Name: morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea
Uploaded: 2019-05-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea at JoVE.com

Bu çalışma Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (81770997, 81771016, 81830030) tarafından destekleniyordu; Pekin doğal Bilim Vakfı ve Pekin Eğitim Komitesi (KZ201810025040) ortak fon projesi; Pekin doğal Bilim Vakfı (7174291); ve Çin doktora sonrası Bilim Vakfı (2016M601067).

Tüm prosedürler, Laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı (8. baskı) için NRC/ıLAR Kılavuzu uyarınca gerçekleştirilmiştir. Çalışma protokolü, kurumsal hayvan bakımı ve sermaye Tıp Üniversitesi kullanım Komitesi, Pekin, Çin tarafından onaylandı.
1. hayvan seçimi
<ol><li>Tüm deneyler için, Yetişkin C57BL/6J erkek fareler (8 hafta eski) hayvan modeli olarak kullanın. Not: C57BL/6J fareler Cdh23 sergi bir splice varyant taşıyan...

<ol>
	<li>Lie, A., Skogstad, M., Johnsen, T. S., Engdahl, B., Tambs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+notched+audiograms+in+a+cross-sectional+study+of+12,055+railway+workers.">The prevalence of notched audiograms in a cross-sectional study of 12,055 railway workers.</a> Ear and Hearing. 36 (3), 86-92 (2015).</li><li>Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+transduction,+tuning,+and+synaptic+transmission+in+the+mammalian+cochlea.">Hair cell transduction, tuning, and synaptic transmission in the mammalian cochlea.</a> Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).</li><li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cochlear+frequency+map+for+the+cat:+labeling+auditory-nerve+fibers+of+known+characteristic+frequency.">The cochlear frequency map for the cat: labeling auditory-nerve fibers of known characteristic frequency.</a> Journal of the Acoustical Society of America. 72 (5), 1441-1449 (1982).</li><li>Fettiplace, R., Kim, K. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+mechanoelectrical+transduction+channels+in+hearing.">The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing.</a> Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).</li><li>Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiological+place-frequency+map+of+the+cochlea+in+the+CBA/J+mouse.">A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse.</a> Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).</li><li>Viberg, A., Canlon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+guide+to+plotting+a+cochleogram.">The guide to plotting a cochleogram.</a> Hearing Research. 197 (1-2), 1-10 (2004).</li><li>Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+exposure+modulates+cochlear+inner+hair+cell+ribbon+volumes,+correlating+with+changes+in+auditory+measures+in+the+FVB/nJ+mouse.">Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse.</a> Scientific Reports. 6, 25056 (2016).</li><li>Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+after+noise+exposure:+acceleration+of+cochlear+synaptopathy+in+"recovered"+ears.">Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears.</a> Journal of Neuroscience. 35 (19), 7509-7520 (2015).</li><li>Wichmann, C., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+structure+and+function+of+inner+hair+cell+ribbon+synapses.">Relating structure and function of inner hair cell ribbon synapses.</a> Cell and Tissue Research. 361 (1), 95-114 (2015).</li><li>Matthews, G., Fuchs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+roles+of+ribbon+synapses+in+sensory+neurotransmission.">The diverse roles of ribbon synapses in sensory neurotransmission.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 812-822 (2010).</li><li>Liberman, L. D., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+maturation+of+auditory-nerve+heterogeneity,+as+seen+in+spatial+gradients+of+synapse+morphology+in+the+inner+hair+cell+area.">Postnatal maturation of auditory-nerve heterogeneity, as seen in spatial gradients of synapse morphology in the inner hair cell area.</a> Hearing Research. 339, 12-22 (2016).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximal+number+of+pre-synaptic+ribbons+are+formed+in+cochlear+region+corresponding+to+middle+frequency+in+mice.">Maximal number of pre-synaptic ribbons are formed in cochlear region corresponding to middle frequency in mice.</a> Acta Oto-Laryngologica. 138 (1), 25-30 (2018).</li><li>Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+synaptopathy+in+acquired+sensorineural+hearing+loss:+Manifestations+and+mechanisms.">Cochlear synaptopathy in acquired sensorineural hearing loss: Manifestations and mechanisms.</a> Hearing Research. 349, 138-147 (2017).</li><li>Moser, T., Starr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+neuropathy--neural+and+synaptic+mechanisms.">Auditory neuropathy--neural and synaptic mechanisms.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (3), 135-149 (2016).</li><li>Yu, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Gata3-Mafb+transcriptional+network+directs+post-synaptic+differentiation+in+synapses+specialized+for+hearing.">A Gata3-Mafb transcriptional network directs post-synaptic differentiation in synapses specialized for hearing.</a> Elife. 2, 01341 (2013).</li><li>Buniello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wbp2+is+required+for+normal+glutamatergic+synapses+in+the+cochlea+and+is+crucial+for+hearing.">Wbp2 is required for normal glutamatergic synapses in the cochlea and is crucial for hearing.</a> EMBO Molecular Medicine. 8 (3), 191-207 (2016).