Name: intramucosal inoculation of squamous cell carcinoma cells in mice for tumor immune profiling and treatment response assessment
Uploaded: 2019-04-22T14:00:00
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Animale tutte le procedure sono state eseguite in conformità con un approvato istituzionale animale cura e uso Comitato (IACUC) protocollo della University of Colorado Denver (protocollo n. 00250).
1. tumore coltura cellulare
Nota: B4B8 e LY2 linee cellulari sono state utilizzate per generare tumori HNSCC ortotopico: B4B8 cellule del tumore sono stata derivate da cheratinociti della mucosa cancerogeno-trasformate (da topi BALB/C)11<...

<ol>
	<li>Chaturvedi, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worldwide+trends+in+incidence+rates+for+oral+cavity+and+oropharyngeal+cancers.">Worldwide trends in incidence rates for oral cavity and oropharyngeal cancers.</a> Journal of Clinical Oncology. 31 (36), 4550-4559 (2013).</li><li>Ang, K. K., Sturgis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+papillomavirus+as+a+marker+of+the+natural+history+and+response+to+therapy+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">Human papillomavirus as a marker of the natural history and response to therapy of head and neck squamous cell carcinoma.</a> Seminars in Radiation Oncology. 22 (2), 128-142 (2012).</li><li>Amin, M. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4NQO+carcinogenesis:+a+mouse+model+of+oral+cavity+squamous+cell+carcinoma.">4NQO carcinogenesis: a mouse model of oral cavity squamous cell carcinoma.</a> Head &amp; Neck. 16 (5), 424-432 (1994).</li><li>Tang, X. H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. 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R., Chen, Z., Oechsli, M. N., Hendler, F. J., Van Waes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+expression+of+CD80+is+a+marker+for+increased+tumorigenicity+in+a+new+murine+model+of+oral+squamous-cell+carcinoma.">Decreased expression of CD80 is a marker for increased tumorigenicity in a new murine model of oral squamous-cell carcinoma.</a> International Journal of Cancer. 82 (3), 377-384 (1999).</li><li>Yuspa, S. H., Hawley-Nelson, P., Koehler, B., Stanley, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+transformation+markers+in+differentiating+epidermal+cell+lines+in+culture.">A survey of transformation markers in differentiating epidermal cell lines in culture.</a> Cancer Research. 40 (12), 4694-4703 (1980).</li><li>Chen, Z., Smith, C. W., Kiel, D., Van Waes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+variants+derived+following+in+vivo+tumor+progression+of+an+in+vitro+transformed+squamous+cell+carcinoma+line+acquire+a+differential+growth+advantage+requiring+tumor-host+interaction.">Metastatic variants derived following in vivo tumor progression of an in vitro transformed squamous cell carcinoma line acquire a differential growth advantage requiring tumor-host interaction.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 15 (5), 527-537 (1997).</li><li>Euhus, D. M., Hudd, C., LaRegina, M. C., Johnson, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+measurement+in+the+nude+mouse.">Tumor measurement in the nude mouse.</a> Journal of Surgical Oncology. 31 (4), 229-234 (1986).</li><li>Tomayko, M. M., Reynolds, C. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+Mouse+Models+of+Clinical+Disease.">Humanized Mouse Models of Clinical Disease.</a> Annual Review of Pathology. 12, 187-215 (2017).</li><li>Oweida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation+sensitizes+tumors+to+PD-L1+immune+checkpoint+blockade+in+orthotopic+murine+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">Ionizing radiation sensitizes tumors to PD-L1 immune checkpoint blockade in orthotopic murine head and neck squamous cell carcinoma.</a> OncoImmunology. 6 (10), e1356153 (2017).</li><li>Ferris, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+evaluations+of+nivolumab+(nivo)+versus+investigator&#8217;s+choice+(IC)+chemotherapy+for+recurrent+or+metastatic+(R/M)+squamous+cell+carcinoma+of+the+head+and+neck+(SCCHN):+CheckMate+141.">Further evaluations of nivolumab (nivo) versus investigator&#8217;s choice (IC) chemotherapy for recurrent or metastatic (R/M) squamous cell carcinoma of the head and neck (SCCHN): CheckMate 141.