Name: isolating malignant and non-malignant b cells from lck:egfp zebrafish
Uploaded: 2019-02-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish at JoVE.com

Vi vil gerne takke Megan Malone-Perez for zebrafisk pleje og OUHSC flow flowcytometri kerne. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Hyundai Hope på hjul, Oklahoma Center for avancement of Science og Technology (HRP-067), en NIH/NIGMS INBRE pilotprojekt award (P20 GM103447). JKF holder E.L. & Thelma Gaylord begavet stol i pædiatrisk hæmatologi-onkologi af children's Hospital Foundation.

Alle procedurer, der involverer zebrafisk blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på University of Oklahoma Health Sciences Center.
1. isolere Non-maligne B og T lymfocytter fra transgene lck:eGFP fisk
<ol><li>Bedøver fisk ved hjælp af 0,02% tricaine (MS-222) i systemet fiskevand.</li>
	<li>Undersøge 2 – 6 måned gammel fisk for fluorescerende thymi, der er placeret på dorsomedial aspekt af den branchial hulrum i zebrafisk og andr...

<ol>
	<li>Paik, E. J., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+development+in+the+zebrafish.">Hematopoietic development in the zebrafish.</a> International Journal of Developmental Biology. 54 (6-7), 1127-1137 (2010).</li><li>Kasheta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+T+reg-like+cells+in+zebrafish.">Identification and characterization of T reg-like cells in zebrafish.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (12), 3519-3530 (2017).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+B+Cell+Development+without+a+Pre-B+Cell+Stage,+Revealed+by+CD79+Fluorescence+Reporter+Transgenes.">Zebrafish B Cell Development without a Pre-B Cell Stage, Revealed by CD79 Fluorescence Reporter Transgenes.</a> Journal of Immunology. 199 (5), 1706-1715 (2017).</li><li>Page, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily+conserved+program+of+B-cell+development+and+activation+in+zebrafish.">An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish.</a> Blood. 122 (8), e1-e11 (2013).</li><li>Schorpp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+functions+of+Ikaros+in+vertebrate+lymphocyte+development:+genetic+evidence+for+distinct+larval+and+adult+phases+of+T+cell+development+and+two+lineages+of+B+cells+in+zebrafish.">Conserved functions of Ikaros in vertebrate lymphocyte development: genetic evidence for distinct larval and adult phases of T cell development and two lineages of B cells in zebrafish.</a> Journal of Immunology. 177 (4), 2463-2476 (2006).</li><li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+tracking+of+T+cell+development,+ablation,+and+engraftment+in+transgenic+zebrafish.">In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish.</a> Proceedings of National Academy of Sciences U S A. 101 (19), 7369-7374 (2004).</li><li>Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+zebrafish+to+understand+immunity.">The use of zebrafish to understand immunity.</a> Immunity. 20 (4), 367-379 (2004).</li><li>Frazer, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+T-cell+malignancy+models+established+in+a+zebrafish+phenotypic+screen.">Heritable T-cell malignancy models established in a zebrafish phenotypic screen.</a> Leukemia. 23 (10), 1825-1835 (2009).</li><li>Rudner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shared+acquired+genomic+changes+in+zebrafish+and+human+T-ALL.">Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL.</a> Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).</li><li>Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pten+mediates+Myc+oncogene+dependence+in+a+conditional+zebrafish+model+of+T+cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">Pten mediates Myc oncogene dependence in a conditional zebrafish model of T cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Journal of Experimental Medicine. 208 (8), 1595-1603 (2011).</li><li>Borga, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+B+and+T+cell+acute+lymphoblastic+leukemias+in+zebrafish+driven+by+transgenic+MYC:+implications+for+oncogenesis+and+lymphopoiesis.">Simultaneous B and T cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic MYC: implications for oncogenesis and lymphopoiesis.</a> Leukemia. , (2018).</li><li>Haferlach, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+utility+of+microarray-based+gene+expression+profiling+in+the+diagnosis+and+subclassification+of+leukemia:+report+from+the+International+Microarray+Innovations+in+Leukemia+Study+Group.">Clinical utility of microarray-based gene expression profiling in the diagnosis and subclassification of leukemia: report from the International Microarray Innovations in Leukemia Study Group.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (15), 2529-2537 (2010).</li><li>Novershtern, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Densely+interconnected+transcriptional+circuits+control+cell+states+in+human+hematopoiesis.">Densely interconnected transcriptional circuits control cell states in human hematopoiesis.</a> Cell. 144 (2), 296-309 (2011).</li><li>Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+anatomy+and+histology+of+the+adult+zebrafish.">Normal anatomy and histology of the adult zebrafish.</a> Toxicology Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).</li><li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+organs+from+the+adult+zebrafish.">Dissection of organs from the adult zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2010).</li><li>Pruitt, M. M., Marin, W., Waarts, M. R., de Jong, J. L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+the+Side+Population+in+Myc-induced+T-cell+Acute+Lymphoblastic+Leukemia+in+Zebrafish.">Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (37), (2017).</li><li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants.">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nature Immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).</li><li>Carmona, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptome+analysis+of+fish+immune+cells+provides+insight+into+the+evolution+of+vertebrate+immune+cell+types.">Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types.</a> Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).</li><li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+hematopoietic+and+renal+cell+heterogeneity+in+adult+zebrafish+at+single-cell+resolution+using+RNA+sequencing.">Dissecting hematopoietic and renal cell heterogeneity in adult zebrafish at single-cell resolution using RNA sequencing.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 2875-2887 (2017).</li></ol>

