Name: isolating malignant and non-malignant b cells from lck:egfp zebrafish
Uploaded: 2019-02-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish at JoVE.com

우리는 메 간 말론-페레즈 zebrafish 관리, 그리고 OUHSC 흐름 cytometry 코어를 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 현대 바퀴, 오클라호마 센터 발전의 과학 기술 (HRP-067), NIH/NIGMS INBRE 파일럿 프로젝트 수상 (P20 GM103447)에 대 한 희망에서 교부 금에 의해 지원 되었다. JKF 일정 & 델 마 게이 부여의 자에서 소아 혈액학-종양학 어린이 병원 재단의 보유합니다.

제 브라와 관련 된 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 오클라호마 대학 건강 과학 센터에 의해 승인 되었다.
1. 유전자 변형 lck:eGFP 생선 에서 비 악성 B 및 T 림프 구 분리
<ol><li>물고기 물고기 시스템 물에 0.02 %tricaine (MS-222)를 사용 하 여 anesthetize</li>
	<li>제 브라와 다른 teleosts14의 아가미 구멍의 dorsomedial 측면에 있는 형광 t...

<ol>
	<li>Paik, E. J., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+development+in+the+zebrafish.">Hematopoietic development in the zebrafish.</a> International Journal of Developmental Biology. 54 (6-7), 1127-1137 (2010).</li><li>Kasheta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+T+reg-like+cells+in+zebrafish.">Identification and characterization of T reg-like cells in zebrafish.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (12), 3519-3530 (2017).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+B+Cell+Development+without+a+Pre-B+Cell+Stage,+Revealed+by+CD79+Fluorescence+Reporter+Transgenes.">Zebrafish B Cell Development without a Pre-B Cell Stage, Revealed by CD79 Fluorescence Reporter Transgenes.</a> Journal of Immunology. 199 (5), 1706-1715 (2017).</li><li>Page, D. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+tracking+of+T+cell+development,+ablation,+and+engraftment+in+transgenic+zebrafish.">In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish.</a> Proceedings of National Academy of Sciences U S A. 101 (19), 7369-7374 (2004).</li><li>Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+zebrafish+to+understand+immunity.">The use of zebrafish to understand immunity.</a> Immunity. 20 (4), 367-379 (2004).</li><li>Frazer, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+T-cell+malignancy+models+established+in+a+zebrafish+phenotypic+screen.">Heritable T-cell malignancy models established in a zebrafish phenotypic screen.</a> Leukemia. 23 (10), 1825-1835 (2009).</li><li>Rudner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shared+acquired+genomic+changes+in+zebrafish+and+human+T-ALL.">Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL.</a> Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).</li><li>Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pten+mediates+Myc+oncogene+dependence+in+a+conditional+zebrafish+model+of+T+cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">Pten mediates Myc oncogene dependence in a conditional zebrafish model of T cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Journal of Experimental Medicine. 208 (8), 1595-1603 (2011).</li><li>Borga, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+B+and+T+cell+acute+lymphoblastic+leukemias+in+zebrafish+driven+by+transgenic+MYC:+implications+for+oncogenesis+and+lymphopoiesis.">Simultaneous B and T cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic MYC: implications for oncogenesis and lymphopoiesis.</a> Leukemia. , (2018).</li><li>Haferlach, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+utility+of+microarray-based+gene+expression+profiling+in+the+diagnosis+and+subclassification+of+leukemia:+report+from+the+International+Microarray+Innovations+in+Leukemia+Study+Group.">Clinical utility of microarray-based gene expression profiling in the diagnosis and subclassification of leukemia: report from the International Microarray Innovations in Leukemia Study Group.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (15), 2529-2537 (2010).</li><li>Novershtern, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Densely+interconnected+transcriptional+circuits+control+cell+states+in+human+hematopoiesis.">Densely interconnected transcriptional circuits control cell states in human hematopoiesis.</a> Cell. 144 (2), 296-309 (2011).</li><li>Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+anatomy+and+histology+of+the+adult+zebrafish.">Normal anatomy and histology of the adult zebrafish.</a> Toxicology Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).</li><li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+organs+from+the+adult+zebrafish.">Dissection of organs from the adult zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2010).</li><li>Pruitt, M. M., Marin, W., Waarts, M. R., de Jong, J. L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+the+Side+Population+in+Myc-induced+T-cell+Acute+Lymphoblastic+Leukemia+in+Zebrafish.">Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (37), (2017).</li><li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants.">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nature Immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).</li><li>Carmona, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptome+analysis+of+fish+immune+cells+provides+insight+into+the+evolution+of+vertebrate+immune+cell+types.">Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types.</a> Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).</li><li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+hematopoietic+and+renal+cell+heterogeneity+in+adult+zebrafish+at+single-cell+resolution+using+RNA+sequencing.">Dissecting hematopoietic and renal cell heterogeneity in adult zebrafish at single-cell resolution using RNA sequencing.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 2875-2887 (2017).</li></ol>