</a> Journal of Clinical Oncology. 34, (2016).</li><li>Ferris, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab+for+Recurrent+Squamous-Cell+Carcinoma+of+the+Head+and+Neck.">Nivolumab for Recurrent Squamous-Cell Carcinoma of the Head and Neck.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1856-1867 (2016).</li><li>Harrington, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab+versus+standard,+single-agent+therapy+of+investigator's+choice+in+recurrent+or+metastatic+squamous+cell+carcinoma+of+the+head+and+neck+(CheckMate+141):+health-related+quality-of-life+results+from+a+randomised,+phase+3+trial.">Nivolumab versus standard, single-agent therapy of investigator's choice in recurrent or metastatic squamous cell carcinoma of the head and neck (CheckMate 141): health-related quality-of-life results from a randomised, phase 3 trial.</a> The Lancet Oncology. 18 (8), 1104-1115 (2017).</li><li>Kiyota, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+randomized,+open-label,+Phase+III+clinical+trial+of+nivolumab+vs.+therapy+of+investigator's+choice+in+recurrent+squamous+cell+carcinoma+of+the+head+and+neck:+A+subanalysis+of+Asian+patients+versus+the+global+population+in+checkmate+141.">A randomized, open-label, Phase III clinical trial of nivolumab vs. therapy of investigator's choice in recurrent squamous cell carcinoma of the head and neck: A subanalysis of Asian patients versus the global population in checkmate 141.</a> Oral Oncology. 73, 138-146 (2017).</li><li>Ling, D. C., Bakkenist, C. J., Ferris, R. L., Clump, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Immunotherapy+in+Head+and+Neck+Cancer.">Role of Immunotherapy in Head and Neck Cancer.</a> Seminars in Radiation Oncology. 28 (1), 12-16 (2018).</li><li>Perri, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioresistance+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+Biological+bases+and+therapeutic+implications.">Radioresistance in head and neck squamous cell carcinoma: Biological bases and therapeutic implications.</a> Head &amp; Neck. 37 (5), 763-770 (2015).</li><li>Yamamoto, V. N., Thylur, D. S., Bauschard, M., Schmale, I., Sinha, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+radioresistance+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">Overcoming radioresistance in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Oral Oncology. 63, 44-51 (2016).</li><li>Bonner, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiotherapy+plus+cetuximab+for+locoregionally+advanced+head+and+neck+cancer:+5-year+survival+data+from+a+phase+3+randomised+trial,+and+relation+between+cetuximab-induced+rash+and+survival.">Radiotherapy plus cetuximab for locoregionally advanced head and neck cancer: 5-year survival data from a phase 3 randomised trial, and relation between cetuximab-induced rash and survival.</a> The Lancet Oncology. 11 (1), 21-28 (2010).</li><li>Bhatia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+EphB4-Ephrin-B2+Signaling+Enhances+Response+to+Cetuximab-Radiation+Therapy+in+Head+and+Neck+Cancers.">Inhibition of EphB4-Ephrin-B2 Signaling Enhances Response to Cetuximab-Radiation Therapy in Head and Neck Cancers.</a> Clinical Cancer Research. 24 (18), 4539-4550 (2018).</li><li>Bhatia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+radiosensitization+in+EphB4+receptor-expressing+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinomas.">Enhancing radiosensitization in EphB4 receptor-expressing Head and Neck Squamous Cell Carcinomas.</a> Scientific Reports. 6, 38792 (2016).</li><li>Tang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+radiation+and+immunotherapy:+a+new+systemic+therapy+for+solid+tumors?.">Combining radiation and immunotherapy: a new systemic therapy for solid tumors?.</a> Cancer Immunology Research. 2 (9), 831-838 (2014).</li><li>Oweida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+radiotherapy+and+PD-L1+blockade+is+mediated+by+TIM-3+upregulation+and+regulatory+T-cell+infiltration.">Resistance to radiotherapy and PD-L1 blockade is mediated by TIM-3 upregulation and regulatory T-cell infiltration.</a> Clinical Cancer Research. , (2018).</li></ol>

