Name: isolating malignant and non-malignant b cells from lck:egfp zebrafish
Uploaded: 2019-02-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish at JoVE.com

Vorremmo ringraziare Megan Malone-Perez per cura di zebrafish e il nucleo di cytometry di flusso OUHSC. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da Hyundai Hope su ruote, il centro dell'Oklahoma per l'avanzamento della scienza e tecnologia (HRP-067), un premio del progetto pilota di NIH/NIGMS INBRE (P20 GM103447). JKF detiene il E.L. & Thelma Gaylord dotata di sedia in ematologia-oncologia pediatrica della Fondazione Ospedale dei bambini.

Tutte le procedure che coinvolgono zebrafish sono state approvate dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) presso la University of Oklahoma Health Sciences Center.
1. isolare i linfociti T e B Non-maligne da transgenici lck:eGFP pesce
<ol><li>Anestetizzare il pesce utilizzando 0,02% tricaina (MS-222) in pesci d'acqua del sistema.</li>
	<li>Esaminare il pesce di 2 – 6 mesi per thymi fluorescente, che si trovano presso l'aspetto di dorsomedial della ca...

<ol>
	<li>Paik, E. J., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+development+in+the+zebrafish.">Hematopoietic development in the zebrafish.</a> International Journal of Developmental Biology. 54 (6-7), 1127-1137 (2010).</li><li>Kasheta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+T+reg-like+cells+in+zebrafish.">Identification and characterization of T reg-like cells in zebrafish.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (12), 3519-3530 (2017).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+B+Cell+Development+without+a+Pre-B+Cell+Stage,+Revealed+by+CD79+Fluorescence+Reporter+Transgenes.">Zebrafish B Cell Development without a Pre-B Cell Stage, Revealed by CD79 Fluorescence Reporter Transgenes.</a> Journal of Immunology. 199 (5), 1706-1715 (2017).</li><li>Page, D. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+tracking+of+T+cell+development,+ablation,+and+engraftment+in+transgenic+zebrafish.">In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish.</a> Proceedings of National Academy of Sciences U S A. 101 (19), 7369-7374 (2004).</li><li>Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+zebrafish+to+understand+immunity.">The use of zebrafish to understand immunity.</a> Immunity. 20 (4), 367-379 (2004).</li><li>Frazer, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+T-cell+malignancy+models+established+in+a+zebrafish+phenotypic+screen.">Heritable T-cell malignancy models established in a zebrafish phenotypic screen.</a> Leukemia. 23 (10), 1825-1835 (2009).</li><li>Rudner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shared+acquired+genomic+changes+in+zebrafish+and+human+T-ALL.">Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL.</a> Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).</li><li>Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pten+mediates+Myc+oncogene+dependence+in+a+conditional+zebrafish+model+of+T+cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">Pten mediates Myc oncogene dependence in a conditional zebrafish model of T cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Journal of Experimental Medicine. 208 (8), 1595-1603 (2011).</li><li>Borga, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+B+and+T+cell+acute+lymphoblastic+leukemias+in+zebrafish+driven+by+transgenic+MYC:+implications+for+oncogenesis+and+lymphopoiesis.">Simultaneous B and T cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic MYC: implications for oncogenesis and lymphopoiesis.</a> Leukemia. , (2018).</li><li>Haferlach, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+utility+of+microarray-based+gene+expression+profiling+in+the+diagnosis+and+subclassification+of+leukemia:+report+from+the+International+Microarray+Innovations+in+Leukemia+Study+Group.">Clinical utility of microarray-based gene expression profiling in the diagnosis and subclassification of leukemia: report from the International Microarray Innovations in Leukemia Study Group.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (15), 2529-2537 (2010).</li><li>Novershtern, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Densely+interconnected+transcriptional+circuits+control+cell+states+in+human+hematopoiesis.">Densely interconnected transcriptional circuits control cell states in human hematopoiesis.</a> Cell. 144 (2), 296-309 (2011).</li><li>Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+anatomy+and+histology+of+the+adult+zebrafish.">Normal anatomy and histology of the adult zebrafish.</a> Toxicology Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).</li><li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+organs+from+the+adult+zebrafish.">Dissection of organs from the adult zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2010).</li><li>Pruitt, M. M., Marin, W., Waarts, M. R., de Jong, J. L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+the+Side+Population+in+Myc-induced+T-cell+Acute+Lymphoblastic+Leukemia+in+Zebrafish.">Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (37), (2017).</li><li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants.">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nature Immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).</li><li>Carmona, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptome+analysis+of+fish+immune+cells+provides+insight+into+the+evolution+of+vertebrate+immune+cell+types.">Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types.</a> Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).</li><li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+hematopoietic+and+renal+cell+heterogeneity+in+adult+zebrafish+at+single-cell+resolution+using+RNA+sequencing.">Dissecting hematopoietic and renal cell heterogeneity in adult zebrafish at single-cell resolution using RNA sequencing.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 2875-2887 (2017).</li></ol>