Vi udviklede og give en protokol for at isolere B celler fra lck:eGFP transgene zebrafisk, tilføjer indeværende hen til andre D. rerio modeller med B-afstamning etiketter3,4. Noget overraskende, gik identifikation af normal god landbrugspraksislo B celler i denne linje ubemærket siden dens beskrivelse i 2004. Generelt, lck anses for T-celle-specifikke6, men nylige undersøgelser fandt uventet lc...

Zebrafisk tilbyder kraftfulde attributter, såsom genetisk manipulability, høj frugtbarhed, optisk gennemskinnelighed og hurtige udvikling, lette at studere hvirveldyr udvikling ved hjælp af genetiske metoder. Disse fordele, kombineret med de delte funktioner af teleost og pattedyr bloddannelsen, gør D. rerio ideel til in vivo analyser af lymphopoiesis og lymfocyt funktion, fra deres tidligste udseende i larver i hele voksenlivet. Blod udvikling i zebrafisk er afhængig af godt bevarede genetiske processer, der er delt med pattedyr, og disse omfatte den adaptive immunsystem. Molekylære mekanismer for lymfoide udvikling bevares desuden bemærkelsesværdigt mellem zebrafisk og pattedyr1.
I de sidste 2 årtier, transgene D. rerio linjer at etiketten specifikke blod lineages og mutant linjer mangelfuld i disse slægter har oprettet2,3,4,5. En af disse, linjen lck:eGFP transgene bruger zebrafisk lymfocyt protein tyrosin kinase (lck) initiativtageren til at drive normal god landbrugspraksis udtryk6. Dette gen, som er stærkt udtrykt af både T-lineage prækursorer og modne T-lymfocytter, tillader in vivo, sporing af thymic T-celle udvikling og ex vivo rensning af T-slægt celler af FACS7. Tidligere brugte vi denne linje i en frem-genetiske ENU mutagenese skærm til at identificere kønscelleoverførsel mutanter tilbøjelige til T-alle og studere somatically erhvervet genetisk begivenheder i forbindelse med T-celle oncogenesis8,9.
For nylig forlænget vores laboratorium yderligere nytte af lck:eGFP zebrafisk. I dobbelt-transgene rag2:hMYC (human MYC), lck:eGFP D. rerio der er kendt for at udvikle T-alle 10, vi opdagede, at B-afstamning alle også forekomme11. I modsætning til T-alle i denne model, der fluorescerer smukt på grund af høj normal god landbrugspraksis udtryk, B-alle er svagt-fluorescerende på grund af lavt normal god landbrugspraksis tillader fisk med B-alle kan skelnes klart fra dem med T-alle af fluorescerende mikroskopi. Denne differentierede normal god landbrugspraksis udtryk tillader også adskillelsen af normal god landbrugspraksislo B-alle celler fra normal god landbrugspraksisHej T-alle celler ved hjælp af FACS11. Endvidere er lav lck udtryk ikke enestående for zebrafisk B-alle, som menneskelige B-alle også udtrykke lave niveauer af LCK11,12. Ligeledes, normale B-slægt celler af D. rerio, mus og mennesker også udtrykke lave niveauer af lck/Lck/LCK, med umodne B-celler har den højeste udtryk11,13. På grundlag af per celle express B-slægt celler i lckeGFP zebrafisk eller afledte linjer 1-10% så meget normal god landbrugspraksis som T-lymfocytter. Disse normal god landbrugspraksislo celler udtrykkelige karakteristisk B celle mRNAs såsom pax5, cd79b, blnk, btk, ighm, ighzog andre, og kan blive renset fra marv, thymus, milt eller perifere blod11. Derfor isoleret både B - og T-slægt celler kan være fra lckeGFP zebrafisk og rag2hMYC, lckeGFP dyr, B - og T-alle celler samt11.
Her præsenterer vi vores protokol til effektivt FACS-rense ikke-maligne B celler fra lck:eGFP zebrafisk og ikke-maligne eller maligne B celler i rag2hMYC; lck:eGFP fisk, ved hjælp af forskellige kilde væv. Sådanne celler kan ligeledes kvantificeres ved flowcytometri uden FACS isolation, hvis det ønskes. Opdagelsen af lav lck udtryk- og dermed lav normal god landbrugspraksis udtryk-af B celler åbner nye døre for eksperimenterende muligheder for lckeGFP zebrafisk, som in vivo B celle udviklingsmæssige undersøgelser. Således, denne transgene linje, første gang rapporteret i 2004, har nye liv som vi søger at udnytte det til at opsnuse frisk indsigt vedrørende zebrafisk adaptive immunitet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 &#181;m mesh</td>
			<td>Sefar Filter technology</td>
			<td>7050-1220-000-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap</td>
			<td>Falcon Corning Brand</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tube</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>525-0448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ APO 100 Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoflex</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS-Qi1MC camara</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSJazz</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v10.2</td>
			<td>FlowJo, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lck:eGFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See Langeneu et al., 2004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Version 4.13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin -Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle micro-tube homogenizers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>64788-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Transfer pippetes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rag2:hMYC-ER</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See Gutierrez et al., 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Media 1640 1X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11835-030</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating malignant and non-malignant b cells from lck:egfp zebrafish

