, T. S., Engdahl, B., Tambs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+notched+audiograms+in+a+cross-sectional+study+of+12,055+railway+workers.">The prevalence of notched audiograms in a cross-sectional study of 12,055 railway workers.</a> Ear and Hearing. 36 (3), 86-92 (2015).</li><li>Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+transduction,+tuning,+and+synaptic+transmission+in+the+mammalian+cochlea.">Hair cell transduction, tuning, and synaptic transmission in the mammalian cochlea.</a> Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).</li><li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cochlear+frequency+map+for+the+cat:+labeling+auditory-nerve+fibers+of+known+characteristic+frequency.">The cochlear frequency map for the cat: labeling auditory-nerve fibers of known characteristic frequency.</a> Journal of the Acoustical Society of America. 72 (5), 1441-1449 (1982).</li><li>Fettiplace, R., Kim, K. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+mechanoelectrical+transduction+channels+in+hearing.">The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing.</a> Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).</li><li>Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiological+place-frequency+map+of+the+cochlea+in+the+CBA/J+mouse.">A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse.</a> Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).</li><li>Viberg, A., Canlon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+guide+to+plotting+a+cochleogram.">The guide to plotting a cochleogram.</a> Hearing Research. 197 (1-2), 1-10 (2004).</li><li>Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+exposure+modulates+cochlear+inner+hair+cell+ribbon+volumes,+correlating+with+changes+in+auditory+measures+in+the+FVB/nJ+mouse.">Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse.</a> Scientific Reports. 6, 25056 (2016).</li><li>Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+after+noise+exposure:+acceleration+of+cochlear+synaptopathy+in+"recovered"+ears.">Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears.</a> Journal of Neuroscience. 35 (19), 7509-7520 (2015).</li><li>Wichmann, C., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+structure+and+function+of+inner+hair+cell+ribbon+synapses.">Relating structure and function of inner hair cell ribbon synapses.</a> Cell and Tissue Research. 361 (1), 95-114 (2015).</li><li>Matthews, G., Fuchs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+roles+of+ribbon+synapses+in+sensory+neurotransmission.">The diverse roles of ribbon synapses in sensory neurotransmission.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 812-822 (2010).</li><li>Liberman, L. D., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+maturation+of+auditory-nerve+heterogeneity,+as+seen+in+spatial+gradients+of+synapse+morphology+in+the+inner+hair+cell+area.">Postnatal maturation of auditory-nerve heterogeneity, as seen in spatial gradients of synapse morphology in the inner hair cell area.</a> Hearing Research. 339, 12-22 (2016).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximal+number+of+pre-synaptic+ribbons+are+formed+in+cochlear+region+corresponding+to+middle+frequency+in+mice.">Maximal number of pre-synaptic ribbons are formed in cochlear region corresponding to middle frequency in mice.</a> Acta Oto-Laryngologica. 138 (1), 25-30 (2018).</li><li>Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+synaptopathy+in+acquired+sensorineural+hearing+loss:+Manifestations+and+mechanisms.">Cochlear synaptopathy in acquired sensorineural hearing loss: Manifestations and mechanisms.</a> Hearing Research. 349, 138-147 (2017).</li><li>Moser, T., Starr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+neuropathy--neural+and+synaptic+mechanisms.">Auditory neuropathy--neural and synaptic mechanisms.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (3), 135-149 (2016).</li><li>Yu, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Gata3-Mafb+transcriptional+network+directs+post-synaptic+differentiation+in+synapses+specialized+for+hearing.">A Gata3-Mafb transcriptional network directs post-synaptic differentiation in synapses specialized for hearing.</a> Elife. 2, 01341 (2013).</li><li>Buniello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wbp2+is+required+for+normal+glutamatergic+synapses+in+the+cochlea+and+is+crucial+for+hearing.">Wbp2 is required for normal glutamatergic synapses in the cochlea and is crucial for hearing.</a> EMBO Molecular Medicine. 8 (3), 191-207 (2016).</li><li>Gilels, F., Paquette, S. T., Beaulac, H. J., Bullen, A., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+hearing+loss+and+outer+hair+cell+death+in+homozygous+Foxo3+knockout+mice+after+moderate+noise+exposure.">Severe hearing loss and outer hair cell death in homozygous Foxo3 knockout mice after moderate noise exposure.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1054 (2017).</li><li>Kane, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+effects+on+age-related+hearing+loss+associated+with+Cdh23+variants+in+mice.">Genetic background effects on age-related hearing loss associated with Cdh23 variants in mice.