우리가 개발 하 고이 B 계보 레이블3,4다른 D. rerio 모델에 추가 하는 것은 lck:eGFP 유전자 변형 zebrafish에서 B 세포 격리 프로토콜을 제공. 약간 의외로, GFP로 B 셀이이 라인의 식별이 갔다 2004 년에 그것의 설명부터 주목. 일반적으로, lck 는 T 세포 관련6, 간주 됩니다 하지만 최근 연구 발견 예기치 않은 lck...

Zebrafish는 강력한 특성, 유전자 manipulability, 높은 통치, 광학 반투명, 급속 한 발전 등 유전자 방법을 사용 하 여 공부 척추 개발을 용이 하 게 제공 합니다. Teleost 및 포유류 조의 공유 기능과 함께 이러한 장점을 D. rerio 애벌레 성인 기 동안에 그들의 가장 이른 외관에서 lymphopoiesis 및 림프 구 기능 vivo에서 분석에 적합 확인합니다. Zebrafish에 혈액 개발, 포유류와 공유 하는 잘 보존 유전 프로세스에 의존 하 고 이러한 적응형 면역 체계에 확장. 또한, 림프 개발을 경 세 하는 분자 메커니즘은 너무나 zebrafish 및 포유류1사이 보존 하 고.
지난 2 년간 유전자 변형 D. rerio 라인 그 레이블 특정 혈액 계보 그리고 돌연변이 라인 결핍이 계보에 생성 된2,3,,45. 이 lck:eGFP 유전자 변형 라인 중 하나 GFP 식6드라이브 zebrafish 림프 구 단백질 티로신 키 니 아 제 (lck) 발기인을 사용 하 여. 높은 T-혈통 선구자와 성숙한 T 세포에 의해 표현,이 유전자 vivo FACS7thymic T 세포 개발의 및 T-계보 세포의 생체 내 정화 전 추적에서 있습니다. 이전에 우리 사용이 줄 앞으로 유전 ENU mutagenesis 화면에 T-모든 경향이 생식 돌연변이 식별 하 고 somatically 인수 유전자 T 셀 발암8,9에 연결 된 이벤트를 공부 하.
최근, 우리 연구소는 더 lck:eGFP zebrafish의 유틸리티 확장. 이중 유전자 변형 rag2:hMYC (인간 MYC), T-모든 10, 개발 된 lck:eGFP D. rerio 에서 우리가 발견 B 계보도11를 발생 하는 모든. T-모든 높은 GFP 식 인해 밝은 형광,이 모델에서와 달리 B-모든은 어렴풋이 형광 수준 때문에 낮은 GFP, B-모든 구별 될 조잡 한 그 T-모든 형광 현미경 검사 법에 의해를 가진 물고기를 수 있도록. 이 차동 GFP 식 또한 허용 GFP로 B-모든 세포의 분리에서 GFP안녕하세요 FACS11를 사용 하 여 T-모든 셀. 또한, 낮은 lck 식 고유 하지 않습니다 제 B-전체, 브라를 LCK11,12의 인간의 B-모든 익스프레스 또한 낮은 수준으로. 마찬가지로, D. rerio, 쥐, 및 인간의 정상적인 B 계보 세포는 또한 lck의 저급을 표현 /LckLCK, 미 성숙한 B 세포와 데 높은 식11,13. 셀 당 기준 lckeGFP zebrafish 또는 파생 라인에 B 계보 세포 표현 1-10% 만큼 GFP T 림프 톨으로. 이러한 GFP로 표현 특성 등 pax5, cd79b, blnk, btk, ighm, ighz, B 세포 mRNAs 세포와 골 수, 흉 선, 비장, 또는 주변에서 순화 될 수 있다 피11. 따라서, 둘 다 B-및 T-계보 세포 수 격리 lckeGFP zebrafish, 그리고 rag2hMYC, lckeGFP 동물, 뿐만 아니라 B 및 T 모든 셀의 경우11.
여기, 우리가 현재 우리의 프로토콜 효율적으로 FACS 정화 비 악성 B 세포에 lck:eGFP zebrafish, 및 rag2hMYC;의 비 악성 또는 악성 B 세포에서 lck:eGFP 물고기, 다양 한 소스 티슈를 사용 하 여. 원하는 경우 이러한 셀 마찬가지로 FACS 격리 없이 cytometry에 의해 측정할 수 수 있습니다. 낮은 lck 식의 발견-GFP 식 결과, 낮은-b 셀 비보 B 세포 발달 연구와 같은 lckeGFP zebrafish에 대 한 실험 가능성의 새로운 문의 엽니다. 따라서, 2004 년에 처음 보고 된이 유전자 변형 라인 우리가 추구 zebrafish 적응 면역에 관한 신선한 통찰력을 수집에 그것을 활용 새로운 생명이 있다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 &#181;m mesh</td>
			<td>Sefar Filter technology</td>
			<td>7050-1220-000-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap</td>
			<td>Falcon Corning Brand</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tube</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>525-0448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ APO 100 Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoflex</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS-Qi1MC camara</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSJazz</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v10.2</td>
			<td>FlowJo, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lck:eGFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See Langeneu et al., 2004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Version 4.13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin -Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle micro-tube homogenizers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>64788-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Transfer pippetes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rag2:hMYC-ER</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See Gutierrez et al., 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Media 1640 1X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11835-030</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating malignant and non-malignant b cells from lck:egfp zebrafish