Zebrafisk (Danio rerio) er en kraftfuld model til at studere lymfocyt udvikling. Ligesom pattedyr besidder D. rerio en adaptive immunsystem, der omfatter B og T lymfocytter. Undersøgelser af zebrafisk lymphopoiesis er vanskeligt, fordi antistoffer anerkende D. rerio celle overflade markører ikke er generelt tilgængelige, komplicerende isolering og karakterisering af forskellige lymfocyt befolkning, herunder B-afstamning celler. Transgene linjer med afstamning-specifikke fluorophore udtryk bruges ofte til at omgå denne udfordring. Transgene lck:eGFP linje er blevet brugt til at studere D. rerio T-celle udvikling, og er også blevet udnyttet til model T-celle udvikling og akut lymfoblastær leukæmi (T-ALL). Selvom lck:eGFP fisk har været meget anvendt til at analysere T-afstamning, har de ikke været brugt til at studere B-celler. For nylig, opdagede vi, at mange zebrafisk B celler også udtrykke lck, omend på et lavere niveau. Lck:eGFP B celler udtrykker derfor ligeledes lave niveauer af normal god landbrugspraksis. Baseret på dette resultat, udviklede vi en protokol til at rense B-slægt celler fra lck:eGFP zebrafisk, som vi rapporten her. Vores metode beskriver, hvordan du udnytter et fluorescerende-aktiveret celle sidesorteringen (FACS) til at rense B celler fra lck:eGFP fisk eller relaterede linjer, som dobbelt-transgene rag2:hMYC; lck:eGFP fisk. I disse linjer, B-celler, så især umodne B-celler, udtrykkelig normal god landbrugspraksis på lavt men påviselige niveauer, de kan skelnes fra T-celler, der giver stærkt udtryk for normal god landbrugspraksis. B-celler kan isoleres fra marv, thymus, milt, blod eller andre væv. Denne protokol indeholder en ny metode til at rense D. rerio B-celler, muliggør undersøgelser fokuseret på emner som B celle udvikling og B-lymfocytter maligniteter.