Rigorosa analisi e caratterizzazione del microambiente tumorale rappresentano una strategia importante per comprendere i meccanismi di sviluppo del tumore, la progressione e la metastasi e per lo sviluppo di terapie efficaci. Cancro del collo e della testa è una malattia complessa che può avere origine da sedi anatomiche multiple all'interno della regione del collo e della testa. Dei principali ostacoli alla comprensione dei meccanismi di malattia e migliorare la terapia è stata una mancanza di linee cellulari murine ...

HNSCC è la malignità quinto più comune a livello mondiale, con oltre 600.000 pazienti diagnosticati ogni anno1. Malgrado il trattamento aggressivo che coinvolgono la chemioterapia e la radioterapia (RT), la sopravvivenza globale (OS) per i pazienti HNSCC senza infezione umana di papillomavirus (HPV) rimane inferiore al 50% dopo 5 anni2. Questo è in gran parte attribuito a un microambiente tumorale altamente complesse come i tumori possono provenire da diverse sedi anatomiche distinte all'interno della regione testa e del collo, tra cui la mucosa orale, lingua, pavimento della bocca, cavità nasale, cavità orale, faringe, orofaringe e ipofaringe. Inoltre, la regione del collo e della testa è altamente vascolarizzata e contiene quasi la metà di tutti i linfonodi nel corpo3. Maggior parte degli studi che studiano la biologia dei tumori testa e collo si basano su modelli di tumore della regione di fianco. Tali modelli in grado di offrire comprensione nei meccanismi intrinseci del tumore, ma la mancanza del microenvironment del nativo di testa e del collo possa influenzare notevolmente il potenziale traslazionale di tali risultati. Un metodo che è stato utilizzato per indurre tumori orali è attraverso l'esposizione all'agente cancerogeno 9,10-dimetil-1,2-benzanthracene (DMBA)4. Tuttavia, questo metodo è associato con un processo lungo, induce i tumori in ratti e criceti, ma non nei topi, e i tumori risultanti non possiedono molte delle caratteristiche istologiche di differenziata SCCs5,6. L'introduzione del carcinogen4-nitroquinoline 1-ossido (4-NQO), un derivato chinolonico solubile in acqua, ha provocato tumori orali del mouse quando applicato per via orale, ma anche sofferto di lunghi tempi di esposizione (16 settimane) e un numero limitato di prendere tasso all'interno e tra i lotti di topi7,8,9. Al fine di sviluppare modelli clinicamente rilevanti, diversi gruppi utilizzati modelli geneticamente ingegnerizzati che coinvolgono la manipolazione dei driver oncogeni o geni soppressori del tumore, tra cui TP53, TGFB, KRAS, HRA e SMAD410. Questi modelli possono offrire comprensione nei tumori con geni noti driver ma non ricapitolare la complessa eterogeneità di HNSCCs umano.
In questo lavoro, dimostriamo la possibilità di effettuazione di un'inoculazione intramucosal delle cellule di carcinoma di cellule squamous nei topi. Cellule inoculate sviluppano in tumori aggressivi entro 1 settimana dall'iniezione. Simile a HNSCCs umana, i tumori riprodurrsi per metastasi ai linfonodi regionali. Ci caratterizzano le caratteristiche istologiche e cliniche della malattia e consentono di comprendere il microambiente tumorale immuni. Proponiamo che questo modello ortotopico di HNSCC ha applicazioni nella biologia del cancro, immunologia dei tumori e studi preclinici. Meccanismi di evasione immune, progressione del tumore, resistenza al trattamento e le metastasi rappresentano aree di rilevanza clinica che possono essere affrontate utilizzando il modello proposto.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:991px;" width="991">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:327px;">Collagenase III</td>
			<td style="width:217px;">Worthington Biochemical Corp.</td>
			<td style="width:120px;">LS004183</td>
			<td style="width:327px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNase I</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp.</td>
			<td>LS006328</td>
			<td style="width:327px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fc Block (CD16/32)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td style="width:327px;">&#160;Clone 2.4G2&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Flow Cytometry Staining Buffer</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4222-26</td>
			<td style="width:327px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HBSS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14175079</td>
			<td style="width:327px;">no calcium, no magnesium, no pheno red</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Helois mass cytometer</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Matrigel membrane matrix</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>CB-40234B</td>
			<td style="width:327px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MRI Scanner</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>NA</td>
			<td>7.4 Tesla</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RBC lysis buffer</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420301</td>
			<td style="width:327px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypsin inhibitor</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp.</td>
			<td>LS002830</td>
			<td style="width:327px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intramucosal inoculation of squamous cell carcinoma cells in mice for tumor immune profiling and treatment response assessment

