Name: morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea
Uploaded: 2019-05-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81770997, 81771016, 81830030); el proyecto de financiación conjunta de beijing Natural Science Foundation y Beijing Education Committee (KZ201810025040); la Fundación de Ciencias Naturales de Beijing (7174291); y la Fundación de Ciencia Postdoctoral de China (2016M601067).

Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía NRC/ILAR para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (8a Edición). El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica Capital, Beijing, China.
1. Selección de animales
<ol><li>Para todos los experimentos, utilice ratones macho c57BL/6J adultos (8 semanas de edad) como modelo animal. NOTA: Los ratones C57BL/6J que llevan una varia...

<ol>
	<li>Lie, A., Skogstad, M., Johnsen, T. S., Engdahl, B., Tambs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+notched+audiograms+in+a+cross-sectional+study+of+12,055+railway+workers.">The prevalence of notched audiograms in a cross-sectional study of 12,055 railway workers.</a> Ear and Hearing. 36 (3), 86-92 (2015).</li><li>Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+transduction,+tuning,+and+synaptic+transmission+in+the+mammalian+cochlea.">Hair cell transduction, tuning, and synaptic transmission in the mammalian cochlea.</a> Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).</li><li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cochlear+frequency+map+for+the+cat:+labeling+auditory-nerve+fibers+of+known+characteristic+frequency.">The cochlear frequency map for the cat: labeling auditory-nerve fibers of known characteristic frequency.</a> Journal of the Acoustical Society of America. 72 (5), 1441-1449 (1982).</li><li>Fettiplace, R., Kim, K. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+mechanoelectrical+transduction+channels+in+hearing.">The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing.</a> Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).</li><li>Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiological+place-frequency+map+of+the+cochlea+in+the+CBA/J+mouse.">A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse.</a> Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).</li><li>Viberg, A., Canlon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+guide+to+plotting+a+cochleogram.">The guide to plotting a cochleogram.</a> Hearing Research. 197 (1-2), 1-10 (2004).</li><li>Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+exposure+modulates+cochlear+inner+hair+cell+ribbon+volumes,+correlating+with+changes+in+auditory+measures+in+the+FVB/nJ+mouse.">Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse.</a> Scientific Reports. 6, 25056 (2016).</li><li>Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+after+noise+exposure:+acceleration+of+cochlear+synaptopathy+in+"recovered"+ears.">Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears.</a> Journal of Neuroscience. 35 (19), 7509-7520 (2015).</li><li>Wichmann, C., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+structure+and+function+of+inner+hair+cell+ribbon+synapses.">Relating structure and function of inner hair cell ribbon synapses.</a> Cell and Tissue Research. 361 (1), 95-114 (2015).</li><li>Matthews, G., Fuchs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+roles+of+ribbon+synapses+in+sensory+neurotransmission.">The diverse roles of ribbon synapses in sensory neurotransmission.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 812-822 (2010).</li><li>Liberman, L. D., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+maturation+of+auditory-nerve+heterogeneity,+as+seen+in+spatial+gradients+of+synapse+morphology+in+the+inner+hair+cell+area.">Postnatal maturation of auditory-nerve heterogeneity, as seen in spatial gradients of synapse morphology in the inner hair cell area.</a> Hearing Research. 339, 12-22 (2016).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximal+number+of+pre-synaptic+ribbons+are+formed+in+cochlear+region+corresponding+to+middle+frequency+in+mice.">Maximal number of pre-synaptic ribbons are formed in cochlear region corresponding to middle frequency in mice.</a> Acta Oto-Laryngologica. 138 (1), 25-30 (2018).</li><li>Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+synaptopathy+in+acquired+sensorineural+hearing+loss:+Manifestations+and+mechanisms.">Cochlear synaptopathy in acquired sensorineural hearing loss: Manifestations and mechanisms.</a> Hearing Research. 349, 138-147 (2017).</li><li>Moser, T., Starr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+neuropathy--neural+and+synaptic+mechanisms.">Auditory neuropathy--neural and synaptic mechanisms.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (3), 135-149 (2016).</li><li>Yu, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Gata3-Mafb+transcriptional+network+directs+post-synaptic+differentiation+in+synapses+specialized+for+hearing.">A Gata3-Mafb transcriptional network directs post-synaptic differentiation in synapses specialized for hearing.</a> Elife. 2, 01341 (2013).</li><li>Buniello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wbp2+is+required+for+normal+glutamatergic+synapses+in+the+cochlea+and+is+crucial+for+hearing.">Wbp2 is required for normal glutamatergic synapses in the cochlea and is crucial for hearing.</a> EMBO Molecular Medicine. 8 (3), 191-207 (2016).</li><li>Gilels, F., Paquette, S. T., Beaulac, H. J., Bullen, A., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+hearing+loss+and+outer+hair+cell+death+in+homozygous+Foxo3+knockout+mice+after+moderate+noise+exposure.">Severe hearing loss and outer hair cell death in homozygous Foxo3 knockout mice after moderate noise exposure.