Name: morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea
Uploaded: 2019-05-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation i Kina (81770997, 81771016, 81830030); det gemensamma finansierings projektet för Beijing Natural Science Foundation och Pekings utbildningskommitté (KZ201810025040); Naturvetenskaps stiftelsen i Peking (7174291); och China postdoc Science Foundation (2016M601067).

Alla procedurer utfördes i enlighet med NRC/ILAR guide för vård och användning av försöksdjur (8: e upplagan). Studieprotokollet godkändes av den institutionella djuromsorg och användning kommitté av Capital Medical University, Peking, Kina.
1. Val av djur
<ol><li>För alla experiment, Använd vuxna C57BL/6J hanmöss (8 veckor gamla) som djurmodell. Anmärkning: C57BL/6j möss som transporterar en skarvning variant av Cdh23 uppvisar accelererad åldras i...

<ol>
	<li>Lie, A., Skogstad, M., Johnsen, T. S., Engdahl, B., Tambs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+notched+audiograms+in+a+cross-sectional+study+of+12,055+railway+workers.">The prevalence of notched audiograms in a cross-sectional study of 12,055 railway workers.</a> Ear and Hearing. 36 (3), 86-92 (2015).</li><li>Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+transduction,+tuning,+and+synaptic+transmission+in+the+mammalian+cochlea.">Hair cell transduction, tuning, and synaptic transmission in the mammalian cochlea.</a> Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).</li><li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cochlear+frequency+map+for+the+cat:+labeling+auditory-nerve+fibers+of+known+characteristic+frequency.">The cochlear frequency map for the cat: labeling auditory-nerve fibers of known characteristic frequency.</a> Journal of the Acoustical Society of America. 72 (5), 1441-1449 (1982).</li><li>Fettiplace, R., Kim, K. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+mechanoelectrical+transduction+channels+in+hearing.">The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing.</a> Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).</li><li>Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiological+place-frequency+map+of+the+cochlea+in+the+CBA/J+mouse.">A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse.</a> Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).</li><li>Viberg, A., Canlon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+guide+to+plotting+a+cochleogram.">The guide to plotting a cochleogram.</a> Hearing Research. 197 (1-2), 1-10 (2004).</li><li>Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+exposure+modulates+cochlear+inner+hair+cell+ribbon+volumes,+correlating+with+changes+in+auditory+measures+in+the+FVB/nJ+mouse.">Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse.</a> Scientific Reports. 6, 25056 (2016).</li><li>Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+after+noise+exposure:+acceleration+of+cochlear+synaptopathy+in+"recovered"+ears.">Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears.</a> Journal of Neuroscience. 35 (19), 7509-7520 (2015).</li><li>Wichmann, C., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+structure+and+function+of+inner+hair+cell+ribbon+synapses.">Relating structure and function of inner hair cell ribbon synapses.</a> Cell and Tissue Research. 361 (1), 95-114 (2015).</li><li>Matthews, G., Fuchs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+roles+of+ribbon+synapses+in+sensory+neurotransmission.">The diverse roles of ribbon synapses in sensory neurotransmission.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 812-822 (2010).</li><li>Liberman, L. D., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+maturation+of+auditory-nerve+heterogeneity,+as+seen+in+spatial+gradients+of+synapse+morphology+in+the+inner+hair+cell+area.">Postnatal maturation of auditory-nerve heterogeneity, as seen in spatial gradients of synapse morphology in the inner hair cell area.</a> Hearing Research. 339, 12-22 (2016).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximal+number+of+pre-synaptic+ribbons+are+formed+in+cochlear+region+corresponding+to+middle+frequency+in+mice.">Maximal number of pre-synaptic ribbons are formed in cochlear region corresponding to middle frequency in mice.</a> Acta Oto-Laryngologica. 138 (1), 25-30 (2018).</li><li>Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+synaptopathy+in+acquired+sensorineural+hearing+loss:+Manifestations+and+mechanisms.">Cochlear synaptopathy in acquired sensorineural hearing loss: Manifestations and mechanisms.</a> Hearing Research. 349, 138-147 (2017).</li><li>Moser, T., Starr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+neuropathy--neural+and+synaptic+mechanisms.">Auditory neuropathy--neural and synaptic mechanisms.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (3), 135-149 (2016).</li><li>Yu, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Gata3-Mafb+transcriptional+network+directs+post-synaptic+differentiation+in+synapses+specialized+for+hearing.">A Gata3-Mafb transcriptional network directs post-synaptic differentiation in synapses specialized for hearing.</a> Elife. 2, 01341 (2013).</li><li>Buniello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wbp2+is+required+for+normal+glutamatergic+synapses+in+the+cochlea+and+is+crucial+for+hearing.">Wbp2 is required for normal glutamatergic synapses in the cochlea and is crucial for hearing.</a> EMBO Molecular Medicine. 8 (3), 191-207 (2016).