</a> Hearing Research. 283 (1-2), 80-88 (2012).</li><li>Jiang, X. W., Li, X. R., Zhang, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+of+ribbon+synapses+number+of+cochlear+hair+cells+in+C57BL/6J+mice+with+age+(Delta).">Changes of ribbon synapses number of cochlear hair cells in C57BL/6J mice with age (Delta).</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (10), 19058-19064 (2015).</li><li>Akil, O., Oursler, A., Fan, K., Lustig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+auditory+brainstem+response+testing.">Mouse auditory brainstem response testing.</a> BIO-Protocol. 6 (6), (2016).</li><li>Zhou, X., Jen, P. H. -. S., Seburn, K. L., Frankel, W. N., Zheng, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+brainstem+responses+in+10+inbred+strains+of+mice.">Auditory brainstem responses in 10 inbred strains of mice.</a> Brain Research. 1091 (1), 16-26 (2006).</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+dissection+and+immunofluorescence+of+the+adult+mouse+cochlea.">Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).</li><li>Schmitz, F., Konigstorfer, A., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIBEYE,+a+component+of+synaptic+ribbons:+a+protein's+journey+through+evolution+provides+insight+into+synaptic+ribbon+function.">RIBEYE, a component of synaptic ribbons: a protein's journey through evolution provides insight into synaptic ribbon function.</a> Neuron. 28 (3), 857-872 (2000).</li><li>Suzuki, J., Corfas, G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round-window+delivery+of+neurotrophin+3+regenerates+cochlear+synapses+after+acoustic+overexposure.">Round-window delivery of neurotrophin 3 regenerates cochlear synapses after acoustic overexposure.</a> Scientific Reports. 6, 24907 (2016).</li><li>Rutherford, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+structure+of+inner+ear+ribbon+synapses+with+STED+microscopy.">Resolving the structure of inner ear ribbon synapses with STED microscopy.</a> Synapse. 69 (5), 242-255 (2015).</li><li>Liberman, L. D., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+cochlear+synaptopathy+after+acoustic+overexposure.">Dynamics of cochlear synaptopathy after acoustic overexposure.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 16 (2), 205-219 (2015).</li><li>Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+Foxo3+causes+adult+onset+auditory+neuropathy+and+alters+cochlear+synapse+architecture+in+mice.">Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice.</a> Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).</li><li>Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin-3+regulates+ribbon+synapse+density+in+the+cochlea+and+induces+synapse+regeneration+after+acoustic+trauma.">Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+cochlear+synaptopathy:+an+early-onset+contributor+to+auditory+functional+decline.">Age-related cochlear synaptopathy: an early-onset contributor to auditory functional decline.</a> Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).</li><li>Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+cochlear+neuropathy+is+selective+for+fibers+with+low+spontaneous+rates.">Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).</li><li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adding+insult+to+injury:+cochlear+nerve+degeneration+after+"temporary"+noise-induced+hearing+loss.">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss.</a> Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li><li>Valero, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+cochlear+synaptopathy+in+rhesus+monkeys+(Macaca+mulatta).">Noise-induced cochlear synaptopathy in rhesus monkeys (Macaca mulatta).</a> Hearing Research. 353, 213-223 (2017).</li><li>Viana, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+neuropathy+in+human+presbycusis:+Confocal+analysis+of+hidden+hearing+loss+in+post-mortem+tissue.">Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue.</a> Hearing Research. 327, 78-88 (2015).</li><li>Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerated+synapses+between+postnatal+hair+cells+and+auditory+neurons.">Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (3), 321-329 (2013).</li><li>Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+murine+cochlear+explant+technique+as+an+in+vitro+screening+tool+in+hearing+research.">Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).</li><li>Takeda, S., Mannstr&#246;m, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Aging+and+Noise+Exposure+on+Auditory+Brainstem+Responses+and+Number+of+Presynaptic+Ribbons+in+Inner+Hair+Cells+of+C57BL/6J+Mice.">Effects of Aging and Noise Exposure on Auditory Brainstem Responses and Number of Presynaptic Ribbons in Inner Hair Cells of C57BL/6J Mice.</a> Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).</li><li>Mehraei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+brainstem+response+latency+in+noise+as+a+marker+of+cochlear+synaptopathy.">Auditory brainstem response latency in noise as a marker of cochlear synaptopathy.</a> Journal of Neuroscience. 36 (13), 3755-3764 (2016).</li></ol>