Vi brugte flowcytometri til at analysere og FACS at isolere normal god landbrugspraksislo og normal god landbrugspraksisHej celler fra thymus, nyre marv og milten af lck:eGFP transgene zebrafisk. Analyse af 3-måned-forhenværende fisk viste thymus indeholdt oftest normal god landbrugspraksis+ lymfocytter. Normal god landbrugspraksis+ celler blev stort set begrænset til lymfoid porten tidligere beskrevet af Traver et al.<sup class="xre...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish at JoVE.com

Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish

Transgene lck:eGFP zebrafisk udtrykke normal god landbrugspraksis højt i T-lymfocytter, og har været brugt til at studere T-celle udvikling og akut lymfoblastær leukæmi. Denne linje kan bruges til undersøgelse B celler, der udtrykker lck på lavere niveauer. Denne protokol beskriver rensning af maligne og ikke-maligne B celler fra lck:eGFP zebrafisk.

Isolere malign og Non-malign B celler fra lck:eGFP zebrafisk

Zebrafish (Danio rerio) are a powerful model to study lymphocyte development. Like mammals, D. rerio possess an adaptive immune system that includes B and ...

Vi fandt for nylig, at mange B-celler i LCK GFP zebrafisk udtrykker lave niveauer af GFP. Dette gør denne linje til et nyttigt værktøj til at studere B-celler samt T-celler. Den største fordel ved denne teknik er, at vi nu kan studere B-celler og T-celler fra LCK GFP zebrafisk eller vi kan studere B-ALL og T-ALL celler fra fisk med kræft.Disse metoder muliggør B celleudvikling og B-ALL undersøgelser i zebrafisk. Som er relevante for at forstå adaptive immunsystemet, og det er maligne hverdag i pædiatrisk kræft. Hvis du aldrig har gjort disse dissektioner, før du måske ønsker at forfine din teknik et par gange, indtil du kan få gode thymus og marv prøver.Visuel demonstration vil hjælpe seerne til at genkende fluorøse og B-ALL i fisk og til at vælge de korrekte indstillinger for at diskriminere B og T-celler for deres isolation. Efter bedøvelse med 0,02% Tricaine i fiskesystemet vand bruge GFP filter på et epifluorescens mikroskop til at undersøge to til seks måneder gamle zebrafisk for fluorescerende thymi på dorsale mediale aspekt af branchial hulrum. Efter lokalisering af thymus sted aflivede fisk i en petriskål og bruge fluorescerende mikroskop til at fjerne GFP positive thymi.Og brightfield mikroskopi indstillinger for at høste nyremarven og milt. Hvert indsamlet organ anbringes i et 1,5 milliliterrør indeholdende 500 mikroliter koldsorteringsmedium, og der anvendes en mikrorørhomogenis til at homogenisere vævet på is. Derefter stamme det homogeniserede væv gennem en 35 mikrometer mesh filter til at generere en enkelt celle suspension og placere cellerne på is.Begyndende ved to til fire måneder bruge en fluorescerende mikroskop til at screene dobbelt-transgene rag2: hMYC LCK EGFP fisk ved hjælp af lav eksponering indstillinger til at identificere lyse T-celle akut lymfoblastær leukæmi eller T-ALL og høj eksponering indstillinger til at identificere dim B-ALL dyr. Wild type kontrol og præ-leukæmiske fisk har GFP lokaliseret kun i thymus. Kategoriser fisken baseret på omfanget af GFP fluorescens ved hjælp af en simpel tre kategori system.Niveau en fisk demonstrere en fluorescerende signal som en thymic tumor med kun en begrænset lokal spredning. Niveau to fisk viser en fluorescerende signal ud over thymus involverer mindre end 50% af kroppen. Og niveau tre fisk viser en fluorescerende signal strækker sig ud over 50% af kroppen.Adskj 100% fisk med AL fra dem uden kræft. Og overvåge den præ-leukæmiske fisk uden GFP positive tumorer en gang om måneden for udviklingen af nye ALLE. For T eller B-ALL celle isolation bruge et barberblad til at fjerne hovedet og thymic region af en aflivet niveau tre fisk og placere kroppen i en petriskål.Brug en P-1000 pipette til at vaske fisken peritoneal hulrum med 500 mikroliter af kold sortering medium, indsamle celler og medium i en fem milliliter rør. Ved hjælp af en frisk pipettespids injicere to til tre yderligere 200 til 300 mikroliter mængder af kold sortering medium i kroppen hulrum og bruge spidsen af pipetten til at anvende blidt pres på fiskekroppen til at ekstrudere cellerne ud af kroppen hulrum i de fem milliliter rør. Derefter stamme celle suspension gennem en 35 mikroliter mesh filter.Og læg cellerne på is, indtil deres analyse ved flow cytometri. For hele kroppen homogenisering bruge en støder mikrorør homogenisator til at homogenisere