</li><li>Gilels, F., Paquette, S. T., Beaulac, H. J., Bullen, A., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+hearing+loss+and+outer+hair+cell+death+in+homozygous+Foxo3+knockout+mice+after+moderate+noise+exposure.">Severe hearing loss and outer hair cell death in homozygous Foxo3 knockout mice after moderate noise exposure.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1054 (2017).</li><li>Kane, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+effects+on+age-related+hearing+loss+associated+with+Cdh23+variants+in+mice.">Genetic background effects on age-related hearing loss associated with Cdh23 variants in mice.</a> Hearing Research. 283 (1-2), 80-88 (2012).</li><li>Jiang, X. W., Li, X. R., Zhang, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+of+ribbon+synapses+number+of+cochlear+hair+cells+in+C57BL/6J+mice+with+age+(Delta).">Changes of ribbon synapses number of cochlear hair cells in C57BL/6J mice with age (Delta).</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (10), 19058-19064 (2015).</li><li>Akil, O., Oursler, A., Fan, K., Lustig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+auditory+brainstem+response+testing.">Mouse auditory brainstem response testing.</a> BIO-Protocol. 6 (6), (2016).</li><li>Zhou, X., Jen, P. H. -. S., Seburn, K. L., Frankel, W. N., Zheng, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+brainstem+responses+in+10+inbred+strains+of+mice.">Auditory brainstem responses in 10 inbred strains of mice.</a> Brain Research. 1091 (1), 16-26 (2006).</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+dissection+and+immunofluorescence+of+the+adult+mouse+cochlea.">Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).</li><li>Schmitz, F., Konigstorfer, A., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIBEYE,+a+component+of+synaptic+ribbons:+a+protein's+journey+through+evolution+provides+insight+into+synaptic+ribbon+function.">RIBEYE, a component of synaptic ribbons: a protein's journey through evolution provides insight into synaptic ribbon function.</a> Neuron. 28 (3), 857-872 (2000).</li><li>Suzuki, J., Corfas, G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round-window+delivery+of+neurotrophin+3+regenerates+cochlear+synapses+after+acoustic+overexposure.">Round-window delivery of neurotrophin 3 regenerates cochlear synapses after acoustic overexposure.</a> Scientific Reports. 6, 24907 (2016).</li><li>Rutherford, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+structure+of+inner+ear+ribbon+synapses+with+STED+microscopy.">Resolving the structure of inner ear ribbon synapses with STED microscopy.</a> Synapse. 69 (5), 242-255 (2015).</li><li>Liberman, L. D., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+cochlear+synaptopathy+after+acoustic+overexposure.">Dynamics of cochlear synaptopathy after acoustic overexposure.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 16 (2), 205-219 (2015).</li><li>Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+Foxo3+causes+adult+onset+auditory+neuropathy+and+alters+cochlear+synapse+architecture+in+mice.">Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice.</a> Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).</li><li>Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin-3+regulates+ribbon+synapse+density+in+the+cochlea+and+induces+synapse+regeneration+after+acoustic+trauma.">Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+cochlear+synaptopathy:+an+early-onset+contributor+to+auditory+functional+decline.">Age-related cochlear synaptopathy: an early-onset contributor to auditory functional decline.</a> Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).</li><li>Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+cochlear+neuropathy+is+selective+for+fibers+with+low+spontaneous+rates.">Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).</li><li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adding+insult+to+injury:+cochlear+nerve+degeneration+after+"temporary"+noise-induced+hearing+loss.">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss.</a> Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li><li>Valero, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+cochlear+synaptopathy+in+rhesus+monkeys+(Macaca+mulatta).">Noise-induced cochlear synaptopathy in rhesus monkeys (Macaca mulatta).</a> Hearing Research. 353, 213-223 (2017).</li><li>Viana, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+neuropathy+in+human+presbycusis:+Confocal+analysis+of+hidden+hearing+loss+in+post-mortem+tissue.">Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue.</a> Hearing Research. 327, 78-88 (2015).</li><li>Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerated+synapses+between+postnatal+hair+cells+and+auditory+neurons.">Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (3), 321-329 (2013).</li><li>Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+murine+cochlear+explant+technique+as+an+in+vitro+screening+tool+in+hearing+research.">Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).</li><li>Takeda, S., Mannstr&#246;m, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Aging+and+Noise+Exposure+on+Auditory+Brainstem+Responses+and+Number+of+Presynaptic+Ribbons+in+Inner+Hair+Cells+of+C57BL/6J+Mice.">Effects of Aging and Noise Exposure on Auditory Brainstem Responses and Number of Presynaptic Ribbons in Inner Hair Cells of C57BL/6J Mice.</a> Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).</li><li>Mehraei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+brainstem+response+latency+in+noise+as+a+marker+of+cochlear+synaptopathy.">Auditory brainstem response latency in noise as a marker of cochlear synaptopathy.</a> Journal of Neuroscience. 36 (13), 3755-3764 (2016).</li></ol>