Zebrafish (Danio rerio)는 림프 구 개발을 공부 하는 강력한 모델입니다. 포유류 처럼, D. rerio B와 T 림프 톨을 포함 하는 적합 한 면역 계통을 소유. D. rerio 세포 표면 마커를 인식 하는 항 체는 일반적으로 분리 및 B 계보를 포함 하 여 다른 림프 구 인구의 특성을 복잡 하 게 사용할 수 없습니다 때문에 제 브라 lymphopoiesis의 연구는 어려운 셀입니다. 계보 특정 fluorophore 식 유전자 변형 라인 자주이 문제를 우회 하는 데 사용 됩니다. 유전자 변형 lck:eGFP 라인 D. rerio T 셀 개발, 연구 하는 데 사용 되었습니다 그리고 또한 모델 T 세포 개발 및 급성 림프 구성 백혈병 (T-모든) 활용 되었습니다. Lck:eGFP 물고기 널리 사용 되었습니다 T-계보를 분석, 하지만 그들은 하지 B 세포 연구에 사용 되었습니다. 최근, 우리가 발견 lck을 표현 하는 많은 zebrafish B 셀 낮은 수준에 쓰 신. 따라서, lck:eGFP B 세포는 마찬가지로 GFP의 저급을 표현 한다. 이에 따라, 우리 lck:eGFP zebrafish, 우리가 보고 여기에서 B 계보 세포를 정화 하는 프로토콜을 개발 했다. 우리의 방법은 정화 lck:eGFP 물고기 또는 이중 유전자 변형 rag2:hMYC; 등 관련된 라인에서 B 세포 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS)를 활용 하는 방법을 설명 합니다. lck:eGFP 물고기입니다. 에이 라인, B 세포, 특히 미 성숙한 B 세포, 낮은 하지만 감지 수준 급행 GFP 그들 고유 높은 GFP를 표현 하는 T 세포에서 허용. B 세포는 골 수, 흉 선, 비장, 혈액, 또는 다른 조직 으로부터 격리 될 수 있습니다. 이 프로토콜에는 정화 D. rerio B 세포, B 세포 개발 및 B 림프 구 악성 같은 주제에 초점을 맞춘 연구를 활성화 하는 새로운 방법을 제공 합니다.

우리 사용 분석 cytometry FACS GFP소호 및 GFP안녕하세요 세포 thymus, 신장 골 수, 및 lck:eGFP 유전자 변형 zebrafish의 비장 으로부터 분리. 3 개월 된 물고기의 분석 thymus 포함 GFP+ 세포 주로 밝혔다. GFP+ 세포 림프 게이트 이전 Traver 외.17에 의해 설명에 주로 국한 되었다. 두 가지 GFP+ 인구, GFPlo와 GFP안녕하?...

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Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish

유전자 변형 lck:eGFP zebrafish T 림프 톨에 GFP를 높게 표현 하 고 T 세포 개발 및 급성 림프 구성 백혈병을 연구 하는 데 사용 되었습니다. 이 선 낮은 수준에서 lck 표현 연구 B 셀에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜 lck:eGFP 제 브라에서 악성 및 비 악성 B 세포의 정화를 설명합니다.

Lck:eGFP 제 브라에서에서 Malignant 및 비 Malignant B 세포 분리

Zebrafish (Danio rerio) are a powerful model to study lymphocyte development. Like mammals, D. rerio possess an adaptive immune system that includes B and ...

