Denne protokol beskriver brugen af en positioneringsanordning til intranasal levering af biomolekyler til musen CNS. Brugen af denne enhed reducerer håndteringen af mus og behandlingstiden betydeligt, hvilket resulterer i forbedret effektivitet og reproducerbarhed af teknikken. For at begynde denne procedure, vurdere anæstesi niveau af mus ved pedal refleks for at opretholde det kirurgiske plan.
Derefter placeres positionsanordningen i en passende afstand og højde for at give nem adgang til alle nødvendige reagenser. Derefter anvende salve på dyrets øjne. Spænd en mus med stolebælter, og sørg for, at musens forelimbs giver naturlig støtte, mens den er i en afslappet position uden ubehag.
Gentag procedurerne for de resterende mus. Forsigtigt placere hver mus på den udpegede stol ved at lægge ryggen parallelt med ryggen støtte af stolen og ved 90 grader til stolen sæde. Lad dyret ligge naturligt i hovedet ned og fremad position uden at skubbe eller trykke.
Når alle mus er spændt, straks starte intranasal vaccination. For at udføre intranasal levering skal mikropipetten indlæses med to mikroliter RVG9R siRNA kompleks opløsning. Hold pipetten i den dominerende hånd og støt den med den anden hånd for at undgå ukontrollerede bevægelser, mens du administrerer siRNA.
Placer omkring en to mikroliter dråbe meget tæt på et næsebor, så musen direkte kan inhalere det. Hvis en lille dråbe ikke er let at danne, skal pipetten spidsen udskiftes med en ny og gentage operationen. Skub forsigtigt musen ned med pegefingeren i fem sekunder, mens den inhalerer og bevarer positionen.
For at forhindre dræning af narkotika i lungerne er det vigtigt at adsænker skubbe musen hovedet ned med pegefingeren i fem sekunder, mens musen er inhalere. Start et stopur til uret tre til fire minutter efter dette til tid vaccination i den anden nare af den første mus. Dette tidsinterval er nødvendigt for musen til at fuldføre indånding af den første dosis og genoprette normal vejrtrækning.
I intervallet mellem tre til fire minutter mellem inokulering af alternative nares på den første mus skal der udføres intranasal inokulering af en nare i hver af de resterende tre mus, der er placeret på enheden. Når stopuret lyder, skal du vaccinere det andet næsebor på den første mus og gentage proceduren for de andre mus som ovenfor. Gentag proceduren, indtil de 20 til 30 mikroliter leveres til alle fire mus.
Det vil tage omkring 30 til 45 minutter at fuldføre hele vaccinationsproceduren. Tilbagelever dyrene tilbage til deres udpegede bure. Efterlad ikke musene uden opsyn, før de har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde sternal recumbency.
For at vurdere genhæmning skal du udtrække RNA fra forskellige hjerneregioner med et RNA-rensesæt, vende transskriptionen til cDNA ved hjælp af et cDNA-syntesesæt og udføre qPCR med primerpar. De fleste hjerne levering af RVG9R peptid mærket med Alexa Fluor 488 blev først testet ved hjælp af musen positionering enhed beskrevet her. Efter 48 timer efter inokulering blev forskellige organer fjernet for at måle A488 fluorescens.
Intet blev opdaget i nogen af organerne i de negative kontroller. På den anden side, en stærk fluorescerende A488 signal blev opdaget udelukkende i hjernen på RVG9R podet gruppe. Desuden blev museplaceringspositionen sammenlignet med liggende positionsmetode og vågenmetoden for effekt.
Resultaterne viste, at positionering musene hovedet ned og fremad forbedret penerance og aflejring af RVG9R A488 i hele hjernevævet. For yderligere at bekræfte siRNA levering til hjernen, fuld hjernescanning blev udført efter en enkelt intranasal administration af RVG9R kompleks til Cy5 mærket siRNA. I modsætning til PBS eller RVM9R resulterede kompleks med RVG9R i en stærk ophobning af siRNA i større hjerneregioner, herunder olfaktoriske pære, cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, midten af hjernen og lillehjernen.
Positioneringsanordningen kan bruges til levering af lægemidler eller molekyler til musen CNS. Ansøgningerne omfatter test af terapeutiske samt undersøge cellulære mekanismer i CNS. Denne positionering enhed er blevet brugt af efterforskerne til at demonstrere styrken af siRNA'er i behandling af West Nile Virus sygdom, samt udforske behandlinger for andre CNS sygdomme.