Desde que o synaptopathy coclear foi caracterizado primeiramente em ratos adultos com um deslocamento provisório do ponto inicial (TTS) induzido pelo ruído da faixa de oitava de 8 \ u201216 kHz em 100 dB SPL para 2 h31, os investigadores investigaram cada vez mais os efeitos do synaptopathy em vários mamíferos, incluindo macacos e seres humanos32,33. Além da exposição ao ruído, várias outras condições têm sido associadas à sin...

As freqüências na escala de aproximadamente 20 \ u201220, 000 hertz podem ser percebidas como estímulos auditivos por seres humanos. A audição humana é normalmente mais sensível perto de 1.000 Hz, onde o nível médio de pressão sonora é de 20 μPa em adultos jovens (ou seja, 0 decibéis de nível de pressão sonora [dB SPL]). Em algumas condições patológicas, a perda auditiva é restrita a frequências específicas. Por exemplo, nos estágios iniciais da perda auditiva induzida por ruído (pair), um "entalhe" (i.e., elevação do limiar auditivo) pode ser observado no audiograma a 4 kHz1. Ao longo da partição coclear de mamíferos, suas gradações de rigidez e massa produzem um mapa de frequência exponencial, com detecção de som de alta frequência na base da cóclea e detecção de baixa frequência no ápice2. De fato, há um mapa de localização-frequência coclear ao longo da membrana basilar, levando ao que é conhecido como organização tonotópica2,3. Cada lugar dado na membrana basilar tem a sensibilidade a mais elevada a somente uma freqüência sadia particular, que seja denominada geralmente a freqüência característica3,4, embora as respostas a outras freqüências possam igualmente ser observadas.
Até o momento, vários modelos de mouse têm sido empregados para investigar a função normal, processos patológicos e eficácia terapêutica no sistema auditivo. O conhecimento preciso dos parâmetros fisiológicos na cóclea do camundongo é um pré-requisito para esses estudos de perda auditiva. A cóclea do camundongo é dividida anatomicamente em curvas apical, média e basal, que correspondem a diferentes regiões de frequência. Ao rotular os aferentes do nervo auditivo no núcleo coclear para analisar seus locais de inervação periférica correspondentes na cóclea, Müller et al. conseguiram estabelecer o mapa de localização-frequência coclear no rato normal in vivo5. No intervalo de 7,2 – 10, 5kHz, o que corresponde a posições entre 90% e a dez% do comprimento total da membrana basilar, o mapa de localização-frequência da cóclea do rato pode ser descrito por uma função de regressão linear simples, sugerindo uma relação entre o distância normalizada da base coclear e o logaritmo da frequência característica5. Em camundongos de laboratório, o mapa de frequência local pode ser usado para explorar a relação entre limiares auditivos dentro de faixas de frequência específicas e cocleogramas mostrando o número de células ciliadas ausentes em regiões relativas ao longo da membrana basilar6. É importante ressaltar que o mapa de frequência local fornece um sistema de posicionamento para a investigação de danos estruturais mínimos, como danos às sinapses de fita de células ciliadas em locais específicos de frequência coclear em camundongos com trauma auditivo periférico7 ,8.
Na cóclea de mamíferos, as sinapses da fita são compostas de uma fita pré-sináptica, uma projeção elétron-densa que amarras um halo de vesículas sinápticas prontas para liberação contendo glutamato dentro do IHC, e uma densidade pós-sináptica no terminal nervoso do Sgn com receptores de glutamato9. Durante a transdução do som coclear, a deflexão do feixe de células ciliadas resulta em despolarização do IHC, o que leva à liberação de glutamato de IHCs para os terminais aferentes pós-sinápticos, ativando assim a via auditiva. A ativação deste caminho conduz à transformação de sinais mecânicos som-induzidos em um código da taxa no SGN10. Na verdade, a sinapse de fita IHC é altamente especializada para transmissão de som incansável em taxas de centenas de hertz com alta precisão temporal, e é de importância crítica para mecanismos pré-sinápticos de codificação de som. Os estudos precedentes revelaram que as sinapses da fita variam extremamente no tamanho e no número em regiões diferentes da freqüência no rato adulto cóclea11,12, refletindo provavelmente a adaptação