Ce protocole détaille l’utilisation d’un dispositif de positionnement pour la livraison intranasale de biomolécules à la souris CNS. L’utilisation de cet appareil réduit considérablement la manipulation des souris et le temps de traitement, ce qui améliore l’efficacité et la reproductibilité de la technique. Pour commencer cette procédure, évaluer le niveau d’anesthésie des souris par réflexe de pédale afin de maintenir le plan chirurgical.
Ensuite, placez le dispositif de positionnement à une distance et une hauteur appropriées pour permettre un accès pratique à tous les reagents requis. Ensuite, appliquez de l’onguent sur les yeux de l’animal. Attachez une souris avec des ceintures de chaise, en vous assurant que les membres antérieurs de la souris fournissent un soutien naturel alors qu’il est dans une position détendue sans aucun inconfort.
Répétez les procédures pour les souris restantes. Placez doucement chaque souris sur la chaise désignée en posant son dos parallèlement au support arrière de la chaise et à 90 degrés au siège de la chaise. Laissez l’animal se trouver naturellement dans la position de la tête vers le bas et vers l’avant sans pousser ou appuyer.
Une fois que toutes les souris sont attachées, commencez immédiatement l’inoculation intranasale. Pour effectuer la livraison intranasale, chargez la micropipette avec deux microlitres de solution complexe de siRNA RVG9R. Tenez la pipette dans la main dominante et soutenez-la d’autre part pour éviter les mouvements incontrôlés tout en administrant le siRNA.
Placez environ une gouttelette de deux microlitres très près d’une narine afin que la souris puisse l’inhaler directement. Si une petite goutte n’est pas facilement formée, remplacez la pointe pipette par une nouvelle et répétez l’opération. Poussez doucement la tête de la souris vers le bas avec l’index pendant cinq secondes pendant qu’elle inspire et maintenez la position.
Pour empêcher le drainage de la drogue dans les poumons, il est important de pousser la tête de la souris vers le bas avec l’index pendant cinq secondes pendant que la souris inspire. Démarrez un chronomètre pour horloge trois à quatre minutes après cela à l’inoculation du temps dans le deuxième nare de la première souris. Cet intervalle de temps est nécessaire pour que la souris complète l’inhalation de la première dose et restaure la respiration normale.
Dans l’intervalle de trois à quatre minutes entre l’inoculation des nares alternatifs sur la première souris, l’inoculation intranasale complète d’un nare dans chacune des trois souris restantes placées sur l’appareil. Lorsque le chronomètre retentit, inoculer la deuxième narine sur la première souris et répéter la procédure pour les autres souris comme ci-dessus. Répétez la procédure jusqu’à ce que les 20 à 30 microlitres soient livrés pour les quatre souris.
Il faudra environ 30 à 45 minutes pour compléter l’ensemble de la procédure d’inoculation. Retournez les animaux dans leurs cages désignées. Ne laissez pas les souris sans surveillance jusqu’à ce qu’elles aient repris suffisamment conscience pour maintenir la récumbence sternale.
Pour évaluer le silencing des gènes, extraire l’ARN de diverses régions du cerveau avec un kit de purification de l’ARN, inverser la transcription en CDNA à l’aide d’un kit de synthèse cDNA, et effectuer qPCR avec des paires d’amorce. La plupart des livraisons cérébrales du peptide RVG9R étiqueté avec Alexa Fluor 488 ont d’abord été testées à l’aide du dispositif de positionnement de la souris décrit ici. À 48 heures après l’inoculation, divers organes ont été excisés pour mesurer la fluorescence de l’A488.
Rien n’a été détecté dans aucun des organes dans les contrôles négatifs. D’autre part, un signal fluorescent fort D’A488 a été détecté exclusivement dans les cerveaux du groupe inoculé de RVG9R. En outre, la position de placement de souris a été comparée à la méthode de position de supine et à la méthode éveillée pour l’efficacité.
Les résultats ont indiqué que le positionnement de la tête et de l’avant des souris a amélioré la pénétration et le dépôt du RVG9R A488 dans tout le tissu cérébral. Pour confirmer davantage la livraison de siRNA au cerveau, le balayage complet de cerveau a été exécuté après une administration intranasal simple de RVG9R complexée au siRNA étiqueté de Cy5. Contrairement à PBS ou RVM9R, le complexage avec RVG9R a eu comme conséquence une forte accumulation de siRNA dans les régions principales de cerveau comprenant le bulbe olfactif, le cortex, l’hippocampe, le thalamus, l’hypothalamus, le milieu du cerveau, et le cervelet.
Le dispositif de positionnement peut être utilisé pour la livraison de médicaments ou de molécules à la souris CNS. Les applications s’étendent à l’essai des thérapeutiques aussi bien qu’à l’examen des mécanismes cellulaires dans le CNS. Ce dispositif de positionnement a été utilisé par les chercheurs pour démontrer la puissance des siARN dans le traitement de la maladie du virus du Nil occidental, ainsi que pour explorer des thérapies pour d’autres maladies du SNC.