kroppen af fisken og tilføje en yderligere 300 mikroliter af kold sortering medium til røret. Cellerepensionen filtreres gennem et 35 mikrometermaskefilter, og filteret vaskes med ekstra sorteringsmedium efter behov, indtil der kun er vævsrester tilbage på filteret.Derefter placere cellerne på is, indtil deres analyse. Til flowcytometrisk analyse af de isolerede celler indstilles flowcytometerparametrene i henhold til producentens retningslinjer. Og erhverve 10, 000 til 50, 000 begivenheder for at indstille den forreste scatter og side scatter parametre for at definere lymfocyt og stamfader celle porte og udelukke cellulære snavs.Eksklusive celle doublets og bruge lymfoide og / eller forløber porte til at bestemme antallet og procentdelen af GFP positive celler. Brug af phycoerythrin og GFP-intensiteterne definerer porte til GFP negative versus GFP lav versus GFP høje celler. At lære, hvor portene til isolering af GFP-lav- og GFP-højceller skal placeres, er afgørende for at opnå rene B- og T-cellepopulationer.To forskellige GFP positive populationer, GFP lav B-celler og GFP høj T-celler kan fås fra thymus. B-celler, der er bosat i nyremarven på tre måneder gamle zebrafisk, udtrykker lave niveauer af GFP. GFP høje celler er knappe dog, hvilket indikerer, at kun en lille procentdel af T lymfocytter er til stede i marv på tre måneder.På samme måde viser miltprøver højere procentdele af GFP-lav end GFP høje celler. I dobbelttransgene fisk, der endnu ikke har udviklet akut lymfoblastær leukæmi, svarer GFP-udtrykket i thymus, marv og milt til det, der er observeret i enkelttransgene LCK EGFP-fisk. Men, antallet af lymfocytter pr organ øges.Formentlig på grund af MYC drevet udvidelse af umodne B og T celle populationer, hvor rag2 promotor er aktiv. I dobbelt-transgene fisk med B og eller T-ALL, der har udviklet fluorescerende kræftformer med seks måneder B-ALL er svagt fluorescerende kræftformer, der indeholder det meste GFP lave celler. I modsætning hertil kan stærkt fluorescerende fisk havnen enten isolerede T-ALL eller blandede populationer af både GFP lav B-ALL og GFP høj T-ALL celler.Som vurderet ved kvantitativ polymerasekædereaktionsanalyse udtrykker GFP-lave celler faktisk højere niveauer af B-celleudskrifter. Og GFP høje celler udtrykker højere niveauer af T-celle gener, LCK og GFP markør. Det er afgørende at lære at genkende fisk med B-ALL ved mikroskopi.Og hvordan man korrekt definere flow cytometri porte til at adskille GFP lav og GFP høje populationer. Efter denne procedure kan du isolere DNA, RNA eller protein fra GFP lav og GFP høje celler til PCR, sekventering, hvad der er i blod eller in vivo transplantation eksperimenter. Når vi lærte LCK GFB fisk har fluorescerende B-celler ud over T-celler, vi kunne studere begge celletyper fra samme dyr til at evaluere B og T-ALL.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish

Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

Although in vitro screens are essential for the initial identification of candidate therapeutic agents, a rigorous assessment of the drug's ability to ...

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

Mame Modeller for 4D live-cell imaging af tumor: mikromiljø interaktioner, Impact malignt Progression

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolation, karakterisering og sammenlignende differentiering af humane Dental Pulp stamceller fra blivende tænder ved hjælp af to forskellige metoder

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Tredimensionelle Cultures: Et værktøj til at studere Normal Acinar Architecture vs malign transformation af brystkræft celler

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Fremgangsmåde til at opnå primær ovariecancer celler fra Solid Prøver

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studere i bugspytkirtlen Kræft stamceller Karakteristik for udvikling af nye behandlingsstrategier

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Isolation og formering af cirkulerende tumorceller fra en mus Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation

Forkalkning af vaskulære glatte muskelceller og billeddannelse af aorta Forkalkning og Inflammation

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world.  Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and ...

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Isolering og Profilering af MicroRNA-holdige Exosomer fra human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...