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1054 (2017).</li><li>Kane, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+effects+on+age-related+hearing+loss+associated+with+Cdh23+variants+in+mice.">Genetic background effects on age-related hearing loss associated with Cdh23 variants in mice.</a> Hearing Research. 283 (1-2), 80-88 (2012).</li><li>Jiang, X. W., Li, X. R., Zhang, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+of+ribbon+synapses+number+of+cochlear+hair+cells+in+C57BL/6J+mice+with+age+(Delta).">Changes of ribbon synapses number of cochlear hair cells in C57BL/6J mice with age (Delta).</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (10), 19058-19064 (2015).</li><li>Akil, O., Oursler, A., Fan, K., Lustig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+auditory+brainstem+response+testing.">Mouse auditory brainstem response testing.</a> BIO-Protocol. 6 (6), (2016).</li><li>Zhou, X., Jen, P. H. -. S., Seburn, K. L., Frankel, W. N., Zheng, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+brainstem+responses+in+10+inbred+strains+of+mice.">Auditory brainstem responses in 10 inbred strains of mice.</a> Brain Research. 1091 (1), 16-26 (2006).</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+dissection+and+immunofluorescence+of+the+adult+mouse+cochlea.">Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).</li><li>Schmitz, F., Konigstorfer, A., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIBEYE,+a+component+of+synaptic+ribbons:+a+protein's+journey+through+evolution+provides+insight+into+synaptic+ribbon+function.">RIBEYE, a component of synaptic ribbons: a protein's journey through evolution provides insight into synaptic ribbon function.</a> Neuron. 28 (3), 857-872 (2000).</li><li>Suzuki, J., Corfas, G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round-window+delivery+of+neurotrophin+3+regenerates+cochlear+synapses+after+acoustic+overexposure.">Round-window delivery of neurotrophin 3 regenerates cochlear synapses after acoustic overexposure.</a> Scientific Reports. 6, 24907 (2016).</li><li>Rutherford, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+structure+of+inner+ear+ribbon+synapses+with+STED+microscopy.">Resolving the structure of inner ear ribbon synapses with STED microscopy.</a> Synapse. 69 (5), 242-255 (2015).</li><li>Liberman, L. D., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+cochlear+synaptopathy+after+acoustic+overexposure.">Dynamics of cochlear synaptopathy after acoustic overexposure.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 16 (2), 205-219 (2015).</li><li>Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+Foxo3+causes+adult+onset+auditory+neuropathy+and+alters+cochlear+synapse+architecture+in+mice.">Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice.</a> Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).</li><li>Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin-3+regulates+ribbon+synapse+density+in+the+cochlea+and+induces+synapse+regeneration+after+acoustic+trauma.">Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+cochlear+synaptopathy:+an+early-onset+contributor+to+auditory+functional+decline.">Age-related cochlear synaptopathy: an early-onset contributor to auditory functional decline.</a> Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).</li><li>Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+cochlear+neuropathy+is+selective+for+fibers+with+low+spontaneous+rates.">Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).</li><li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adding+insult+to+injury:+cochlear+nerve+degeneration+after+"temporary"+noise-induced+hearing+loss.">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss.</a> Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li><li>Valero, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+cochlear+synaptopathy+in+rhesus+monkeys+(Macaca+mulatta).">Noise-induced cochlear synaptopathy in rhesus monkeys (Macaca mulatta).</a> Hearing Research. 353, 213-223 (2017).</li><li>Viana, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+neuropathy+in+human+presbycusis:+Confocal+analysis+of+hidden+hearing+loss+in+post-mortem+tissue.">Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue.</a> Hearing Research. 327, 78-88 (2015).</li><li>Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerated+synapses+between+postnatal+hair+cells+and+auditory+neurons.">Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (3), 321-329 (2013).</li><li>Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+murine+cochlear+explant+technique+as+an+in+vitro+screening+tool+in+hearing+research.">Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).</li><li>Takeda, S., Mannstr&#246;m, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Aging+and+Noise+Exposure+on+Auditory+Brainstem+Responses+and+Number+of+Presynaptic+Ribbons+in+Inner+Hair+Cells+of+C57BL/6J+Mice.">Effects of Aging and Noise Exposure on Auditory Brainstem Responses and Number of Presynaptic Ribbons in Inner Hair Cells of C57BL/6J Mice.</a> Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).</li><li>Mehraei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+brainstem+response+latency+in+noise+as+a+marker+of+cochlear+synaptopathy.">Auditory brainstem response latency in noise as a marker of cochlear synaptopathy.</a> Journal of Neuroscience. 36 (13), 3755-3764 (2016).</li></ol>