</li><li>Gilels, F., Paquette, S. T., Beaulac, H. J., Bullen, A., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+hearing+loss+and+outer+hair+cell+death+in+homozygous+Foxo3+knockout+mice+after+moderate+noise+exposure.">Severe hearing loss and outer hair cell death in homozygous Foxo3 knockout mice after moderate noise exposure.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1054 (2017).</li><li>Kane, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+effects+on+age-related+hearing+loss+associated+with+Cdh23+variants+in+mice.">Genetic background effects on age-related hearing loss associated with Cdh23 variants in mice.</a> Hearing Research. 283 (1-2), 80-88 (2012).</li><li>Jiang, X. W., Li, X. R., Zhang, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+of+ribbon+synapses+number+of+cochlear+hair+cells+in+C57BL/6J+mice+with+age+(Delta).">Changes of ribbon synapses number of cochlear hair cells in C57BL/6J mice with age (Delta).</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (10), 19058-19064 (2015).</li><li>Akil, O., Oursler, A., Fan, K., Lustig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+auditory+brainstem+response+testing.">Mouse auditory brainstem response testing.</a> BIO-Protocol. 6 (6), (2016).</li><li>Zhou, X., Jen, P. H. -. S., Seburn, K. L., Frankel, W. N., Zheng, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+brainstem+responses+in+10+inbred+strains+of+mice.">Auditory brainstem responses in 10 inbred strains of mice.</a> Brain Research. 1091 (1), 16-26 (2006).</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+dissection+and+immunofluorescence+of+the+adult+mouse+cochlea.">Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).</li><li>Schmitz, F., Konigstorfer, A., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIBEYE,+a+component+of+synaptic+ribbons:+a+protein's+journey+through+evolution+provides+insight+into+synaptic+ribbon+function.">RIBEYE, a component of synaptic ribbons: a protein's journey through evolution provides insight into synaptic ribbon function.</a> Neuron. 28 (3), 857-872 (2000).</li><li>Suzuki, J., Corfas, G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round-window+delivery+of+neurotrophin+3+regenerates+cochlear+synapses+after+acoustic+overexposure.">Round-window delivery of neurotrophin 3 regenerates cochlear synapses after acoustic overexposure.</a> Scientific Reports. 6, 24907 (2016).</li><li>Rutherford, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+structure+of+inner+ear+ribbon+synapses+with+STED+microscopy.">Resolving the structure of inner ear ribbon synapses with STED microscopy.</a> Synapse. 69 (5), 242-255 (2015).</li><li>Liberman, L. D., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+cochlear+synaptopathy+after+acoustic+overexposure.">Dynamics of cochlear synaptopathy after acoustic overexposure.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 16 (2), 205-219 (2015).</li><li>Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+Foxo3+causes+adult+onset+auditory+neuropathy+and+alters+cochlear+synapse+architecture+in+mice.">Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice.</a> Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).</li><li>Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin-3+regulates+ribbon+synapse+density+in+the+cochlea+and+induces+synapse+regeneration+after+acoustic+trauma.">Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+cochlear+synaptopathy:+an+early-onset+contributor+to+auditory+functional+decline.">Age-related cochlear synaptopathy: an early-onset contributor to auditory functional decline.</a> Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).</li><li>Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+cochlear+neuropathy+is+selective+for+fibers+with+low+spontaneous+rates.">Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).</li><li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adding+insult+to+injury:+cochlear+nerve+degeneration+after+"temporary"+noise-induced+hearing+loss.">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss.</a> Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li><li>Valero, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+cochlear+synaptopathy+in+rhesus+monkeys+(Macaca+mulatta).">Noise-induced cochlear synaptopathy in rhesus monkeys (Macaca mulatta).</a> Hearing Research. 353, 213-223 (2017).</li><li>Viana, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+neuropathy+in+human+presbycusis:+Confocal+analysis+of+hidden+hearing+loss+in+post-mortem+tissue.">Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue.</a> Hearing Research. 327, 78-88 (2015).</li><li>Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerated+synapses+between+postnatal+hair+cells+and+auditory+neurons.">Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (3), 321-329 (2013).</li><li>Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+murine+cochlear+explant+technique+as+an+in+vitro+screening+tool+in+hearing+research.">Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).</li><li>Takeda, S., Mannstr&#246;m, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Aging+and+Noise+Exposure+on+Auditory+Brainstem+Responses+and+Number+of+Presynaptic+Ribbons+in+Inner+Hair+Cells+of+C57BL/6J+Mice.">Effects of Aging and Noise Exposure on Auditory Brainstem Responses and Number of Presynaptic Ribbons in Inner Hair Cells of C57BL/6J Mice.</a> Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).</li><li>Mehraei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+brainstem+response+latency+in+noise+as+a+marker+of+cochlear+synaptopathy.">Auditory brainstem response latency in noise as a marker of cochlear synaptopathy.</a> Journal of Neuroscience. 36 (13), 3755-3764 (2016).</li></ol>