Carcinoma di cellule squamous di testa e del collo (HNSCC) è una malattia debilitante e mortale con un'alta prevalenza di ricorrenza e di guasto di trattamento. Per sviluppare meglio le strategie terapeutiche, fattori microambientali del tumore di comprensione che contribuiscono alla resistenza del trattamento è importante. Dei principali ostacoli alla comprensione dei meccanismi di malattia e migliorare la terapia è stata una mancanza di linee murine che ricordano la natura aggressiva e metastatica della HNSCCs umana. Inoltre, una maggioranza di modelli murini impiegano impianti sottocutanei di tumori che mancano importanti caratteristiche fisiologiche della regione testa e collo, compreso alta densità vascolare, vasto sistema vascolare linfatico e flora residente della mucosa. Lo scopo di questo studio è di sviluppare e caratterizzare un modello ortotopico di HNSCC. Ci avvaliamo di due linee cellulari murine geneticamente distinte e tumori stabiliti nel mucosa orale dei topi. Ottimizziamo i metodi di digestione tumore collagenosi-basato per il recupero ottimo delle singole cellule dai tumori stabiliti. I dati presentati qui indicano che i topi sviluppano tumori altamente vascularized che riprodurrsi per metastasi ai linfonodi regionali. Massa di citometria multiparametrica unicellulare dimostra la presenza di diverse popolazioni immunitarie con cellule mieloidi che rappresentano la maggioranza di tutte le cellule immunitarie. Il modello proposto in questo studio ha applicazioni nella biologia del cancro, immunologia dei tumori e sviluppo preclinico di approcci terapeutici. La somiglianza del modello ortotopico alle caratteristiche cliniche della malattia umana fornirà uno strumento per la traduzione avanzata e migliorare i risultati pazienti.

La valutazione in vitro di proliferazione delle cellule LY2 e B4B8 hanno dimostrato che entrambe le linee cellulari hanno simili tempi di raddoppiamento (21 e 23 h, rispettivamente). In vivo, entrambe le linee cellulari formano una massa unica, visibile e palpabile entro 1 settimana dall'inoculazione (Figura 1A). In topi che sopportano i tumori LY2, la mascella è stata spostata da 3 settimane a causa del carico del tumore (Figura 1A</str...

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Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment

Qui presentiamo un metodo riproducibile per lo sviluppo di un modello murino ortotopico di carcinoma di cellule squamous testa e del collo. I tumori dimostrano clinicamente rilevanti caratteristiche istopatologiche della malattia, compreso necrosi, differenziazione difficile, le metastasi nodali e infiltrazione immune. Topi del tumore-cuscinetto sviluppano sintomi clinicamente rilevanti tra cui disfagia, spostamento mascella e la perdita di peso.

Intramucosa inoculazione delle cellule di Carcinoma di cellule Squamous nei topi per profilatura Immune tumore e valutazione della risposta di trattamento

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop ...