Eftersom Cochlear synaptopati först karakteriserades hos vuxna möss med en tillfällig tröskel förskjutning (TTS) inducerad av 8 \ u201216 kHz oktavband brus vid 100 dB SPL för 2 h31, forskare har alltmer undersökt effekterna av synaptopati i olika däggdjur, inklusive apor och människor32,33. Förutom bullerexponering, flera andra villkor har förknippats med Cochlear synaptopati (t. ex., åldrande, användning av Ototoxiska läkem...

Frekvenser i intervallet cirka 20 u201220 000 Hz kan uppfattas som auditiva stimuli av människor. Mänsklig hörsel är normalt mest känslig nära 1 000 Hz, där den genomsnittliga ljudtrycksnivån är 20 μPa hos unga vuxna (dvs 0 decibel av ljudtrycksnivå [dB SPL]). Vid vissa sjukdomstillstånd är hörselnedsättning begränsad till specifika frekvenser. Till exempel, i de tidiga stadierna av Bullerorsakad hörselnedsättning (NIHL), kan ett "snäpp" (dvs. hörsel tröskel höjning) observeras i audiogrammet vid 4 kHz1. Längs med Cochlears däggdjurs-partition, ger dess graderingar av styvhet och massa en exponentiell frekvens karta, med högfrekvent ljuddetektering vid basen av snäckan och lågfrekventa detektering vid Apex2. Det finns faktiskt en Cochlear plats-frekvenskarta längs basilaris membran, vilket leder till vad som kallas tonotopic organisation2,3. Varje given förlägger på det basilaris membranen har den högsta känsligheten till endast en bestämd solid frekvens, som kallas vanligt den karakteristiska frekvensen3,4, även om svar till andra frekvenser kan också observeras.
Hittills har olika musmodeller använts för att undersöka normal funktion, patologiska processer och terapeutisk effekt i hörselsystemet. Exakt kunskap om fysiologiska parametrar i musen snäckan är en förutsättning för sådana studier av hörselnedsättning. Musen snäckan är anatomiskt uppdelad i apikala, mellersta, och basal varv, som motsvarar olika frekvensområden. Genom att märka hörselnerven afferenter vid Cochlear Nucleus för att analysera deras motsvarande perifera innervation platser i cochlea, Müller et al. lyckades etablera Cochlear plats-frekvenskarta i den normala musen in vivo5. I intervallet 7.2 – 61.8 kHz, vilket motsvarar positionerna mellan 90% och 10% av den fulla längden av basilaris membran, kan mus Cochlear plats-frekvenskarta beskrivas med en enkel linjär Regressions funktion, vilket tyder på en relation mellan normaliserat avstånd från cochleaimbasen och logaritmen av den karakteristiska frekvensen5. I laboratoriemöss kan plats-frekvenskartan användas för att undersöka sambandet mellan hörsel trösklar inom specifika frekvensområden och cochleogram som visar antalet saknade hårceller i relativa regioner längs basilaris membran6. Viktigt, plats-frekvenskartan ger ett positioneringssystem för utredning av minimal strukturell skada, såsom skador på bandet synapser av hårceller vid specifika Cochlear frekvens platser i möss med perifera hörseltrauma7 ,8.
I däggdjur cochlea, band synapser består av ett presynaptiskt band, en elektron-tät projektion som tjusar en Gloria av release-Ready synaptiska blåsor som innehåller glutamat inom IHC, och en postsynaptisk densitet på nerven terminalen i SGN med glutamatreceptorer9. Under Cochlears ljudtransduktion leder avböjning av hår cells paketet till IHC depolarisering, vilket leder till att glutamat frigörs från IHCs till postsynaptiska afferenta terminaler, vilket aktiverar hörselgången. Aktiveringen av denna väg leder till omvandlingen av ljudinducerade mekaniska signaler till en tariff kod i SGN10. Faktum är att IHC Ribbon synaps är mycket specialiserade för Indefatigable ljudöverföring till priser av hundratals Hertz med hög temporal precision, och är av avgörande betydelse för presynaptiska mekanismer för ljudkodning. Tidigare studier har visat att band synapser varierar kraftigt i storlek och antal i olika frekvensområden i den vuxna musen snäckan11,12, sannolikt återspeglar strukturell anpassning till särskilda ljudkodning för överlevnadsbehov. Nyligen har experimentella djurstudier visat att cochleaimsynaptopati bidrar till flera former av hörselskador, inklusive Bullerorsakad hörselnedsättning, åldersrelaterade hörselnedsättning, och ärftlig hörselnedsättning13, 14. metoder för att identifiera korrelerade förändringar i synaptiska tal, struktur och funktion vid specifika frekvensområden har därför blivit alltmer sysselsatta i studier av hörsel utveckling och inre öronsjukdomar, med hjälp av modeller som genererats via experimentell manipulation av genetiska eller miljövariabler15,16,17.
I den aktuella rapporten presenterar vi ett protokoll för analys av synaptiska tal, struktur och funktion vid en specifik frekvens region i basilaris membran hos vuxna möss. Cochlears frekvens lokalisering utförs med en given plats-frekvenskarta i kombination med ett cochleogram. De normala morfologiska egenskaperna hos Cochlear Ribbon synapser utvärderas via presynaptiska och postsynaptiska immunofärgning. Den funktionella statusen för Cochlear Ribbon synapser bestäms baserat på suprathreshold amplituder av ABR Wave I. Med smärre förändringar, detta protokoll kan användas för att undersöka fysiologiska eller patologiska tillstånd i andra djurmodeller, inklusive råttor, marsvin, och gerbils.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:828px;" width="828">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ketamine hydrochloride</td>
			<td style="width:304px;">Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China</td>
			<td style="width:141px;">H35020148</td>
			<td style="width:167px;">100mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>X-1251</td>
			<td>10mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TDT physiology apparatus</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA</td>
			<td colspan="2">Auditory Physiology System III</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SigGen/BioSig software</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA</td>
			<td colspan="2">Auditory Physiology System III</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electric Pad</td>
			<td>Pet Fun</td>
			<td>11072931136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps 3#</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada</td>
			<td>0203-3-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps 5#</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada</td>
			<td>0209-5-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereo dissection microscope</td>
			<td>Nikon Corp., Tokyo, Japan</td>
			<td>SMZ1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat serum</td>
			<td>ZSGB-BIO, Beijing,China</td>
			<td>ZLI-9021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4</td>
			<td>Millipore Corp., Billerica, MA, USA</td>
			<td>MAB397</td>
			<td>mouse&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified Mouse Anti-CtBP2</td>
			<td>BD Biosciences, Billerica, MA, USA</td>
			<td>612044</td>
			<td>mouse&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>A21124</td>
			<td>goat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>A21131</td>
			<td>goat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting medium containing DAPI</td>
			<td>ZSGB-BIO, Beijing,China</td>
			<td>ZLI-9557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal fluorescent microscopy</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>TCS SP8 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image Pro Plus software</td>
			<td>Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA</td>
			<td>version 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Professional diagnostic pocket otoscope</td>
			<td>Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,China</td>
			<td>HS-OT10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle electrode</td>
			<td>Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi&#39;an,China</td>
			<td>1029</td>
			<td>20 mm, 28 G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Closed-field speaker</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA</td>
			<td>CF1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea

Cochlear inre hårceller (IHCs) överföra akustiska signaler till spiral ganglion neuroner (SGNs) genom band synapser. Flera experimentella studier har indikerat att hår cells synapser kan vara de initiala målen i sensorineural nedsättning hörselnedsättning (SNHL). Sådana studier har föreslagit begreppet Cochlear "synaptopati", som hänvisar till förändringar i band synaps antal, struktur, eller funktion som resulterar i onormal synaptisk transmission mellan ihcs och Sgns. Medan Cochlear synaptopati är oåterkallelig, det påverkar inte hörsel tröskeln. I bullerinducerade experimentella modeller används begränsade skador på IHC-synapser i utvalda frekvensområden för att identifiera de miljöfaktorer som specifikt orsakar synaptopati, samt de fysiologiska konsekvenserna av att störa detta inneröra Krets. Här presenterar vi ett protokoll för att analysera cochleaimsynaptisk morfologi och funktion vid ett specifikt frekvensområde hos vuxna möss. I detta protokoll utförs Cochlear lokalisering av specifika frekvensområden med hjälp av plats frekvens kartor tillsammans med cochleogramdata, varefter de morfologiska egenskaperna hos band synapser utvärderas via synaptiska immun. Den funktionella status av band synapser bestäms sedan baserat på amplituderna av auditiva hjärnstammen svar (ABR) Wave I. Den nuvarande rapporten visar att detta tillvägagångssätt kan användas för att fördjupa vår förståelse av patogenesen och mekanismerna för synaptisk dysfunktion i cochlea, som kan hjälpa till att utveckla nya terapeutiska interventioner.

ABR hörseltest utfördes för 10 C57BL/6J möss (8 veckors ålder) under anestesi. ABRs uppnåddes med hjälp av Tone burst stimuli vid 4, 8, 16, 32 och 48 kHz. Hörseln tröskeln för varje djur upptäcktes visuellt genom att skilja minst en klar vågform i ABR. Alla möss uppvisade ABR trösklar som svar på tonen skurar, som sträcker sig mellan 25 och 70 dB SPL beroende på frekvensen av stimulans. Våra resultat indikerade att hörsel tröskeln var lägst vid 16 kHz (figur 1), motsvara...

Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea at JoVE.com

Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

Detta manuskript beskriver ett experimentellt protokoll för att utvärdera morfologiska egenskaper och funktionell status för band synapser i normala möss. Den nuvarande modellen är också lämplig för buller-inducerad och åldersrelaterade Cochlear synaptopati-begränsade modeller. De relativa resultaten av tidigare mus studier diskuteras också.

Morfologisk och funktionell utvärdering av band synapser vid specifika frekvensområden i Mouse cochlea