Cochlear synaptopathy ilk olarak, 2 saat31Için 100 dB SPL 'de 8 \ u201216 kHz oktav Band gürültü tarafından indüklenen geçici eşik KAYMASı (TTS) ile yetişkin farelerde karakterize edildi, araştırmacılar giderek çeşitli içinde synaptopati etkilerini araştırdılar memeliler, maymunlar ve insanlar dahil32,33. Gürültü maruz kalma ek olarak, diğer bazı koşullar Cochlear synaptopathy ile ilişkili olmuştur (örneğin, ya...

Yaklaşık aralığında Frekanslar 20 \ u201220, 000 Hz insanlar tarafından işitsel uyaranlara olarak algılanabilir. İnsan işitme normalde en 1.000 Hz, Ortalama ses basıncı düzeyi 20 μPa genç yetişkinlerde (yani, 0 desibel ses basıncı seviyesi [dB SPL]) yakın duyarlıdır. Bazı patolojik koşullarda, işitme kaybı belirli frekanslarla sınırlıdır. Örneğin, gürültü kaynaklı işitme kaybı (NIL) erken aşamalarında, bir "çentik" (yani, işitme eşik yüksekliği) 4 kHz1' de odyogram görülebilir. Memelinin koklear bölme boyunca, sertlik ve kütle geçişte bir üstel frekans Haritası üretir, koklea tabanında yüksek frekanslı ses algılama ve Apex2düşük frekanslı algılama. Aslında, baziler membranı boyunca koklear yer-frekans haritası vardır, tonotopik organizasyon2,3olarak bilinen ne yol. Baziler membranında verilen her yer, genellikle karakteristik frekans3,4olarak adlandırılan sadece bir özel ses frekansına en yüksek hassasiyete sahiptir, ancak diğer frekanslara tepkiler de görülebilir.
Bugüne kadar, işitsel sistemde normal fonksiyon, patolojik süreçler ve terapötik etkinliği araştırmak için çeşitli fare modelleri kullanılmıştır. Fare koklea 'daki fizyolojik parametrelerin kesin bilgisi, işitme kaybı gibi çalışmalar için ön şarttır. Fare koklea anatomik olarak, farklı frekans bölgelerine karşılık gelen apical, orta ve bazal dönüşler ayrılmıştır. Koklea 'daki ilgili periferik innervasyon sitelerini analiz etmek için Cochlear çekirdeğinde işitsel sinir afferentleri etiketleyerek, Müller ve al. normal fareyle saat5' te koklear yer-frekans haritasını kurmayı başardı. % 90 ile baziler membranın tam uzunluğunun% 10 ' una karşılık gelen 7.2 – 61.8 kHz aralığında, fare koklear yer-frekans Haritası basit bir doğrusal regresyon fonksiyonu ile tarif edilebilir, Koklear tabanından normalleştirilmiş mesafe ve karakteristik frekans5logaritma. Laboratuar farelerinde, yer-frekans Haritası, belirli frekans aralıkları içinde işitme eşikleri arasındaki ilişkiyi keşfetmek ve baziler membranı boyunca göreli bölgelerde eksik saç hücrelerinin sayısını gösteren kokleogramlar için kullanılabilir6. Daha da önemlisi, yer-frekans Haritası, periferik işitsel travma 7 ile farelerde belirli koklear frekans lokasyonlarında saç hücrelerinin şerit sinaps hasar gibi minimal yapısal hasar, soruşturma için bir konumlandırma sistemi sağlar ,8.
Memelide koklea 'da, şerit sinapslar, IFC içinde glutamat içeren serbest hazır sinaptik veziküllerin bir Halo ve SGN sinir terminalinde postsinaptik yoğunluk olan bir elektron-yoğun projeksiyon olan bir presinaptik şerit oluşur. glutamat reseptörleri ile9. Koklear ses dönüştürücürü sırasında, saç hücresi paketinin sapması ıFC depolarizasyonunu elde eder, bu da ıhcs 'den postsinaptik afferent terminallerine glutamat salınmasına yol açar ve böylece işitsel yolu aktive eder. Bu yolun aktivasyonu, ses kaynaklı mekanik sinyallerin SGN10' daki bir oran koduna dönüştürülmesine yol açar. Nitekim, IHC şerit sinaps yüksek temporal hassasiyet ile Hertz yüzlerce oranlarda yatıştırıcı ses iletimi için son derece uzmanlaşmıştır ve ses kodlaması presinaptik mekanizmaları için kritik öneme sahiptir. Önceki çalışmalar şerit sinaps yetişkin fare koklea11,12, büyük olasılıkla belirli ses için kodlama yapısal adaptasyon yansıtan farklı frekans bölgelerinde boyut ve sayı büyük farklılık ortaya çıktı hayatta kalma ihtiyaçları. Son zamanlarda, deneysel hayvan çalışmaları, koklear synaptopati gürültü kaynaklı işitme kaybı, yaşa bağlı işitme kaybı ve kalıtsal işitme kaybı da dahil olmak üzere birden fazla işitme bozukluğu formlarına katkı gösterdiğini göstermiştir13, 14. böylece, belirli frekans bölgelerinde sinaptik sayı, yapı ve fonksiyonlarda korelasyon değişiklikleri tanımlamak için yöntemler giderek işitsel gelişim ve iç kulak hastalığı çalışmalarında istihdam edilmiştir, aracılığıyla oluşturulan modelleri kullanarak genetik veya çevresel değişkenlerin deneysel manipülasyon15,16,17.