estrutural à codificação sadia particular para necessidades de sobrevivência. Recentemente, estudos experimentais em animais demonstraram que a sinaptopatia coclear contribui para múltiplas formas de deficiências auditivas, incluindo perda auditiva induzida por ruído, perda auditiva relacionada à idade e perda auditiva hereditária13, 14. assim, métodos para identificação de alterações correlatas no número, estrutura e função sináptica em regiões de frequência específica têm sido cada vez mais empregados em estudos de desenvolvimento auditivo e doença da orelha interna, utilizando modelos gerados via manipulação experimental de variáveis genéticas ou ambientais15,16,17.
No presente relato, apresentamos um protocolo para analisar o número, a estrutura e a função sináptica em uma região de frequência específica da membrana basilar em camundongos adultos. A localização da frequência coclear é realizada utilizando-se um determinado mapa de frequência local em combinação com um cócleograma. As características morfológicas normais das sinapses da fita coclear são avaliadas via imunomarcação pré-sináptica e pós-synaptica. O estado funcional das sinapses da fita coclear é determinado com base nas amplitudes do estímulo da onda I de abr. Com pequenas alterações, este protocolo pode ser usado para examinar as condições fisiológicas ou patológicas em outros modelos animais, incluindo ratos, cobaias e gerbils.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:828px;" width="828">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ketamine hydrochloride</td>
			<td style="width:304px;">Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China</td>
			<td style="width:141px;">H35020148</td>
			<td style="width:167px;">100mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>X-1251</td>
			<td>10mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TDT physiology apparatus</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA</td>
			<td colspan="2">Auditory Physiology System III</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SigGen/BioSig software</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA</td>
			<td colspan="2">Auditory Physiology System III</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electric Pad</td>
			<td>Pet Fun</td>
			<td>11072931136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps 3#</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada</td>
			<td>0203-3-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps 5#</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada</td>
			<td>0209-5-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereo dissection microscope</td>
			<td>Nikon Corp., Tokyo, Japan</td>
			<td>SMZ1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat serum</td>
			<td>ZSGB-BIO, Beijing,China</td>
			<td>ZLI-9021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4</td>
			<td>Millipore Corp., Billerica, MA, USA</td>
			<td>MAB397</td>
			<td>mouse&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified Mouse Anti-CtBP2</td>
			<td>BD Biosciences, Billerica, MA, USA</td>
			<td>612044</td>
			<td>mouse&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>A21124</td>
			<td>goat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>A21131</td>
			<td>goat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting medium containing DAPI</td>
			<td>ZSGB-BIO, Beijing,China</td>
			<td>ZLI-9557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal fluorescent microscopy</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>TCS SP8 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image Pro Plus software</td>
			<td>Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA</td>
			<td>version 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Professional diagnostic pocket otoscope</td>
			<td>Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,China</td>
			<td>HS-OT10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle electrode</td>
			<td>Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi&#39;an,China</td>
			<td>1029</td>
			<td>20 mm, 28 G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Closed-field speaker</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA</td>
			<td>CF1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea

As células ciliadas internas cocleares (IHCs) transmitem sinais acústicos aos neurônios de gânglio espirais (SGNs) através de sinapses de fita. Vários estudos experimentais indicaram que as sinapses das células ciliadas podem ser os alvos iniciais na perda auditiva neurossensorial (SNHL). Tais estudos têm proposto o conceito de "sinaptopatia" coclear, que se refere a alterações no número, estrutura ou função da sinapse da fita que resultam em transmissão sináptica anormal entre IHCs e SGNs. Embora a sinaptopatia coclear seja irreversível, não afeta o limiar auditivo. Em modelos experimentais induzidos por ruído, os danos restritos às sinapses de IHC em regiões de frequência selecionam-se são empregados para identificar os fatores ambientais que causam especificamente o synaptopathy, assim como as conseqüências fisiológicas de perturbar esta orelha interna Circuito. Aqui, apresentamos um protocolo para análise da morfologia sináptica coclear e função em uma região de frequência específica em camundongos adultos. Neste protocolo, a localização coclear de regiões de frequência específica é realizada utilizando-se mapas de frequência de lugar em conjunto com dados de cochleograma, seguindo os quais as características morfológicas das sinapses da fita são avaliadas via sináptica immunostaining. O estado funcional das sinapses da fita é então determinado com base nas amplitudes da onda de resposta auditiva do tronco encefálico (ABR) I. O presente relato demonstra que essa abordagem pode ser utilizada para aprofundar nossa compreensão da patogênese e dos mecanismos de disfunção sináptica na cóclea, o que pode auxiliar no desenvolvimento de novas intervenções terapêuticas.