Dado que la sinaptoopatía coclear se caracterizó por primera vez en ratones adultos con un desplazamiento temporal de umbral (TTS) inducido por el ruido de banda de octava de 8 u201216 kHz a 100 dB SPL durante 2 h31, los investigadores han investigado cada vez más los efectos de la sinaptopatía en varios mamíferos, incluyendo monos y humanos32,33. Además de la exposición al ruido, varias otras condiciones se han asociado con la sina...

Las frecuencias en el rango de aproximadamente 20 u201220,000 Hz pueden ser percibidas como estímulos auditivos por los seres humanos. La audición humana es normalmente más sensible cerca de 1.000 Hz, donde el nivel medio de presión sonora es de 20 oP en adultos jóvenes (es decir, 0 decibelios de nivel de presión sonora [dB SPL]). En algunas condiciones patológicas, la pérdida auditiva está restringida a frecuencias específicas. Por ejemplo, en las primeras etapas de la pérdida auditiva inducida por ruido (NIHL), se puede observar una "notch" (es decir, elevación del umbral auditivo) en el audiograma a 4 kHz1. A lo largo de la partición coclear de mamíferos, sus gradaciones de rigidez y masa producen un mapa de frecuencia exponencial,con detección de sonido de alta frecuencia en la base de la cócleara y detección de baja frecuencia en el ápice 2. De hecho, hay un mapa de frecuencia de lugar coclear a lo largo de la membrana basilar, que conduce a lo que se conoce como organización tonotópica2,3. Cada lugar dado en la membrana basilar tiene la sensibilidad más alta a una sola frecuencia de sonido particular, que generalmente se denomina la frecuencia característica3,4, aunque también se pueden observar respuestas a otras frecuencias.
Hasta la fecha, se han empleado varios modelos de ratón para investigar la función normal, los procesos patológicos y la eficacia terapéutica en el sistema auditivo. El conocimiento preciso de los parámetros fisiológicos en la cócleara del ratón es un requisito previo para estos estudios de pérdida auditiva. La cócleara de ratón se divide anatómicamente en giros apicales, medios y basales, que corresponden a diferentes regiones de frecuencia. Mediante el etiquetado de los afferents de nervio auditivo en el núcleo coclear para analizar sus correspondientes sitios de inervación periférica en la cócleara, m'ller et al. lograron establecer el mapa de frecuencia de lugar coclear en el ratón normal in vivo5. En el intervalo de 7,2–61,8 kHz, que corresponde a posiciones entre el 90% y el 10% de la longitud total de la membrana basilar, el mapa de frecuencia de lugar coclear del ratón se puede describir mediante una simple función de regresión lineal, lo que sugiere una relación entre el distancia normalizada desde la base coclear y el ritmoritmo de la frecuencia característica5. En ratones de laboratorio, el mapa de frecuencia de lugar se puede utilizar para explorar la relación entre los umbrales auditivosdentro de rangos de frecuencia específicos y los cocleares que muestran el número de células pilosas que faltan en regiones relativas a lo largo de la membrana basilar 6. Es importante destacar que el mapa de frecuencia de lugar proporciona un sistema de posicionamiento para la investigación de daños estructurales mínimos, como daños en las sinapsis de la cinta de las células pilosas en lugares específicos de frecuencia coclear en ratones con trauma auditivo periférico7 ,8.
En la cóclea de mamíferos, las sinapsis de cinta se componen de una cinta presináptica, una proyección de electrones denso que ate un halo de vesículas sinápticas listas para liberación que contengan glutamato dentro del IHC, y una densidad postsináptica en el terminal nervioso de la SGN con receptores de glutamato9. Durante la transducción del sonido coclear, la desviación del haz de células pilosas resulta en la despolarización de IHC, que conduce a la liberación de glutamato de los IHC en los terminales aferentes postsinápticos, activando así la vía auditiva. La activación de esta vía conduce a la transformación de señales mecánicas inducidas por el sonido en un código de velocidad en el SGN10. De hecho, la sinapsis de cinta IHC está altamente especializada para la transmisión de sonido infatigable a velocidades de cientos de hercios con alta precisión temporal, y es de importancia crítica para los mecanismos presinápticos de codificación de sonido. Estudios anteriores han revelado que las sinapsis de cinta varían mucho en tamaño y número en diferentes regiones de frecuencia en la cócleara de ratón adulta11,12, probablemente reflejando la adaptación estructural a la codificación de sonido particular para necesidades de supervivencia. Recientemente, estudios experimentales en animales han demostrado que la sinaptopatía coclear contribuye a múltiples formas de deficiencias auditivas, incluyendo pérdida auditiva inducida por ruido, pérdida auditiva relacionada con la edad y pérdida auditiva hereditaria13, 14. Así, los métodos para identificar los cambios correlacionados en el número, la estructura y la función sinápticas en regiones de frecuencia específicas se han empleado cada vez más en estudios de desarrollo auditivo y enfermedad del oído interno, utilizando modelos generados a través de manipulación experimental de variables genéticas o ambientales15,16,17.
En el informe actual, presentamos un protocolo para analizar el número sináptico, la estructura y la función en una región de frecuencia específica de la membrana basilar en ratones adultos. La localización de frecuencia coclear se realiza utilizando un mapa de frecuencia de lugar determinado en combinación con un coclearografía. Las características morfológicas normales de las sinapsis de cinta coclear se evalúan mediante inmunomanchas presinápticas y postsinápticas. El estado funcional de las sinapsis de la cinta coclear se determina en función de las amplitudes supraumbral de la onda ABR I. Con alteraciones menores, este protocolo se puede utilizar para examinar condiciones fisiológicas o patológicas en otros modelos animales, incluyendo ratas, conejillos de indias y jerbos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:828px;" width="828">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ketamine hydrochloride</td>
			<td style="width:304px;">Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China</td>
			<td style="width:141px;">H35020148</td>
			<td style="width:167px;">100mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>X-1251</td>
			<td>10mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TDT physiology apparatus</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA</td>
			<td colspan="2">Auditory Physiology System III</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SigGen/BioSig software</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA</td>
			<td colspan="2">Auditory Physiology System III</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electric Pad</td>
			<td>Pet Fun</td>
			<td>11072931136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps 3#</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada</td>
			<td>0203-3-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps 5#</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada</td>
			<td>0209-5-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereo dissection microscope</td>
			<td>Nikon Corp., Tokyo, Japan</td>
			<td>SMZ1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat serum</td>
			<td>ZSGB-BIO, Beijing,China</td>
			<td>ZLI-9021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4</td>
			<td>Millipore Corp., Billerica, MA, USA</td>
			<td>MAB397</td>
			<td>mouse&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified Mouse Anti-CtBP2</td>
			<td>BD Biosciences, Billerica, MA, USA</td>
			<td>612044</td>
			<td>mouse&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>A21124</td>
			<td>goat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>A21131</td>
			<td>goat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting medium containing DAPI</td>
			<td>ZSGB-BIO, Beijing,China</td>
			<td>ZLI-9557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal fluorescent microscopy</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>TCS SP8 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image Pro Plus software</td>
			<td>Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA</td>
			<td>version 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Professional diagnostic pocket otoscope</td>
			<td>Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,China</td>
			<td>HS-OT10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle electrode</td>
			<td>Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi&#39;an,China</td>
			<td>1029</td>
			<td>20 mm, 28 G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Closed-field speaker</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA</td>
			<td>CF1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea

Las células del vello interno coclear (ICH) transmiten señales acústicas a las neuronas ganglionares espirales (SGN) a través de las sinapsis de cinta. Varios estudios experimentales han indicado que las sinapsis de células pilosas pueden ser los objetivos iniciales de la hipoacusia neurosensorial (SNHL). Tales estudios han propuesto el concepto de "sinaptoopatía" coclear, que se refiere a alteraciones en el número, estructura o función de la siinas de cinta que dan lugar a una transmisión sináptica anormal entre los IHC y los SCN. Si bien la sinaptoopatía coclear es irreversible, no afecta al umbral auditivo. En los modelos experimentales inducidos por ruido, se emplean daños restringidos a las sinapsis de IHC en regiones de frecuencia selectas para identificar los factores ambientales que causan específicamente la sinaptopatía, así como las consecuencias fisiológicas de perturbar este oído interno Circuito. Aquí, presentamos un protocolo para analizar la morfología sináptica coclear y la función en una región de frecuencia específica en ratones adultos. En este protocolo, la localización coclear de regiones de frecuencia específicas se realiza utilizando mapas de frecuencia de lugar junto con datos de coclearografía, tras los cuales las características morfológicas de las sinapsis de cinta se evalúan a través de sinápticas Immunostaining. El estado funcional de las sinapsis de cinta se determina entonces en función de las amplitudes de la respuesta auditiva del tronco cerebral (ABR) onda I. El presente informe demuestra que este enfoque puede utilizarse para profundizar nuestra comprensión de la patogénesis y los mecanismos de la disfunción sináptica en la cócleara, lo que puede ayudar en el desarrollo de nuevas intervenciones terapéuticas.

Se realizaron pruebas auditivas de ABR para 10 ratones C57BL/6J (8 semanas de edad) bajo anestesia. Los Abs se introdujeron utilizando estímulos de ráfaga de tono a 4, 8, 16, 32 y 48 kHz. El umbral auditivo de cada animal se detectó visualmente distinguiendo al menos una forma de onda clara en el ABR. Todos los ratones mostraron umbrales de ABR en respuesta a ráfagas de tono, que oscilan entre 25 y 70 dB SPL dependiendo de la frecuencia del estímulo. Nuestros resultados indicaron que el umbral auditivo<strong class=...

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Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

Este manuscrito describe un protocolo experimental para evaluar las características morfológicas y el estado funcional de las sinapsis de cinta en ratones normales. El modelo actual también es adecuado para modelos de sinaptopatía coclear inducidas por ruido y relacionados con la edad. También se discuten los resultados correlativos de estudios anteriores del ratón.

Evaluación morfológica y funcional de sinapsis de cinta en regiones de frecuencia específica de la Cóclea de Ratones