Mevcut raporda, Yetişkin farelerde baziler membranın belirli bir frekans bölgesinde sinaptik sayı, yapı ve fonksiyon analizi için bir protokol sunuyoruz. Koklear frekans lokalizasyonu, bir kokleogram ile birlikte belirli bir yer frekans Haritası kullanılarak gerçekleştirilir. Koklear şerit sinapsların normal morfolojik özellikleri presinaptik ve postsinaptik immünosteme yoluyla değerlendirilir. Cochlear Ribbon sinapslarının fonksiyonel durumu, ABR dalgası ı 'nin suprathreshold amplitüllerine göre belirlenir. Küçük değişikliklerle, bu protokol, fareler, kobay ve gerbils gibi diğer hayvan modellerinde fizyolojik veya patolojik koşulları incelemek için kullanılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:828px;" width="828">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ketamine hydrochloride</td>
			<td style="width:304px;">Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China</td>
			<td style="width:141px;">H35020148</td>
			<td style="width:167px;">100mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>X-1251</td>
			<td>10mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TDT physiology apparatus</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA</td>
			<td colspan="2">Auditory Physiology System III</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SigGen/BioSig software</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA</td>
			<td colspan="2">Auditory Physiology System III</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electric Pad</td>
			<td>Pet Fun</td>
			<td>11072931136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps 3#</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada</td>
			<td>0203-3-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps 5#</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada</td>
			<td>0209-5-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereo dissection microscope</td>
			<td>Nikon Corp., Tokyo, Japan</td>
			<td>SMZ1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat serum</td>
			<td>ZSGB-BIO, Beijing,China</td>
			<td>ZLI-9021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4</td>
			<td>Millipore Corp., Billerica, MA, USA</td>
			<td>MAB397</td>
			<td>mouse&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified Mouse Anti-CtBP2</td>
			<td>BD Biosciences, Billerica, MA, USA</td>
			<td>612044</td>
			<td>mouse&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>A21124</td>
			<td>goat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>A21131</td>
			<td>goat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting medium containing DAPI</td>
			<td>ZSGB-BIO, Beijing,China</td>
			<td>ZLI-9557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal fluorescent microscopy</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>TCS SP8 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image Pro Plus software</td>
			<td>Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA</td>
			<td>version 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Professional diagnostic pocket otoscope</td>
			<td>Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,China</td>
			<td>HS-OT10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle electrode</td>
			<td>Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi&#39;an,China</td>
			<td>1029</td>
			<td>20 mm, 28 G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Closed-field speaker</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA</td>
			<td>CF1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea

Cochlear iç saç hücreleri (ıhcs), şerit sinaps ile Spiral ganglion nöronlara (SGNs) akustik sinyalleri iletir. Çeşitli deneysel çalışmalar saç hücrelerinin sinaps sensorineval işitme kaybı (SNHL) ilk hedefler olabilir belirtti. Bu tür çalışmalar koklear "synaptopathy" kavramını önermiştir, hangi Şerit sinaps numarası, yapı veya fonksiyon değişiklikler anlamına gelir, ıhcs ve Sgns arasında anormal sinaptik iletim neden. Cochlear synaptopathy geri dönüşümsüz durumdayken işitme eşiğini etkilemez. Gürültü kaynaklı deneysel modellerde, belirli frekans bölgelerinde ıHC sinaps sınırlı hasar özellikle synaptopathy neden çevresel faktörleri belirlemek için istihdam edilir, yanı sıra bu iç kulak rahatsız edici fizyolojik sonuçları Devre. Burada, yetişkin fareler belirli bir frekans bölgesinde Cochlear sinaptik Morfoloji ve fonksiyon analiz etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu protokolde, belirli frekans bölgelerinin Cochlear lokalizasyonu, kokleogram verileriyle birlikte yer frekansı haritaları kullanılarak gerçekleştirilir, bu da şerit sinapsların morfolojik özelliklerinin sinaptik ile değerlendirildiği aşağıdaki immün boyama. Şerit sinapsların fonksiyonel durumu daha sonra işitsel beyin tepkisinin genlikleri göre belirlenir (ABR) dalga ı. Bu rapor, bu yaklaşımın, yeni terapötik müdahalelerin gelişmesine yardımcı olabilecek koklea 'daki sinaptik disfonksiyon patogenezi ve mekanizmalarının anlayışımızı derinleştirmek için kullanılabileceğinizi göstermektedir.