Abbiamo sviluppato e fornire un protocollo per isolare le cellule B da lck:eGFP zebrafish transgenici, l'aggiunta di questo ad altri modelli di d. rerio con B-stirpe etichette3,4. Abbastanza sorprendentemente, l'identificazione delle GFPlo B cellule in questa linea passò inosservato dalla relativa descrizione nel 2004. In genere, lck è considerato specifico delle cellule T6, ma recenti studi trovano ...

Zebrafish offrono potenti attributi, ad esempio manipolabilità genetica, alta fecondità, ottico traslucenza e rapido sviluppo che semplificano lo sviluppo vertebrato Studio utilizzando approcci genetici. Questi vantaggi, insieme con le funzionalità condivise di teleostei e mammiferi ematopoiesi, rendono d. rerio ideale per analisi in vivo della funzione del linfocita e linfopoiesi, dalla loro prima apparizione nelle larve durante l'età adulta. Sviluppo di sangue in zebrafish si basa su processi genetici ben conservati che vengono condivisi con i mammiferi, e questi si estendono per il sistema immunitario adattativo. Inoltre, i meccanismi molecolari che regolano lo sviluppo linfoide notevolmente sono conservate tra zebrafish e mammiferi1.
Negli ultimi 2 decenni, linee transgeniche d. rerio lignaggi di sangue specifico tale etichetta e linee mutanti carenti in queste linee cellulari sono state create2,3,4,5. Uno di questi, la linea transgenica lck:eGFP , utilizza il promotore di zebrafish del linfocita proteina tirosina chinasi (lck) a guidare la GFP espressione6. Questo gene, che è altamente espressa da precursori di LAL-T e i linfociti T maturi, permette in vivo monitoraggio dello sviluppo della cellula T timica ed ex vivo purificazione delle cellule di T-stirpe di FACS7. In precedenza, abbiamo usato questa linea in uno schermo di mutagenesi ENU avanti-genetica per identificare i mutanti di germline inclini a LAL-T e per studiare eventi genetici somatico acquisito legati a cellula T oncogenesi8,9.
Recentemente, il nostro laboratorio esteso ulteriormente l'utilità di lck:eGFP zebrafish. In transgenici doppio rag2:hMYC (MYC umano), lck:eGFP D. rerio che sono noti per sviluppare LAL-T 10, abbiamo scoperto che LAL-B si verificano anche11. A differenza di LAL-T in questo modello, che reagiscono in brillantemente dovuto l'alta espressione di GFP, B-tutti sono scarsamente-fluorescenti a causa di bassi livelli di GFP, permettendo il pesce con B-ALL per essere distinti grossolanamente da quelli con LAL-T da microscopia fluorescente. Questa espressione di GFP differenziale consente inoltre la separazione di cellule GFPlo B-tutti da GFPCiao cellule T-ALL usando FACS11. Inoltre, espressione di basso lck non è univoco per zebrafish B-ALL, come umano anche esprimere bassi livelli di B-ALL di LCK11,12. Allo stesso modo, le cellule normali di B-stirpe di d. rerio, topi e gli esseri umani esprimono anche bassi livelli di lck/LckLCK, con cellule di B acerbe che hanno la più alta espressione11,13. Su una base per cellula, le cellule di B-stirpe in linee di zebrafish o derivato di lckeGFP express 1-10% tanto GFP come linfociti T. Questi GFPlo cellule espressa caratteristica delle cellule di B mRNA come pax5, cd79b, blnk, btk, ighm, ighze altri e possa essere purificate dal midollo osseo, timo, milza o periferico 11del sangue. Di conseguenza, entrambi LAL-B e T-cellule possono essere isolato da lckeGFP zebrafish e nel caso di rag2hMYC, lckeGFP animali, anche le cellule di B - e T-ALL11.
Qui, vi presentiamo il nostro protocollo efficiente FACS-purificare B cellule benigne da lck:eGFP zebrafish e benigne o maligne cellule di B di rag2hMYC; LCK:EGFP pesce, utilizzando vari tessuti di origine. Tali cellule allo stesso modo possono essere quantificate mediante citometria a flusso senza isolamento FACS, se lo si desidera. Scoperta di espressione bassa lck - e di conseguenza bassa espressione di GFP-di B cellule apre nuove porte di possibilità sperimentali per lckeGFP zebrafish, come in vivo B cella studi evolutivi. Così, questa linea transgenica, primo luogo segnalata in 2004, ha una nuova vita come cerchiamo di utilizzarlo per raccogliere nuove intuizioni relative all'immunità adattativa zebrafish.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 &#181;m mesh</td>
