Dit protocol beschrijft het gebruik van een positioneringsapparaat voor de intranasale levering van biomoleculen aan het CZS van de muis. Het gebruik van dit apparaat vermindert de behandeling van muizen en de tijd van de behandeling aanzienlijk, wat resulteert in verbeterde efficiëntie en reproduceerbaarheid van de techniek. Om deze procedure te beginnen, beoordeel het anesthesieniveau van de muizen met pedaalreflex om het chirurgische vlak te behouden.
Plaats vervolgens het positioneringsapparaat op een gepaste afstand en hoogte om gemakkelijke toegang tot alle vereiste reagentia mogelijk te maken. Breng vervolgens zalf aan op de ogen van het dier. Bind een muis met stoelriemen, zorg ervoor dat de voorpoten van de muis natuurlijke ondersteuning bieden terwijl deze zich in een ontspannen positie bevindt zonder enig ongemak.
Herhaal de procedures voor de resterende muizen. Plaats elke muis voorzichtig op de aangewezen stoel door zijn rug parallel aan de rugsteun van de stoel en bij 90 graden aan de stoelzetel te leggen. Laat het dier op natuurlijke wijze in het hoofd naar beneden en naar voren liggen zonder te duwen of te drukken.
Zodra alle muizen zijn vastgebonden, onmiddellijk beginnen met de intranasale inenting. Om intranasale levering uit te voeren, laadt u de micropipet met twee microliters van RVG9R siRNA complexe oplossing. Houd de pipet in de dominante hand en steun deze met de andere hand om ongecontroleerde bewegingen te voorkomen tijdens het toedienen van siRNA.
Plaats ongeveer een twee microliter druppel heel dicht bij een neusgat, zodat de muis direct kan inademen. Als een kleine druppel niet gemakkelijk wordt gevormd, vervang de pipetpunt door een nieuwe en herhaal de bewerking. Duw de muiskop voorzichtig vijf seconden met wijsvinger naar beneden terwijl deze inademt en de positie behoudt.
Om drainage van het geneesmiddel in de longen te voorkomen is het belangrijk om de muiskop vijf seconden verdoofd naar beneden te duwen met de wijsvinger terwijl de muis inademt. Start een stopwatch om drie tot vier minuten na dit te klokken om inenting in de tweede nare van de eerste muis te timen. Dit tijdsinterval is noodzakelijk voor de muis om de inademing van de eerste dosis te voltooien en de normale ademhaling te herstellen.
In het interval van drie tot vier minuten tussen inenting van alternatieve nares op de eerste muis, volledige intranasale inenting van één nare in elk van de resterende drie muizen die op het apparaat worden geplaatst. Wanneer de stopwatch klinkt, inenticuleren het tweede neusgat op de eerste muis en herhaal de procedure voor de andere muizen zoals hierboven. Herhaal de procedure totdat de 20 tot 30 microliter wordt geleverd voor alle vier de muizen.
Het duurt ongeveer 30 tot 45 minuten om de volledige inentingsprocedure te voltooien. Breng de dieren terug naar hun aangewezen kooien. Laat de muizen niet onbeheerd achter totdat ze voldoende bewustzijn hebben herwonnen om de strenge recumbency te behouden.
Om gen-uitschakeling te beoordelen, extract RNA uit verschillende hersengebieden met een RNA-zuiveringskit, reverse transcriptie in cDNA met behulp van een cDNA synthese kit, en het uitvoeren van qPCR met primer paren. De meeste hersenlevering van het RVG9R peptide gelabeld met Alexa Fluor 488 werd voor het eerst getest met behulp van de muis positionering apparaat hier beschreven. Na 48 uur na de inenting werden verschillende organen verwijderd om A488 fluorescentie te meten.
Niets werd ontdekt in een van de organen in de negatieve controles. Aan de andere kant werd een sterk fluorescerend A488-signaal uitsluitend gedetecteerd in de hersenen van de RVG9R ingeënte groep. Bovendien werd de muisplaatsingspositie vergeleken met de supine-positiemethode en de wakkere methode voor werkzaamheid.
De resultaten gaven aan dat het positioneren van de muizen hoofd naar beneden en naar voren verbeterde de penetrantie en afzetting van RVG9R A488 in het hele hersenweefsel. Om de levering van siRNA aan de hersenen verder te bevestigen, werd het volledige hersenen aftasten uitgevoerd na één enkele intranasale toediening van RVG9R die aan Cy5 wordt gelabeld siRNA. In tegenstelling tot PBS of RVM9R resulteerde de complexiteit met RVG9R in een sterke accumulatie van siRNA in grote hersengebieden, waaronder de olfactorische bol, de cortex, de hippocampus, de thalamus, de hypothalamus, het midden van de hersenen en het cerebellum.
Het positioneringsapparaat kan worden gebruikt voor de levering van geneesmiddelen of moleculen aan het CZS van de muis. De toepassingen breiden zich uit tot het testen van therapeutica en het onderzoeken van cellulaire mechanismen in het CNS. Deze positionering apparaat is gebruikt door de onderzoekers voor het aantonen van de potentie van siRNAs bij de behandeling van West Nile Virus ziekte, evenals het verkennen van therapieën voor andere CNS-ziekten.