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

El informe principal es realmente la importancia del estrés de localizar con precisión la región de frecuencia específica de la membrana basilar en la mayoría de los modelos, donde se pueden analizar los números de sinapsis alterados y la función. La localización coclear de las regiones de frecuencia específicas se realiza de forma fiable utilizando mapas de frecuencias de lugar junto con los datos de cocleación. El microscopio proporciona información sobre varios estudios de investigación.Apoya la noción de que la neuropatía coclear es los eventos iniciales primarios específicamente anteriores a la pérdida auditiva, tinnitus e hiperacusis. Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del de la dedo del diente en un ratón macho C57 negro 6J adulto de ocho semanas anestesiado. Coloque el ratón en una almohadilla de calor de 37 grados centígrados en una habitación blindada eléctrica y acústicamente.A continuación, coloque un electrodo subdérmico de grabación de aguja de calibre 20 milímetros 28, con la profundidad de tres milímetros debajo de la piel en el vértice del cráneo. Un electrodo de referencia en la región parótida ipsilateral, debajo del pinna del oído medido y un electrodo de tierra en la región parótida contralateral. Coloque un altavoz de campo cerrado equipado con un tubo de plástico de dos centímetros con una punta en forma de cono junto al ratón y ajuste la punta en el canal auditivo externo.Para una respuesta de tronco encefálica auditiva, o grabación ABR, genere pips de tono en niveles de presión sonora decrecientes de 90 a 10 decibelios, en cinco a 10 decibelios de los pasos de nivel de presión sonora. Durante este paso, las respuestas se amplifican, filtran y promedian. En cada frecuencia, determine el umbral ABR, que es el nivel mínimo de presión sonora que da lugar a una grabación confiable ABR con una o más ondas distinguibles que se pueden identificar claramente mediante la inspección visual.Después de la grabación ABR, exponga la bulla desde el lado ventral y abra la bulla con tijeras afiladas para acceder a la cóclea. Usando fórceps finos, retire los huesos temporales y corta la arteria de las estapas. A continuación, retire las estapas de la ventana ovalada y rompa la membrana redonda de la ventana.Gire suavemente la punta de una aguja de calibre 13 milímetros 27 para hacer un pequeño agujero en el ápice de la cóclea, antes de usar una pipeta con punta fina para lavar suavemente el 4%paraformaldehído a través de la ventana en los espacios perilófaméticos. A continuación, enjuague los huesos tres veces durante cinco minutos por lavado con PBS molar 0.1 frío por lavado. Seguido de descalcificación de los huesos con 10%EDTA durante cuatro horas a temperatura ambiente y 20 rotaciones por minuto en una coctelera horizontal.Al final de la incubación, transfiera un hueso temporal descalcificado a PBS 0.1 molar fresco bajo un microscopio diseccionador. Utilice 3 y 5 fórceps Dumont y una aguja de calibre 27 para diseccionar las regiones de cóclea apical, media y basal a su vez. Utilice una cuchilla de afeitar para hacer una pequeña serie de cortes a lo largo del ligamento espiral y eliminar la membrana tectorial y la membrana de Reissner.Diseccionar aún más el epitelio auditivo restante, incluido el limbo espiral, en giros cocleares individuales para preparaciones de montaje completo. A continuación, utilice el objetivo de aceite 40X de un microscopio de luz para medir la longitud de la membrana basilar con una escala de 250 micrómetros colocada en la pieza ocular. Se puede ajustar a lo largo de la estereocilia de las células internas del cabello.Después de la disección, coloque cada giro coclear en tubos individuales de centrífuga de 2,5 mililitros. Bloquee cualquier unión no específica con 10% de suero de cabra en PBS en 0.1%Triton X-100 durante una hora a temperatura ambiente en un rotador. Al final de la incubación, utilice la punta de pipeta de 200 microlitrotros para extraer la solución bajo un microscopio de disección.Incubar los especímenes con los anticuerpos primarios de interés diluidos en 5% de suero de cabra y PBS en 0.1%Triton X-100 durante la noche a 4 grados Celsius en un rotador. A la mañana siguiente, enjuague las muestras de tejido tres veces durante cinco minutos con PBS molares fríos por lavado para eliminar cualquier anticuerpo primario residual. A continuación, etiquete los