			<td>Sefar Filter technology</td>
			<td>7050-1220-000-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap</td>
			<td>Falcon Corning Brand</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tube</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>525-0448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ APO 100 Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoflex</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS-Qi1MC camara</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSJazz</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v10.2</td>
			<td>FlowJo, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lck:eGFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See Langeneu et al., 2004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Version 4.13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin -Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle micro-tube homogenizers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>64788-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Transfer pippetes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rag2:hMYC-ER</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See Gutierrez et al., 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Media 1640 1X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11835-030</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating malignant and non-malignant b cells from lck:egfp zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) sono un potente modello per studiare lo sviluppo del linfocita. Come mammiferi, d. rerio possiedono un sistema immunitario adattativo che include i linfociti B e T. Gli studi di zebrafish linfopoiesi sono difficili perché anticorpi che riconoscono i marcatori di superficie delle cellule di d. rerio non sono generalmente disponibili, isolamento e caratterizzazione di popolazioni linfocitarie diverse, tra cui B-stirpe di complicazione cellule. Linee transgeniche con espressione fluoroforo lineage-specifici sono spesso utilizzati per aggirare questa sfida. La linea transgenica lck:eGFP è stata utilizzata per studiare lo sviluppo delle cellule di T di d. rerio e inoltre è stata utilizzata per lo sviluppo delle cellule di T di modello e leucemia linfoblastica acuta (LAL-T). Anche se lck:eGFP pesce sono stati ampiamente usati per analizzare il T-stirpe, essi non sono stati utilizzati per studiare le cellule B. Recentemente, abbiamo scoperto che molte cellule di zebrafish B esprimono anche lck, seppur a livelli inferiori. Di conseguenza, le cellule lck:eGFP B similarmente esprimono bassi livelli di GFP. Sulla base di questa individuazione, abbiamo sviluppato un protocollo per purificare le cellule di B-stirpe da lck:eGFP zebrafish, che segnaliamo qui. Il nostro metodo viene descritto come utilizzare un sorter fluorescente-attivata delle cellule (FACS) per purificare le cellule B da lck:eGFP pesce o righe correlate, ad esempio transgenici doppio rag2:hMYC; pesce LCK:EGFP . In queste righe, cellule B, cellule B particolarmente immature, GFP espressa a livelli bassi ma rilevabili, consentendo loro di essere distinto dalle cellule T, che esprimono GFP altamente. B cellule possono essere isolate da midollo osseo, timo, milza, sangue o altri tessuti. Questo protocollo fornisce un nuovo metodo per purificare le cellule di B di d. rerio , abilitazione studi incentrati su temi come lo sviluppo delle cellule B e le malignità del linfocita B.

Abbiamo usato il flusso cytometry per analizzare e FACS per isolare GFPlo e GFPCiao cellule da timo, midollo del rene e la milza di zebrafish transgenici lck:eGFP . Analisi di pesce 3-month-old ha rivelato che il timo contenuto principalmente i linfociti GFP+ . Le cellule GFP+ in gran parte sono state limitate al cancello linfoide precedentemente descritto da Traver et al.17. Due popolazioni distinte di GFP+...