Anestezi altında 10 C57BL/6J fare (8 hafta) için ABR İşitme testleri yapıldı. ABRs 4, 8, 16, 32 ve 48 kHz 'de ton patlaması uyarıcıları kullanılarak ortaya çıkmış. Her hayvanın işitme eşiği, ABR 'de en az bir net dalga formunu ayırt ederek görsel olarak algılanır. Tüm fareler, uyarıcı frekansına bağlı olarak 25 ile 70 dB SPL arasında değişen ton patlamalarına yanıt olarak ABR eşiklerini sergiledi. Sonuçlarımız, işitme eşiğinin 16 kHz 'de (Şekil 1) en...

Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea at JoVE.com

Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

Bu yazıda normal farelerde morfolojik özellikleri ve kurdele sinüslerinin fonksiyonel durumunu değerlendirmek için deneysel bir protokol açıklanmaktadır. Bu model aynı zamanda gürültüye bağlı ve yaşa bağlı Cochlear synaptopathy-kısıtlanmış modeller için de uygundur. Önceki fare çalışmalarından gelen göreli sonuçlar da tartışılmaktadır.

Fare koklea belirli frekans bölgelerinde şerit synapses morfolojik ve fonksiyonel değerlendirilmesi

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

Birincil rapor, sinaps sayılarının değiştiği ve fonksiyonun analiz edilebildiği çoğu modelde baziler membranın spesifik frekans bölgesini doğru bir şekilde bulmanın önemidir. Belirli frekans bölgelerinin koklear yerelleştirme s›kleogram verileri ile birlikte frekans haritalar› kullanılarak güvenilir bir şekilde gerçekleştirilir. Mikroskop çeşitli araştırma çalışmaları içine fikir sağlar.Koklear nöropatinin özellikle işitme kaybı, kulak çınlaması ve hiperacusis'ten önceki birincil ilk olaylar olduğu fikrini destekler. Anestezi sekiz haftalık yetişkin C57 siyah 6J erkek fare de parmak çimdik yanıt eksikliği doğruladıktan sonra. Fareyi elektriksel ve akustik korumalı bir odada 37 derece lik bir ısı yastığına yerleştirin.Sonra, kafatasının tepe noktasında deri altında üç milimetre derinliği ile bir subdermal 20 milimetre 28 gauge iğne kayıt elektrot yerleştirin. Ipsilateral parotis bölgesinde, ölçülen kulak pinnasının altında bir referans elektrot ve kontralateral parotis bölgesinde bir zemin elektrot. Farenin yanına koni şeklinde bir ucu olan iki santimetrelik plastik bir tüple donatılmış kapalı bir alan hoparlörü yerleştirin ve ucu dış kulak kanalına sığdırın.İşitsel beyin sapı yanıtı veya ABR kaydı için, ses basıncı düzeylerini 5 ila 10 desibel ses basıncı düzeyinde ki adımlarda 90 ila 10 desibel arasında düşürerek ton boruları oluşturur. Bu adımda, yanıtlar yükseltilir, filtrelenir ve ortalamaya alınır. Her frekansta, görsel denetimle net bir şekilde tanımlanabilen bir veya daha fazla ayırt edilebilir dalgayla güvenilir bir ABR kaydıyla sonuçlanan en az ses basıncı düzeyi olan ABR eşiğini belirleyin.ABR kaydından sonra, ventral taraftan bulla ortaya ve koklea erişmek için keskin makas ile bulla açın. İnce kasiler kullanarak, temporal kemikleri çıkarın ve stapes arter ilerler. Sonra oval pencereden stapes çıkarın ve yuvarlak pencere membran yırtMak.13 milimetrelik 27 gauge iğnenin ucunu yavaşça döndürerek kokleanın tepesinde küçük bir delik açın, ince uçlu pipet kullanarak %4 paraformaldehiti pencereden perilenfatik alanlara doğru hafifçe temizler. Daha sonra, yıkama başına soğuk taze 0,1 molar PBS ile yıkama başına beş dakika boyunca kemikleri üç kez durulayın. Oda sıcaklığında dört saat boyunca %10 EDTA ile kemiklerin kireçlenmesi ve yatay bir çalkalayıcıda dakikada 20 dönüş ile izlenir.Kuluçka sonunda, bir diseksiyon mikroskop altında taze 0.1 molar PBS içine kireçlenmiş bir temporal kemik aktarın. Sırayla apikal, orta ve bazal koklea bölgelerini incelemek için 3 ve 5 Dumont forsepsve 27 gauge iğne kullanın. Spiral ligament boyunca kesikler küçük bir dizi yapmak ve tektorial membran ve Reissner membran kaldırmak için bir jilet kullanın.Spiral limbus da dahil olmak üzere kalan işitsel epiteli, tüm montaj hazırlıkları için ayrı ayrı koklear dönüşlere dönüştürün. Daha sonra göz parçasına yerleştirilen 250 mikrometre lik ölçekle baziler membran uzunluğunu ölçmek için ışık mikroskobunun 40X yağ amacını kullanın. Bu iç saç hücrelerinin stereocilia boyunca ayarlanabilir.Diseksiyon sonra, ayrı 2.5 mililitre santrifüj tüpler içine her koklear dönüş yerleştirin. PBS'de %10 keçi serumu ile nonspesifik bağlanmayı %0,1 Triton X-100'de bir rotatörde oda sıcaklığında bir saat boyunca bloke edin. Kuluçka sonunda, bir diseksiyon mikroskobu altında çözeltikaldırmak için 200 mikrolitre pipet ucu kullanın.