Os testes auditivos de ABR foram realizados para camundongos 10 C57BL/6J (8 semanas de idade) anestesia. Os ABRs foram eliciados usando estímulos de burst de Tom em 4, 8, 16, 32 e 48 kHz. O limiar auditivo de cada animal foi detectado visualmente por distinguir pelo menos uma forma de onda clara no PEATE. Todos os camundongos exibiram limiares de PEATE em resposta a rajadas de Tom, variando entre 25 e 70 dB NPS dependendo da frequência do estímulo. Nossos resultados indicaram que o limiar auditivo foi menor em 16 kHz ...

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Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

Este manuscrito descreve um protocolo experimental para avaliar as características morfológicas e o estado funcional das sinapses da fita em camundongos normais. O modelo atual é igualmente apropriado para modelos synaptopathy-restringidos ruído-induzidos e idade-relacionados da coclear. Os resultados correlativos de estudos precedentes do rato são discutidos igualmente.

Avaliação morfológica e funcional de sinapses de fita em regiões de frequência específica da cóclea do rato

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

O relatório primário é realmente a importância do estresse de localizar com precisão a região de frequência específica da membrana basilar na maioria dos modelos, onde os números de sinapse alterados e a função podem ser analisados. A localização coclear das regiões de frequência específica é realizada de forma confiável utilizando mapas de frequência em conjunto com dados de cocleograma. O microscópio fornece informações sobre vários estudos de pesquisa.Apoia a noção de que a neuropatia coclear é os eventos iniciais primários especificamente anteriores à perda auditiva, zumbido e hiperacusia. Depois de confirmar a falta de resposta ao dedo do dedo beliscão em um anesthetizado adulto C57 preto 6J rato masculino. Coloque o mouse em uma almofada de calor de 37 graus celsius em uma sala elétrica e acústica blindada.Em seguida, coloque um eletrodo de gravação de agulha subdérmica de 20 milímetros de 28 milímetros, com a profundidade de três milímetros sob a pele no vértice do crânio. Um eletrodo de referência na região parotid ipsilateral, abaixo do pina de orelha medida e um eletrodo moído na região parotid contralateral. Coloque um alto-falante de campo fechado equipado com um tubo de plástico de dois centímetros com uma ponta em forma de cone ao lado do mouse e encaixe a ponta no canal auditivo externo.Para uma resposta auditiva do tronco cerebral, ou gravação de ABR, gerar tubos de tom na diminuição dos níveis de pressão sonora de 90 a 10 decibéis, em cinco a 10 passos de nível de pressão sonora. Durante esta etapa, as respostas são amplificadas, filtradas e mediadas. Em cada frequência, determine o limiar de ABR, que é o nível mínimo de pressão sonora que resulta em uma gravação ABR confiável com uma ou mais ondas distinguíveis que podem ser claramente identificadas pela inspeção visual.Após a gravação da ABR, exponha a bulla do lado ventral e abra a bulla com uma tesoura afiada para ter acesso à cóclea. Usando fórceps finos, remova os ossos temporais e corte a artéria do estapes. Em seguida, remova as estapes da janela oval e rompa a membrana da janela redonda.Gire suavemente a ponta de uma agulha de calibre 13 milímetros de 27 para fazer um pequeno orifício no ápice da cóclea, antes de usar uma pipeta fina para lavar suavemente 4% de paraformaldeído através da janela para os espaços perifáticos. Em seguida, enxágue os ossos três vezes por cinco minutos por lavagem com PBS molar fresco frio de 0,1 por lavagem. Seguido pela decalcificação dos ossos com 10% EDTA durante quatro horas em temperatura ambiente e 20 rotações por minuto em um agitador horizontal.No final da incubação, transfira um osso temporal decalcificado para pbs molar fresco 0,1 sob um microscópio dissecando. Use 3 e 5 fórceps Dumont e uma agulha de calibre 27 para dissecar as regiões de cóclea apical, média e basal, por sua vez. Use uma lâmina de barbear para fazer uma pequena série de cortes ao longo do ligamento espiral e remover a membrana tectorial e a membrana de Reissner.Dissecar ainda mais o epitélio auditivo restante, incluindo o limbus espiral, em curvas cocleares individuais para preparações de montagem inteiras. Em seguida, use o objetivo do óleo 40X de um microscópio leve para medir o comprimento da membrana basilar com escala de 250 micrômetros colocada na peça ocular. Pode ser ajustado ao longo da estereócilia das células ciliadas internas.Após a dissecção, coloque cada coclear se transforme em tubos de centrífuga individual de 2,5 mililitros. Bloqueie qualquer ligação inespecífica com soro de cabra de 10% em PBS em 0,1% Triton X-100 por uma hora em temperatura ambiente em um rotador. No final da incubação, use 200 pontas de pipeta de microliter para remover a solução sob um microscópio de dissecção.Incubar os espécimes com os anticorpos primários de interesse diluídos em 5% de soro de cabra e PBS em 0,1%Triton X-100 durante a noite a 4 graus Celsius em um rotador. Na manhã seguinte, enxágue as amostras de tecido três vezes por cinco minutos com PBS molar frio de 0,1 por lavagem para remover qualquer anticorpo primário residual. Em seguida, rotule os espécimes com os anticorpos secundários apropriados diluídos em 5% de soro de cabra em PBS em 0,1%Triton X-100 por duas a três horas em temperatura ambiente no rotador, protegido da luz.Ao final da incubação, lave as amostras três vezes com PBS molar 0,1, como demonstrado e transfira as amostras para placas individuais de 35 milímetros