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

Den primära rapporten är verkligen stress betydelse för att exakt lokalisera den specifika frekvensregionen av basilarmembranet i de flesta modeller, där synapsnummer ändras och funktion kan analyseras. Cochlear lokalisering av de specifika frekvensregionerna utförs tillförlitligt med hjälp av, placera frekvens kartor i samband med cochleogram data. Mikroskopet ger insikt i flera forskningsstudier.Det stöder uppfattningen att cochlear neurotoxiskt är de primära inledande händelserna specifikt före hörselnedsättning, tinnitus och hyperakus. Efter att ha bekräftat en brist på svar på tå nypa i en sövd åtta veckor gammal vuxen C57 svart 6J manliga musen. Placera musen på en 37 graders celsius värmedyna i ett elektriskt och akustiskt avskärmat rum.Därefter placera en subdermal 20 millimeter 28 gauge nål inspelning elektrod, med djupet av tre millimeter under huden vid skallens vertex. En referenselektrod i ipsilateral parotidregionen, under pinna av uppmätt öra och en jordelektrod i den kontralaterala parotidregionen. Placera en sluten fälthögtalare utrustad med ett två centimeter plaströr med en konformad spets bredvid musen och passa in spetsen i den yttre hörselgången.För en auditiv hjärnstammen svar, eller ABR inspelning, generera ton pips på minskande ljudtrycknivåer från 90 till 10 decibel, i fem till 10 decibel ljud trycknivå steg. Under det här steget förstärks, filtreras och medelvärden av svaren. Vid varje frekvens, bestäm ABR-tröskeln, som är den minimala ljudtrycksnivå som resulterar i en tillförlitlig ABR-inspelning med en eller flera urskiljbara vågor som tydligt kan identifieras genom visuell inspektion.Efter ABR inspelningen, exponera bulla från ventrala sidan och öppna bulla med vass sax för att få tillgång till snäckan. Med hjälp av fina tärningar, ta bort de temporala ben och bryta stapes artär. Ta sedan bort stapes från det ovala fönstret och brista det runda fönstret membran.Rotera försiktigt spetsen på en 13 millimeter 27 gauge nål för att göra ett litet hål vid spetsen av snäckan, innan du använder en fin tippade pipett att försiktigt spola 4%paraformaldehyd genom fönstret i perilymphatic utrymmen. Därefter sköljer du benen tre gånger i fem minuter per tvätt med kall färsk 0,1 molar PBS per tvätt. Följt av dekalcifiering av benen med 10%EDTA i fyra timmar vid rumstemperatur och 20 rotationer per minut på en horisontell shaker.Vid slutet av inkubationen överför du ett dekalcifierat tinningben till färskt 0,1 molar PBS under ett dissekerande mikroskop. Använd 3 och 5 Dumont-forceps och en 27 gauge nål för att dissekera de apikala, mellersta och basala snäckan regionerna i sin tur. Använd ett rakblad för att göra en liten serie av snitt längs spiral ligament och ta bort tectorial membran och Reissners membran.Vidare dissekera de återstående auditiva epitel, inklusive spiral limbus, i enskilda cochlear varv för hela montera preparat. Använd sedan 40X oljemål för ett ljusmikroskop för att mäta basilarmembranets längd med 250 mikrometerskala placerad i ögonbiten. Den kan justeras längs stereocilia av de inre hårcellerna.Efter dissektion, placera varje cochlear förvandlas till enskilda 2,5 milliliter centrifugrör. Blockera eventuell ospecifik bindning med 10%getserum i PBS i 0,1%Triton X-100 i en timme vid rumstemperatur på en rotator. I slutet av inkubationen, använd 200 mikroliterpipetss för att avlägsna lösningen under ett dissektionmikroskop.Inkubera exemplaren med de primära antikropparna av ränta utspädd i 5%getserum och PBS i 0,1%Triton X-100 över natten vid 4 grader Celsius på en rotator. Nästa morgon, skölj vävnadsproverna tre gånger i fem minuter med kall 0,1 molar PBS per tvätt för att avlägsna eventuella kvarvarande primära antikroppar. Märk sedan ut exemplaren