I tumori della regione della testa e del collo stanno diventando sempre più diffusi. Tuttavia, c'è una comprensione limitata del microambiente tumorale e dei meccanismi di resistenza al trattamento in questa regione. Questa tecnica può essere utilizzata per ricapitolare il microambiente nativo dei tumori testa/collo in modo accessibile e produce manifestazioni cliniche simili a quelle osservate nell'uomo.Quando la coltura delle cellule tumorali ha raggiunto il 70% di confluenza, lavare le cellule tre volte con PBS freddo per lavaggio e attaccare le cellule con abbastanza 0,25% di tripside per coprire la superficie inferiore del pallone di coltura. Dopo tre o quattro minuti nell'incubatore di coltura cellulare, confermare il distacco al microscopio leggero e neutralizzare la tripina con 12 millilitri di mezzo DMEM F12, integrato con siero bovino fetale. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 50 millilitri e mescolare le cellule da tre a quattro volte per inversione.Quindi raccogliere le cellule per centrifugazione e sospendere di nuovo il pellet nel siero e dmem privo di antibiotici a una volta 10 alla sesta cellule tumorali per 50 microlitri di media concentrazione sul ghiaccio. Immediatamente prima dell'iniezione, mescolare le cellule a una o una sospensione delle cellule tumorali al rapporto della matrice della membrana basale sul ghiaccio. Caricare una siringa da 0,5 millilitri dotata di un ago calibro 23 con 100 microlitri di cellule per animale ricevente.Posizionare le siringhe sul ghiaccio e confermare una mancanza di risposta al dito del dito in un topo anestetizzato. Successivamente, inserire l'ago nella regione buccale destra o sinistra attraverso lo spazio aperto disponibile su entrambi i lati della bocca mantenendo la siringa parallela alla regione del buccale mentre si trova all'interno della cavità orale per facilitare l'iniezione dell'intero volume di 100 microliter della sospensione della matrice della membrana basale cellulare per un periodo di cinque secondi. Mantenere la siringa in posizione per altri cinque secondi per assicurarsi che tutto il materiale sia stato iniettato prima di ritirare delicatamente la siringa.I tumori diventeranno grossolanamente visibili tra circa una settimana. Una settimana dopo l'iniezione, utilizzare le pinze per misurare la lunghezza e la larghezza di ogni tumore per determinare il volume tumorale da una a due volte a settimana. E misurare il peso di ogni animale per valutare gli effetti della crescita tumorale sull'alimentazione.All'endpoint sperimentale appropriato, utilizzare forbici affilate e forcep smussate per fare un'incisione cutanea attraverso la linea mediana nel collo. E inserire delicatamente le forbici sotto la pelle che coprono il tumore per creare sacche d'aria spingendo le forbici attraverso e nella pelle. Una volta che la pelle è sufficientemente staccata dal tumore, asportare i linfonodi drenante per evitare che il tessuto tumorale sia confuso dalla presenza di tessuto linfatico e tagliare i bordi del tumore fino a quando l'intero volume non viene staccato.Per elaborare il tumore per l'analisi a valle, tagliare il tumore in pezzi di dimensioni da uno a due millimetri e posizionare i pezzi in un tubo conico da 50 millilitri contenente collagenasi tre, DNA uno e inibitore della tripparina. Dopo aver incubato i pezzi tumorali a 37 gradi Celsius per 30 minuti, con scuotimento ogni 10 minuti, aggiungere 20 millilitri di HBSS al tubo e passare la sospensione contenente i pezzi tumorali attraverso un colino di nylon pour da 70 micrometri. Utilizzare uno stantuffo per siringhe da cinque millilitri per schiacciare i pezzi tumorali nel colino e aggiungere altri 10 millilitri di HBSS attraverso il colino.Spingi giù le cellule per centrifugazione. Sospendere il pellet in due o tre millilitri di tampone dilisi dei globuli rossi con pipettazione rigorosa, neutralizzando lalisi con 20 millilitri di HBSS fresco dopo due minuti a temperatura ambiente. Quindi sospendere di nuovo le cellule in altri 20 millilitri di HBSS per un'altra centrifugazione e filtrare le cellule attraverso un filtro di versamento di 40 micrometri per rimuovere eventuali detriti finali dalla sospensione della cellula tumorale.I tumori LY2 crescono ad un tasso più elevato, rispetto ai tumori B4B8. E i topi che mostrano uno spostamento della mascella sviluppano rapidamente la perdita di peso, a causa della disfagia. La sopravvivenza mediana nei topi LY2 è anche meno della metà di quella osservata per i topi che portano tumore B4B8.La risonanza magnetica dei topi portanti di tumore mostra tumori ben delimitati che si estendono nello strato interno della mucosa buccale, ma non nella lingua o in altri organi vicini. L'esame istologico indica che tutti i topi portanti di tumore LY2 sviluppano carcinoma a cellule squamose scarsamente differenziato, mentre i topi che portano tumori B4B8 sviluppano carcinoma a cellule squamose moderatamente differenziato. Tutti i topi portanti di tumore LY2 hanno anche necrosi istologicamente confermata, con la maggior parte che dimostra necrosi da moderata a grave.In questo esperimento rappresentativo, un tumore LY2 è stato raccolto e lavorato tre settimane dopo l'iniezione di cellule tumorali della regione buccale, come dimostrato. Le cellule immunitarie positive al CD45 rappresentavano il 7,3% della popolazione totale di cellule tumorali. Le cellule mieloidi positive al CD11b rappresentavano il 37,8% di tutte le cellule positive del CD45, la maggior parte delle quali erano determinate come macrofagi F480-positivi, con piccole popolazioni di neutrofili e cellule soppressori derivate da mieloidi osservate.Le cellule T comprendevano il 15,9% della popolazione di cellule immunitarie positiva al CD45, il 53,4% delle quali erano cellule T regolatorie foxp3 positive cd4. Le cellule killer naturali comprendevano meno del 2% di tutte le cellule positive del CD45. È importante praticare l'iniezione al fine di sviluppare fiducia e comfort nel tenere l'ago e il topo ricevente e nell'esporre la bocca dell'animale.Una volta eseguita con successo la procedura, possono essere eseguiti esperimenti che comportano la valutazione della risposta tumorale alla terapia o la valutazione dei fattori intrinseci e microambientali del tumore. Questa tecnica ha spianato la strada alla progettazione di uno studio clinico avviato da investigatori, valutando gli effetti della combinazione della radioterapia con la terapia anti-PL1 nei pazienti con cancro alla testa e al collo.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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