contendo PBS molar de 0,1 molar. Coloque uma gota de meio de montagem complementado da DAPI no slide e transfira as amostras do PBS para o meio de montagem. Coloque uma borda de uma tampa escorregando em cada slide e solte para deixar os deslizamentos da tampa caírem suavemente.Em seguida, seque os slides em uma caixa de slides a quatro graus Celsius durante a noite. Para imaginar os espécimes, use um microscópio confocal com os lasers apropriados e lente de imersão de óleo de alta resolução 63X para adquirir oito pilhas Z confocal de oito micrômetros de cada curva coclear. Para contagem de puncta sináptica, defina as pilhas Z com o tamanho da etapa de 0,3 micrômetros para cobrir todo o comprimento das células ciliadas internas, garantindo que todas as puncta sinápticas possam ser imagens e mesclar as puncta contendo imagens em uma pilha Z para obter a projeção de acesso Z.Importe as imagens mescladas em um programa de software de processamento de imagens apropriado. Divida a contagem total sináptica em cada pilha Z em regiões de frequência específicas pelo número de células ciliares internas positivas da DAPI para calcular o número de punctas sinápticas para cada célula. Em cada região de frequência específica, média de todas as punctas sinápticas em três imagens de diferentes campos microscópicos, contendo nove a 11 células ciliares internas.Para visualizar melhor a arquitetura citoesquelética e a localização sináptica, utilize a ferramenta de pincel para avaliar visualmente a estrutura sináptica e a distribuição das células ciliadas internas individuais. Para inspecionar a justaposição de fitas presinápticas e patches de receptores postinopáticos, use a ferramenta de letreiro retangular extrair o espaço voxel ao redor das fitas e usar o corte de imagem para isolar as fitas individuais. Em seguida, clique no tamanho da imagem e da imagem para adquirir uma matriz miniatura dessas projeções em miniatura que podem ser usadas para identificar sinapses emparelhadas versus fitas órfãs.Todos os dez camundongos deste experimento representativo apresentaram limiares de ABR em resposta a rajadas de tom que variavam entre 25 e 70 decibéis por nível de pressão sonora, dependendo da frequência do estímulo. O limiar auditivo para este experimento foi menor em 16 kilohertz, correspondendo a aproximadamente 43% da distância do ápice coclear, sugerindo que a sensibilidade acústica é significativamente reduzida em outras regiões cocleares. Montagens inteiras do epitélio auditivo são dissecadas em três pedaços e os comprimentos são medidos e convertidos em sua distância percentual do ápice coclear.A frequência na membrana basilar de cada curva coclear é calculada usando função logarítmica. Em ouvidos normais de camundongos adultos, a imunosstaining revela pares justtaposed de fitas sinápticas e manchas de receptor de glutamato. Estudando a superfície da membrana basolateral das células ciliares internas, com oito a 20 pares por célula.Embora a grande maioria das punctas apareçam como pares justapostas em ouvidos normais, fitas órfãs são raramente observadas em altas ampliações. O número de sinapses de fita de células ciliares internas é maior na região de 16 kilohertz e diminui significativamente à medida que a distância deste local aumenta. A coisa mais importante a ser lembrada durante este procedimento é que é preciso garantir a integridade da membrana basal coclear.Precisamos enfatizar a precisão até que a proficiência técnica seja alcançada. Após este procedimento, a terapia genética pode ser realizada para responder se a neuropatia coclear pode ser reparada por essa medida. Esta medida é uma técnica mais ampla para explorar a neuropatia coclear, que se os eventos iniciais primários associam-se a ter perda auditiva, zumbido e hiperacusia.

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Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse

Gravações pós-sinápticos em Dendrites aferente entrar em contato com células ciliadas da cóclea: Release multivesiculares Monitoramento em uma fita Synapse

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the ...

Neurociência

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Fundição vascular cerebral do rato adulto for Imaging 3D e Análise morfológica

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

A atividade da telomerase nas diversas regiões de cérebro de camundongo: A telomerase não-radioativo Repetir Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

Funcional e morfológica de Avaliação de Diafragma Innervation por frênico Neurônios Motores

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

High-Resolution Análise Quantitativa immunogold de Receptores de Membrana na retina fita Sinapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Monte todo Dissecção e Imunofluorescência do mouse cóclea Adulto

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Isolamento de Fima rápida e específica de oligodendrócitos primário de Mouse

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Avaliação funcional das vias olfativas vivos Xenopus girinos

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Imagem de célula específica cálcio sinalização em sinapse tripartida do diafragma de rato

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Stimulus-specific Cortical Visual Evoked Potential Morphological Patterns

Padrões morfológicos do potencial evocado cortical Visual específico do estímulo

This paper presents a methodology for the recording and analysis of cortical visual evoked potentials (CVEPs) in response to various visual stimuli using ...