%5 keçi serumu ve PBS'de %0.1 Triton X-100 ile %0.1 triton X-100'de seyreltilmiş birincil antikorlarla numuneleri bir rotatörde 4 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi sabah, herhangi bir kalıntı primer antikor kaldırmak için yıkama başına soğuk 0.1 molar PBS ile beş dakika boyunca doku örneklerini üç kez durulayın. Daha sonra numuneleri PBS'de %5 keçi serumunda seyreltilmiş uygun ikincil antikorlarla %0,1 Triton X-100'de, ışıktan korunan rotatörde oda sıcaklığında 2-3 saat süreyle etiketlendi.Kuluçka sonunda, numuneleri gösterildiği gibi 0,1 molar PBS ile üç kez yıkayın ve numuneleri 0,1 molar PBS içeren tek tek 35 milimetrelik plakalara aktarın. Slaytüzerine DAPI takviyeli montaj ortamı bir damla yerleştirin ve pbs gelen montaj ortamına örnekleri aktarın. Her slayt üzerine bir kapak kayma bir kenar yerleştirin ve kapak kaymaları yavaşça düşmesini sağlamak için bırakın.Daha sonra slaytları bir gecede dört derece santigrat derecede bir slayt kutusunda kurulayın. Numuneleri görüntülemek için, her koklear dönüşten sekiz mikrometre konfokal Z destesi elde etmek için uygun lazerler ve 63X yüksek çözünürlüklü yağ daldırma lensi ile bir konfokal mikroskop kullanın. Sinaptik puncta sayıları için, 0,3 mikrometre adım boyutuna sahip Z yığınlarını iç saç hücrelerinin tüm uzunluğunu kapacak şekilde ayarlayın, sinaptik puncta'nın tamamının görüntülenebileceğini ve Z erişim projeksiyonuna ulaşmak için Z destesinde görüntüleri içeren puncta'yı birleştirebileceğini sigortalayın.Birleştirilmiş görüntüleri uygun bir görüntü işleme yazılımı programına aktarın. Her hücre için sinaptik puncta sayısını hesaplamak için DAPI pozitif iç saç hücrelerinin sayısına göre belirli frekans bölgelerinde her Z yığınında sinaptik toplam sayıları bölün. Her belirli frekans bölgesinde, dokuz ila 11 iç saç hücresi içeren farklı mikroskobik alanların üç görüntüsünün tüm sinaptik puncta ortalama.Sitoskelet mimarisini ve sinaptik lokalizasyonu daha iyi görselleştirmek için, fırça aracını kullanarak sinaptik yapıyı ve bireysel iç saç hücrelerinin dağılımını görsel olarak değerlendirin. Presinaptik şeritler ve postsinaptik reseptör yamaları yan yana incelemek için, dikdörtgen marquee aracı şeritler etrafında voxel alanı ayıklamak ve tek tek şeritler izole etmek için görüntü kesme kullanın. Ardından, eşleştirilmiş sinapsları ve yetim şeritleri tanımlamak için kullanılabilecek bu minyatür projeksiyonların küçük resim dizisini elde etmek için resim ve resim boyutunu tıklatın.Bu temsili deneydeki farelerin on faresinin tümü, uyarıcının frekansına bağlı olarak ses basıncı seviyesi başına 25 ile 70 desibel arasında değişen ton patlamalarına yanıt olarak ABR eşikleri sergilemiştirilmiştir. Bu deneyin işitme eşiği koklear apeksten yaklaşık %43'e karşılık gelen 16 kilohertz'de en düşük seviyedeydi ve bu da akustik duyarlılığın diğer koklear bölgelerde önemli ölçüde azaldığını düşündürmektedir. İşitsel epitelin tüm bağları üç parçaya ayrılır ve uzunlukları ölçülür ve koklear apeksten yüzde lik mesafeye dönüştürülür.Her koklear dönüşün baziler membranüzerindeki frekans konumu logaritmik fonksiyon kullanılarak hesaplanır. Erişkin farelerin normal kulaklarında, immünboyama sinaptik şeritler ve glutamat reseptör yamaları yan yana çiftleri ortaya koymaktadır. Hücre başına 8 ila 20 çift ile iç saç hücrelerinin bazolateral membran yüzeyi çalışma.Puncta büyük çoğunluğu normal kulaklarda yan yana çiftleri olarak görünmesine rağmen, yetim kurdeleler seyrek yüksek büyütme ler gözlenir. İç saç hücre şerit sinaps sayısı 16 kilohertz bölgede en yüksek ve bu yerden mesafe arttıkça önemli ölçüde azalır. Bu işlem sırasında hatırlanması gereken en önemli şey koklear bazal membran bütünlüğünü garanti etmek gerektiğidir.Teknik yeterliliğe ulaşılana kadar doğruluğu vurgulamalıyız. Bu prosedürü takiben, koklear nöropati bu önlem ile tamir edilebilir olup olmadığını cevaplamak için gen tedavisi yapılabilir. Bu ölçü koklear nöropati keşfetmek için daha geniş bir tekniktir, hangi birincil ilk olaylar işitme kaybı ile ilişkilendirmek eğer, tinnitus, ve hiperacusis.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Neuroscience