med lämpliga sekundära antikroppar utspädda i 5%getserum i PBS i 0,1%Triton X-100 i två till tre timmar i rumstemperatur på rotatorn, skyddad från ljus.Vid slutet av inkubationen, tvätta proverna tre gånger med 0,1 molar PBS som påvisas och överföra exemplaren i enskilda 35 millimeters plattor som innehåller 0,1 molar PBS. Placera en droppe DAPI kompletterat monteringsmedium på objektglaset och överför proverna från PBS till monteringsmediet. Placera ena kanten av en lucka glida på varje bild och släpp för att låta locket glider falla försiktigt.Torka sedan rutschkanorna i en ruta i fyra grader Celsius över natten. För att avbilda exemplaren, använd en konfokal mikroskop med lämpliga lasrar och 63X högupplöst olja nedsänkning lins för att förvärva åtta micrometer confocal Z staplar från varje cochlear tur. För synaptic puncta räknas, ställ in Z-stackarna med 0,3 mikrometer stegstorleken att spänna över hela längden av inre hårceller, försäkra alla av synaptiska puncta kan avbildas och slå samman puncta som innehåller bilder i en Z-stack för att få Z tillgång projektion.Importera de sammanslagna bilderna till ett lämpligt program för bildbehandlingsprogram. Dela de synaptiska totala antalet i varje Z-stack vid specifika frekvensregioner med antalet DAPI-positiva inre hårceller för att beräkna antalet synaptiska puncta för varje cell. Vid varje specifik frekvensregion, medelvärde alla av synaptiska puncta i tre bilder av olika mikroskopiska fält, som innehåller nio till 11 inre hårceller.För att bättre visualisera den cytoskeleala arkitekturen och synaptiska lokaliseringen, använd penselverktyget för att visuellt bedöma synaptisk struktur och fördelning av de enskilda inre hårcellerna. För att inspektera sammanställningen av presynaptiska band och postsynaptiska receptorplåster, använd det rektangulära markeringsramsverktyget extrahera voxel-utrymmet runt banden och använd bildskärning för att isolera de enskilda banden. Klicka sedan på bild och bildstorlek för att förvärva en miniatyr array av dessa miniatyrprojektioner som kan användas för att identifiera parade synapser kontra föräldralösa band.Alla tio av mössen i detta representativa experiment uppvisade ABR-trösklar som svar på tonskurar som sträcker sig mellan 25 och 70 decibel per ljudtrycksnivå beroende på frekvensen av stimulansen. Förhandlingen tröskeln för detta experiment var lägst på 16 kilohertz motsvarar en cirka 43%av avståndet från cochlear apex, vilket tyder på att den akustiska känsligheten minskas avsevärt i andra cochlear regioner. Hela fästen av hörselepeplet dissekeras i tre stycken och längderna mäts och omvandlas till sitt procentavstånd från cochlear-apexet.Frekvensplatsen på basilarmembranet i varje cochlear-sväng beräknas med hjälp av logaritmisk funktion. I normala öron av vuxna möss, avslöjar immunfärgning juxtaposed par av synaptiska band och glutamat receptor patchar. Studera ytan av basolateralmembranet i de inre hårcellerna, med åtta till 20 par per cell.Även om de allra flesta av punktexan visas som juxtaposed par i normala öron, föräldralösa band sällan observeras vid höga förstoringar. Antalet inre hårcell band synapser är högst på 16 kilohertz regionen och minskar avsevärt när avståndet från denna plats ökar. Det viktigaste att komma ihåg under detta förfarande är att man måste garantera integriteten hos cochlear basalmembran.Vi måste betona noggrannhet tills tekniska kunskaper har uppnåtts. Efter denna procedur kan genterapin utföras för att svara på om den cochlear neurotoxiskt kan repareras genom denna åtgärd. Detta mått är bredare teknik för att utforska cochlear neuropati, som om de primära inledande händelserna förknippar med att ha hörselnedsättning, tinnitus, och hyperakus.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Neuroscience