especímenes con los anticuerpos secundarios apropiados diluidos en suero de cabra al 5% en PBS en 0,1%Tritón X-100 durante dos a tres horas a temperatura ambiente en el rotador, protegido de la luz.Al final de la incubación, lave las muestras tres veces con 0,1 PBS molares como se ha demostrado y transfiera las muestras a placas individuales de 35 milímetros que contengan 0,1 PBS molares. Coloque una gota de medio de montaje suplementado con DAPI en la corredera y transfiera las muestras de PBS al medio de montaje. Coloque un borde de un resbalón de cubierta en cada diapositiva y suéltelo para dejar que los resbalones de la cubierta caigan suavemente.A continuación, seque los portaobjetos en una caja deslizante a cuatro grados centígrados durante la noche. Para crear imágenes de las muestras, utilice un microscopio confocal con los láseres apropiados y una lente de inmersión de aceite de alta resolución 63X para adquirir pilas Z confocales de ocho micrómetros de cada giro coclear. Para los recuentos de puncta sináptica, establezca las pilas Z con el tamaño de paso de 0,3 micrómetros para abarcar toda la longitud de las células internas del cabello, asegurando que todo el puncta sináptico se pueda crear una imagen y combine las imágenes puncta que contienen en una pila Z para obtener la proyección de acceso Z.Importe las imágenes combinadas en un programa de software de procesamiento de imágenes adecuado. Divida los recuentos totales sinápticos en cada pila Z en regiones de frecuencia específicas por el número de células pilosas internas positivas DAPI para calcular el número de puncta sináptica para cada célula. En cada región de frecuencia específica, promedia toda la puncta sináptica en tres imágenes de diferentes campos microscópicos, que contienen de nueve a 11 células pilosas internas.Para visualizar mejor la arquitectura citoesquelética y la localización sináptica, utilice la herramienta de cepillo para evaluar visualmente la estructura sináptica y la distribución de las células internas individuales del cabello. Para inspeccionar la yuxtaposición de cintas presinápticas y parches de receptores postsinápticos, utilice la herramienta de marquesina rectangular extraer el espacio de voxel alrededor de las cintas y utilizar el corte de imágenes para aislar las cintas individuales. A continuación, haga clic en el tamaño de la imagen y la imagen para adquirir una matriz de miniaturas de estas proyecciones en miniatura que se pueden utilizar para identificar sinapsis emparejadas frente a cintas huérfanas.Los diez ratones en este experimento representativo exhibieron umbrales ABR en respuesta a ráfagas de tono que oscilan entre 25 y 70 decibelios por nivel de presión sonora dependiendo de la frecuencia del estímulo. El umbral auditivo de este experimento fue más bajo, con un valor de 16 kilohercios, correspondiente a aproximadamente el 43% de la distancia desde el ápice coclear, lo que sugiere que la sensibilidad acústica se reduce significativamente en otras regiones cocleares. Las monturas enteras del epitelio auditivo se diseccionan en tres piezas y las longitudes se miden y se convierten en su porcentaje de distancia desde el ápice coclear.La ubicación de frecuencia en la membrana basilar de cada giro coclear se calcula utilizando la función logarítmica. En los oídos normales de ratones adultos, la inmunosumanidad revela pares yuxtapuestos de cintas sinápticas y parches receptores de glutamato. Estudio de la superficie de la membrana basolateral de las células internas del cabello, con ocho a 20 pares por célula.Aunque la gran mayoría de los puncta aparecen como pares yuxtapuestos en oídos normales, las cintas huérfanas se observan con poca frecuencia con aumentos altos. El número de sinapsis de cinta de células capilares internas es más alto en la región de 16 kilohercios y disminuye significativamente a medida que aumenta la distancia desde esta ubicación. Lo más importante a recordar durante este procedimiento es que uno debe garantizar la integridad de la membrana basal coclear.Tenemos que enfatizar la precisión hasta que se alcance la competencia técnica. Después de este procedimiento, se puede realizar la terapia génica para responder si la neuropatía coclear puede ser reparada por esta medida. Esta medida es una técnica más amplia para explorar la neuropatía coclear, que si los eventos iniciales primarios se asocian con tener pérdida de audición, tinnitus e hiperacusis.