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Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish

Zebrafish transgenici lck:eGFP esprimono GFP altamente nei linfociti T e sono stati usati per studiare lo sviluppo delle cellule T e la leucemia linfoblastica acuta. Questa linea può essere utilizzato per Studio B cellule, che esprimono lck a livelli inferiori. Questo protocollo descrive la purificazione delle cellule di B maligne e benigne da lck:eGFP zebrafish.

Isolando il maligno e le cellule di B Non-maligna da lck:eGFP Zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) are a powerful model to study lymphocyte development. Like mammals, D. rerio possess an adaptive immune system that includes B and ...

Recentemente abbiamo scoperto che molte cellule B nel pesce zebra LCK GFP esprimono bassi livelli di GFP. Questo rende questa linea uno strumento utile per studiare le cellule B e le cellule T. Il vantaggio principale di questa tecnica è che ora possiamo studiare cellule B e cellule T dal pesce zebra LCK GFP o possiamo studiare cellule B-ALL e T-ALL da pesci con cancro.Questi metodi consentono lo sviluppo di cellule B e studi B-ALL sul pesce zebra. Che sono rilevanti per comprendere il sistema immunitario adattivo e le loro neoplasie maligne comuni nel cancro pediatrico. Se non hai mai fatto queste dissezioni prima potresti voler perfezionare la tua tecnica alcune volte fino a quando non puoi ottenere buoni campioni di timo e midollo.La dimostrazione visiva aiuterà gli spettatori a riconoscere il fluoro e il B-ALL nei pesci e a selezionare le impostazioni corrette per discriminare le cellule B e T per il loro isolamento. Dopo l'anestesia con 0,02%Tricaina nell'acqua del sistema ittico utilizzare il filtro GFP su un microscopio a epifluorescenza per esaminare il pesce zebra di due o sei mesi per il timo fluorescente all'aspetto mediale dorsale della cavità branchiale. Dopo aver individuato il timo, mettere il pesce eutanasiato in una piastra di Petri e utilizzare il microscopio fluorescente per rimuovere il timo positivo della GFP.E impostazioni di microscopia a campo brillante per raccogliere il midollo renale e la milza. Posizionare ogni organo raccolto in un tubo da 1,5 millilitri contenente 500 microlitri di mezzo di cernita a freddo e utilizzare un omogeneizzatore di microtubi pestello per omogeneizzare i tessuti sul ghiaccio. Quindi, filtrare il tessuto omogeneizzato attraverso un filtro a rete da 35 micrometri per generare una singola sospensione cellulare e posizionare le cellule sul ghiaccio.A partire da due o quattro mesi utilizzare un microscopio fluorescente per schermare il pesce EGFP a doppia transgenica rag2:hMYC LCK utilizzando impostazioni a bassa esposizione per identificare la leucemia linfoblastica acuta delle cellule T luminose o T-ALL e impostazioni di esposizione elevata per identificare gli animali B-ALL fiochi. Il controllo del tipo selvaggio e il pesce pre-leucemico hanno la GFP localizzata solo nel timo. Categorizzare il pesce in base all'estensione della fluorescenza GFP utilizzando un semplice sistema a tre categorie.I pesci di primo livello dimostrano un segnale fluorescente come un tumore timico con una diffusione locale limitata. I pesci di livello due dimostrano un segnale fluorescente oltre il timo che coinvolge meno del 50% del corpo. E i pesci di livello tre dimostrano un segnale fluorescente che si estende oltre il 50% del corpo.Separare il pesce con ALL da quelli senza cancro. E monitorare il pesce pre-leucemico senza tumori positivi alla GFP una volta al mese per lo sviluppo di nuovi ALL. Per l'isolamento cellulare T o B-ALL utilizzare una lama di rasoio per rimuovere la testa e la regione timica di un pesce di livello tre eutanasiato e posizionare il corpo in una piastra di Petri.Utilizzare una pipetta P-1000 per lavare la cavità peritoneale del pesce con 500 microlitri di mezzo di cernita a freddo, raccogliendo le cellule e il mezzo in un tubo da cinque millilitri. Utilizzando una punta di pipetta fresca iniettare da due a tre volumi aggiuntivi da 200 a 300 microlitri di mezzo di cernita a freddo nella cavità corporea e utilizzare la punta della pipetta per applicare una leggera pressione sul corpo del pesce per estrudere le cellule dalla cavità corporea nel tubo a cinque millilitri. Quindi, filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro a rete da 35 microliter.E posizionare le cellule sul ghiaccio fino alla loro analisi per citometria del flusso. Per l'omogeneizzazione di tutto il corpo utilizzare un omogeneizzatore di microtubi pestello per omogeneizzare il corpo del pesce e aggiungere altri 300 microlitri di mezzo di cernita a freddo al tubo. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro a rete da 35 micrometri, lavando il filtro con un mezzo di smistamento aggiuntivo se necessario fino a quando sul filtro rimangono solo detriti tissutali.Quindi, posizionare le cellule sul ghiaccio fino alla loro analisi. Per l'analisi citometrica del flusso delle celle isolate impostare i parametri del citometro di flusso secondo le linee guida del produttore. E acquisire da 10.000 a 50.000 eventi per impostare i parametri di dispersione e dispersione laterale in avanti per definire le porte cellulari dei linfociti e dei progenitori ed escludere i detriti cellulari.Escludere i farsettali cellulari e utilizzare i cancelli linfoidi e/o precursori per determinare il numero e la percentuale delle cellule positive della GFP. L'uso della ficoertrarina e le intensità della GFP definiscono le porte per le cellule negative della GFP rispetto alle cellule basse della GFP rispetto alle cellule alte della GFP. Imparare dove posizionare i cancelli per isolare le cellule basse e alte del GFP è fondamentale per ottenere popolazioni di cellule B e T pure.Due distinte popolazioni positive della GFP, cellule GFP basse B e cellule GFP ad alto T possono essere ottenute dal timo. Le cellule B residenti nel midollo renale di zebrafish di tre mesi esprimono bassi livelli di GFP. Le cellule alte della GFP sono scarse, tuttavia, il che indica che solo una piccola percentuale di linfociti T è presente nel midollo a tre mesi di età.Allo stesso modo, i campioni splenici mostrano percentuali più elevate di GFP basse rispetto alle cellule alte della GFP. Nei pesci a doppia transgenica che non hanno ancora sviluppato leucemia linfoblastica acuta, l'espressione della GFP nel timo, nel midollo e nella milza è simile a quella osservata nei pesci LCK EGFP monotrasgenici. Tuttavia, il numero di linfociti per organo è aumentato.Presumibilmente, a causa dell'espansione guidata dal MYC delle popolazioni di cellule B e T immature in cui il promotore rag2 è attivo. Nei pesci a doppia transgenica con B e o T-ALL che hanno sviluppato tumori fluorescenti di sei mesi B-ALL sono malati di tumori fluorescenti contenenti principalmente cellule basse GFP. Al contrario, i pesci fluorescenti possono ospitare popolazioni isolate di T-ALL o miste di cellule T-ALL basse e GFP basse di GFP.Infatti, come valutato dall'analisi quantitativa della reazione a catena della polimerasi, le cellule basse GFP esprimono livelli più elevati di trascrizioni di cellule B. E le cellule alte della GFP esprimono livelli più elevati di geni cellulari T, LCK e il marcatore GFP. È fondamentale imparare a riconoscere il pesce con B-ALL per microscopia.E come definire correttamente le porte di citometria del flusso per separare le popolazioni basse e gfp alte. Seguendo questa procedura, è possibile isolare DNA, RNA o proteine da cellule basse gfp e gfp alte per PCR, sequenziamento, ciò che c'è nel sangue o esperimenti di trapianto in vivo. Una volta appreso che i pesci LCK GFB hanno cellule B fluorescenti oltre alle cellule T, potremmo studiare entrambi i tipi di cellule dello stesso animale per valutare B e T-ALL.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish

Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

Xenotrapianto ortotopico di Human-luciferasi con tag cellule maligne del tumore della guaina dei nervi periferici per In vivo Test di agenti terapeutici candidati

Although in vitro screens are essential for the initial identification of candidate therapeutic agents, a rigorous assessment of the drug's ability to ...

Ricerca

Medicina

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Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Isolamento e propagazione di cellule tumorali circolanti da un mouse cancro modello

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation

Calcificazione vascolare cellule muscolari lisce e imaging di aortica calcificazioni e infiammazione

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world.  Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and ...

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Isolamento e Profiling di MicroRNA contenenti Esosomi da bile umana

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...