Unit 1

The Special Senses

SCIENTISTS IN ACTION

Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse

Postsynaptiska Inspelningar på Afferent Dendrites Kontakta Cochlear inre hårcellerna: Övervakning Multivesicular Släpp på ett band Synapse

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the ...

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Cerebrovaskulära Gjutning av de vuxna mus för 3D-avbildning och morfologisk analys

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerasaktivitet i de olika regionerna i Mouse Brain: Ej Radioaktiv Telomeras Upprepa Amplification Protocol (TRAP) analys

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

Funktionell och morfologisk Bedömning av Membran Innervation av Phrenic motorneuroner

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Högupplösta Kvantitativ immunogold Analys av membranreceptorer på näthinnan Ribbon synapser

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Hela Mount Dissekering och Immunofluorescence i vuxen mus Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Snabb och specifika immunmagnetisk isolering av mus primära oligodendrocyter

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Funktionell utvärdering av lukt vägar i levande Xenopus grodyngel

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Avbildning av Cell-specifika Calcium signalering vid trepartsavtal synapsen av mus membranet

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Stimulus-specific Cortical Visual Evoked Potential Morphological Patterns

Stimulus-specifika kortikala visuella framkallat potentiella morfologiska mönster

This paper presents a methodology for the recording and analysis of cortical visual evoked potentials (CVEPs) in response to various visual stimuli using ...