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Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse

Grabaciones postsinápticos en las dendritas aferentes cocleares ponerse en contacto con las células ciliadas internas: Comunicado de Vigilancia multivesiculares en una sinapsis cinta

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the ...

Investigación

Neurociencias

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Fundición cerebrovascular del ratón adulto de imágenes en 3D y el análisis morfológico

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Actividad telomerasa en las diversas regiones del cerebro de ratón: La telomerasa no radiactivo Repetir Protocolo de Amplificación (TRAP) Ensayo

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

Evaluación funcional y morfológica de Diafragma Inervación por frénico neuronas motoras

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Resolución de alta Análisis Cuantitativo Inmunoelectrónica de Receptores de Membrana en la retina cinta sinapsis

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Todo el montaje La disección y de inmunofluorescencia del Adulto ratón cóclea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Aislamiento Inmunomagnética rápida y específica de los oligodendrocitos primarios de ratón

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Evaluación funcional de las vías olfatorias en los renacuajos de Xenopus de vida

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Proyección de imagen del calcio celular específicos de señalización en la sinapsis tripartita del diafragma del ratón

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Stimulus-specific Cortical Visual Evoked Potential Morphological Patterns

Patrones morfológicos potenciales evocados visuales corticales específicos del estímulo

This paper presents a methodology for the recording and analysis of cortical visual evoked potentials (CVEPs) in response to various visual stimuli using ...