우리는 최근에 LCK GFP 제브라피쉬에 있는 많은 B 세포가 GFP의 낮은 수준을 표현하는 다는 것을 것을을 발견했습니다. 이것은 이 줄을 T 세포뿐만 아니라 B 세포를 연구하기위한 유용한 도구입니다. 이 기술의 주요 장점은 지금 우리가 LCK GFP 제브라피시에서 B 세포와 T 세포를 공부할 수 있고 암에 있는 물고기에서 B-ALL 및 T-ALL 세포를 공부할 수 있다는 것입니다.이러한 방법을 통해 제브라피시에서 B 세포 개발 및 B-ALL 연구를 가능하게 합니다. 적응형 면역 체계를 이해하는 데 관련이 있으며 소아암에서 흔히 볼 수 있는 악성 종양입니다. 좋은 흉선과 골수 샘플을 얻을 수 있을 때까지 기술을 몇 번 구체화하려는 경우가 있습니다.시각적 데모는 시청자가 물고기에서 불소와 B-ALL을 인식하고 격리를 위해 B 및 T 셀을 분리하기 위한 올바른 설정을 선택하는 데 도움이 됩니다. 물고기 시스템에서 0.02%의 트리카인을 마취한 후 지분 내측 양상에서 형광 티미에 대한 2~6개월 된 제브라피시를 검사하기 위해 상피성 현미경에 GFP 필터를 사용합니다. 흉선을 찾은 후 페트리 접시에 안락사 된 생선을 배치하고 형광 현미경을 사용하여 GFP 긍정적 인 티미를 제거합니다.그리고 신장 골수와 비장을 수확하는 밝은 필드 현미경 검사 설정. 수집된 각 장기를 1.5 밀리리터 튜브에 놓고 500마이크로리터의 냉기 선별 매체를 포함하고 유봉 마이크로튜브 균질화기를 사용하여 얼음에 있는 조직을 균질화합니다. 이어서, 35 마이크로미터 메쉬 필터를 통해 균질화된 조직을 변형하여 단일 세포 현탁액을 생성하고 세포를 얼음 위에 놓습니다.2~4개월부터 는 형광 현미경을 사용하여 이중 형질성 rag2:hMYC LCK EGFP 물고기를 낮은 노출 설정을 사용하여 밝은 T 세포 급성 림프구성 백혈병 또는 T-ALL 및 고노출 설정을 식별하여 희미한 B-ALL 동물을 식별합니다. 야생형 조절및 백혈병 전 물고기는 GFP가 흉선에서만 국한되어 있다. 간단한 세 가지 범주 시스템을 사용하여 GFP 형광의 정도를 기준으로 물고기를 분류합니다.레벨 1 물고기는 제한된 국소 확산을 가진 흉종양으로 형광 신호를 보여줍니다. 레벨 2 물고기는 신체의 50 % 미만을 포함하는 흉선 너머의 형광 신호를 보여줍니다. 그리고 레벨 3 물고기는 신체의 50 %를 넘어 확장 형광 신호를 보여줍니다.모든 물고기와 모든 것을 암이없는 것과 분리하십시오. 그리고 새로운 ALL의 발달을 위해 매월 한 번 GFP 양성 종양없이 전 백혈병 물고기를 모니터링한다. T 또는 B-ALL 셀 절연의 경우 면도날을 사용하여 안락사 된 레벨 3 물고기의 머리와 흉선 부위를 제거하고 시체를 페트리 접시에 넣습니다.P-1000 파이펫을 사용하여 500마이크로리터의 냉기 선별 매체로 물고기 복막 구멍을 세척하여 5밀리리터 튜브에서 세포와 배지를 수집합니다. 신선한 파이펫 팁을 사용하여 2-3마이크로리터 부피를 체공에 넣고 파이펫 끝을 사용하여 체내에서 세포를 5밀리리터 튜브로 돌출합니다. 그런 다음 35 마이크로리터 메쉬 필터를 통해 세포 현탁액을 변형시보도록 합니다.그리고 세포 측정을 유동하여 분석 할 때까지 세포를 얼음에 놓습니다. 전신 균질화를 위해 유봉 마이크로튜브 균질화제를 사용하여 물고기의 신체를 균질화하고 튜브에 차가운 선별 매체의 300 마이크로리터를 추가로 추가합니다. 35 마이크로미터 메쉬 필터를 통해 세포 현탁액을 필터링하고, 필터에 티슈 파편만 남아있을 때까지 필요에 따라 추가 선별 매체로 필터를 세척합니다.그런 다음 분석할 때까지 세포를 얼음 위에 놓습니다. 격리된 세포의 유량 세포 측정 해석을 위해 제조업체의 지침에 따라 유동 세포계 매개변수를 설정합니다. 그리고 림프구 및 전구 세포 게이트를 정의하고 세포 이물질을 배제하기 위한 전방 분산 및 측면 산란 파라미터를 설정하고 셀룰러 이물질을 배제하기 위해 10, 000 ~ 50, 000 이벤트를 획득한다.세포 두 배를 배제하고 림프구 및/또는 전구체 게이트를 사용하여 GFP 양성 세포의 수와 백분율을 결정합니다. 물리에리트린과 GFP 강도를 사용하면 GFP 음성에 대한 게이트를 GFP 의 낮은 GFP 고세포에 비해 정의합니다. GFP 낮은 및 GFP 높은 세포를 격리하기 위한 문을 어디에 배치할지 배우는 것은 순수한 B 및 T 세포 집단을 얻는 데 중요합니다.두 개의 별개의 GFP 양성 인구, GFP 낮은 B 세포 및 GFP 높은 T 세포는 흉선으로부터 얻을 수 있다. 3개월 된 제브라피쉬의 신장 골수에 거주하는 B 세포는 GFP의 낮은 수준을 표현한다. GFP 높은 세포는 그러나 부족합니다, T 림프구의 단지 작은 백분율이 나이의 3 달에 골수에 존재한다는 것을 나타내는.마찬가지로, 비장 샘플은 GFP 높은 세포보다 낮은 GFP의 높은 비율을 보여줍니다. 아직 급성 림프 구성 백혈병을 개발하지 않은 이중 형균 물고기에서, 흉골, 골수 및 비장의 GFP 발현은 단일 형질전환 LCK EGFP 물고기에서 관찰된 것과 유사합니다. 그러나, 기관 당 림프구의 수가 증가.아마도, 때문에 RAG2 프로모터가 활성화되는 미성숙한 B와 T 세포 인구의 MYC 구동 확장. 6개월에 의하여 형광암을 개발한 B 및 또는 T-ALL을 가진 이중 형질전환 물고기에서 B-ALL은 주로 GFP 저세포를 포함하는 희미하게 형광암입니다. 대조적으로, 밝은 형광 물고기는 GFP 낮은 B-ALL 및 GFP 높은 T-ALL 세포의 고립된 T-ALL 또는 혼합된 인구 둘 다를 수용할 수 있습니다.실제로, 정량적 중합체 연쇄 반응 분석에 의해 평가된 바와 같이 GFP 저세포는 B 세포 전사체의 상부를 발현한다. 및 GFP 높은 세포는 T 세포 유전자, LCK 및 GFP 마커의 상부를 발현합니다. 현미경으로 B-ALL로 물고기를 인식하는 방법을 배우는 것이 중요합니다.그리고 GFP 낮은 및 GFP 높은 인구를 분리하기위한 흐름 세포측정 게이트를 적절하게 정의하는 방법. 이 절차에 따라, 당신은 PCR, 시퀀싱, 혈액 또는 생체 내 이식 실험에 대한 GFP 낮은 및 GFP 높은 세포에서 DNA, RNA, 또는 단백질을 분리 할 수 있습니다. LCK GFB 물고기가 T 세포 이외에 형광 B 세포를 가지고 있다는 것을 알게 되면 B와 T-ALL을 평가하기 위해 동일한 동물에서 두 세포 유형을 연구할 수 있었습니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish

Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

대한 인간 루시페라제 태그가 추가된 악성 주변 신경 쉬스 종양 세포 Orthotopic Xenografting 생체내에</em후보 치료 대리점> 테스트

Although in vitro screens are essential for the initial identification of candidate therapeutic agents, a rigorous assessment of the drug's ability to ...

연구

의학

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

부분 Pancreatectomized 환자에서 인간 아일 레츠의 분리

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

종양의 4D 라이브 세포 이미징을위한 MAME 모델 : Microenvironment 상호 작용 영향을 미치는 악성 진행

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

인간 치과 펄프의 줄기 세포의 분리, 특성화 및 비교 차별화 두 가지 방법을 사용하여 영구 치아에서 파생

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

세 가지 차원 문화 : 유방 세포의 악성 변형 대 일반 선포 건축을 연구하는 도구

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

고체 시편에서 기본 난소 암 세포를 얻는 방법

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

췌장암 새로운 치료 전략을 개발하기위한 전지 특성 줄기 공부

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

마우스 종양 모델에서 종양 세포 순환의 분리 및 전파

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation

대동맥 석회화와 염증의 혈관 평활근 세포 및 이미지의 석회화

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world.  Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and ...

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

격리 및 프로파일 링 마이크로 RNA-포함하는 인간의 담즙에서 엑소 좀을

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...