Unit 1

The Special Senses

SCIENTISTS IN ACTION

Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse

Koklear İç Saç Hücreleri Ulaşın Afferent Dendritler postsinaptik Kayıtlar: Şerit Synapse Multivesicular Yayın İzleme

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the ...

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

3D Görüntüleme ve Morfolojik Analizi Yetişkin Mouse Serebrovasküler Döküm

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Fare Beyin Çeşitli Bölgelerinde Telomeraz Aktivite: Radyoaktif olmayan Telomeraz Amplifikasyon Protokolü tekrarlayın (TRAP) Deneyi

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

Frenik Motor Nöronlar tarafından Diyafram İNNERVASYONU Fonksiyonel ve Morfolojik Değerlendirmesi

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retina Şerit Sinapslar at Membran Reseptör Yüksek Çözünürlüklü Sayısal immunogold Analizi

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Tüm Dağı Diseksiyon ve Yetişkin Fare Kohlea immünofloresan

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Fare birincil Oligodendrocytes hızlı ve spesifik Immunomagnetic izolasyonu

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Fonksiyonel yaşam Xenopus kurbağa yavrularını koku yollar değerlendirilmesi

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Hücre özgü kalsiyum fare diyafram Üçlü sinaps sinyal görüntüleme

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Stimulus-specific Cortical Visual Evoked Potential Morphological Patterns

Stimulus-spesifik kortikal görsel uyarılmış potansiyel morfolojik desenler

This paper presents a methodology for the recording and analysis of cortical visual evoked potentials (CVEPs) in response to various visual stimuli using ...